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Immunology and Infection

Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

Published: January 5, 2016 doi: 10.3791/53495
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 3,4, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Department of Medicine, Emory University School of Medicine, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine, 4Yerkes National Primate Research Center

Abstract

Os exossomas são pequenas vesículas que variam em tamanho de 30 nm a 100 nm, que são libertadas tanto constitutivamente e por estimulação de uma variedade de tipos de células. Eles são encontrados em vários fluidos biológicos, e são conhecidos para transportar uma variedade de proteínas, lípidos, e moléculas de ácido nucleico. Originalmente pensou-se pouco mais do que os reservatórios de detritos celulares, os papéis de exossomas regulam processos biológicos e em doenças são cada vez mais apreciados.

Vários métodos foram descritos para o isolamento de exossomas a partir de meios de cultura celular e fluidos biológicos. Devido ao seu pequeno tamanho e baixa densidade, ultracentrifugação diferencial e / ou de ultraf iltração são as técnicas mais vulgarmente utilizadas para isolamento de exossoma. No entanto, plasma de HIV-1 contém ambos os indivíduos infectados exossomas e partículas virais de HIV, que são semelhantes em tamanho e densidade. Assim, a separação eficiente de exossomas a partir de partículas virais de HIV no plasma humano tem sidoum desafio.

Para resolver esta limitação, foi desenvolvido um procedimento modificado a partir do Cantin et. ai., 2008, para a purificação de exossomas a partir de partículas de HIV em plasma humano. Iodixanol gradientes de velocidade foram usadas para separar os exossomas a partir de partículas de HIV-1 no plasma de HIV-1 em indivíduos positivos. Partículas de vírus foram identificados por ELISA p24. Os exossomas foram identificados com base nos marcadores de exossoma acetilcolinesterase (AChE), e os antigénios CD9, CD63, CD45 e. Nosso procedimento gradiente renderam preparações exossoma livres de partículas de vírus. A purificação eficiente de exossomas a partir de plasma humano nos permitiu examinar o conteúdo de exossomas derivados do plasma e para investigar o seu potencial imunomodulador e outras funções biológicas.

Introduction

O HIV-1 epidemia continua a ter um impacto significativo em todo o mundo. A partir de 2013, aproximadamente 35 milhões de pessoas no mundo viviam com HIV e 2,1 milhões delas eram indivíduos recém-infectadas 1. As estratégias de prevenção e maior acesso à terapia anti-retroviral tem sido útil para reduzir a aquisição global de HIV. No entanto, as populações individuais ainda estão experimentando aumentos na aquisição de HIV 1. Assim, há uma necessidade de prosseguir os esforços para enfrentar esta epidemia.

Um dos mais fortes preditores de progressão da doença HIV é ativação imune crônica (CIA) 2-10. Definido por níveis persistentemente elevados de citocinas e marcadores detectáveis ​​de expressão elevados sobre a superfície dos linfócitos T, a CIA tem sido atribuída a: i) a produção contínua de células dendríticas de IFN tipo I 11; (ii) a ativação imune direto impulsionado por proteínas do HIV Tat, Nef e gp120 12; (iii) Translocação de proteínas bacterianas no intestino associada células imunes 6. No entanto, o mecanismo exato (s) crónica subjacente, ativação imune sistêmica na infecção pelo HIV continuam a ser totalmente elucidado.

Nosso grupo de pesquisa e outros têm demonstrado um papel de exossomos na patogênese do HIV 15-18. Nosso grupo determinou que a proteína Nef é excretada a partir de células infectadas em exossomos 15, e exosomal Nef (exNef) está presente no plasma de indivíduos infectados pelo HIV em níveis de nanogramas 18. Mostrámos que espectador células T CD4 + expostas a exNef resultou em induzida por activação das células da morte dependente da via CXCR4 19, 20. Alternativamente, monócitos / macrófagos eram refractários à apoptose induzida por exNef, mas exibiu as funções celulares alteradas e expressão de citoquinas. Exossomas Mais recentemente, o nosso grupo demonstrou isoladas a partir do plasma de indivíduos infectados com HIV contêm uma variedade de citoquinas pró-inflamatórias. Further, células mononucleares de sangue periférico naive expostos a exossomas derivados de plasma de doentes infectados com VIH induzidas expressão de CD38 em células de memória central e ingénuos CD4 + e CD8 +. Isso provavelmente contribui para a inflamação sistémica e propagação virai através da activação de células espectador 21, e sugere que exossomas desempenhar um papel significativo na patogénese do VIH.

Ao investigar o papel de exossomos na patogênese do HIV, um desafio é o desenvolvimento de técnicas para exossomos eficientemente separados de partículas de HIV, mantendo o conteúdo exosomal, bem como a sua capacidade imunomoduladora funcional. Vários métodos foram descritos para o isolamento de exossomas a partir de cultura de células e fluidos biológicos 22,23. Devido ao seu pequeno tamanho e baixa densidade (exossomas flutuar a uma densidade de 1,15 - 1,19 g / ml), ultracentrifugação e / ou ultrafiltração diferencial são as técnicas mais vulgarmente utilizadas para isolamento 23 exossoma.No entanto, os sobrenadantes de cultura de células infectadas pelo HIV e no plasma dos pacientes conter ambos os exossomas e HIV-1 As partículas virais. Os exossomas e partículas de HIV-1 são muito semelhantes em tamanho e densidade. Alternativamente, tomando vantagem da expressão de marcadores exosomal únicas, tais como CD63, CD45, CD81 e, os exossomas foram isolados utilizando métodos de captura 23 de imunoafinidade. Este procedimento pode separar vírus de exossomos. No entanto, a desvantagem desta técnica é a ligação apertada de anticorpos para os exossomas purificadas, o que poderia interferir com a avaliação do potencial imunomodulador dos exossomas em cultura.

Para lidar com essas limitações, nós desenvolvemos um processo para a purificação de exossomos de partículas de HIV no plasma humano modificados a partir Cantin e colegas de trabalho, utilizando 22 IODIXANOL gradientes de velocidade. Exossomos foram encontrados para segregar na baixa densidade / frações superiores da gradientes iodixanol, enquanto que partículas virais segregadas no altoDensidade / fracções inferiores. Partículas do vírus foram identificados por ELISA p24 e exossomos foram identificados utilizando marcadores do exossomo Ache, CD9, CD63 e CD45. As frações de baixa densidade superior recolhidos contida exossomos, que eram negativas para a contaminação pelo HIV-1 p24. A purificação eficiente e separação de exossomas a partir de partículas de HIV em plasma humano permite a análise precisa do conteúdo de exossomas provenientes de plasma humano, bem como a investigação do seu potencial imunomodulador e o valor diagnóstico e prognóstico de exossomas no VIH-1 patogénese.

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Protocol

Um diagrama geral do procedimento de isolamento exosome e purificação é fornecido na Figura 1. O sangue total foi obtido de doadores voluntários saudáveis ​​e de indivíduos HIV-positivos que não recebem theraoy antiretroviral participar da Clínica Esperança da Universidade Emory e do Programa de Doenças Infecciosas do Sistema Único de Saúde Grady em Atlanta, Georgia. Este estudo foi aprovado pelos conselhos de revisão institucionais da Universidade Emory e Morehouse School of Medicine. Todas as pessoas que participaram do estudo deram consentimento informado escrito e.

1. Preparação de exossomas a partir de plasma sanguíneo

  1. Colheita de sangue humano e Processamento
    1. Colete 10 ml de sangue periférico por punção venosa em tubos de coleta de sangue EDTA (contendo 18 mg de potássio EDTA), e inverter cuidadosamente cinco vezes para misturar.
    2. Centrifugar os tubos de colheita de sangue a 1000 xg durante 20 min à temperatura ambiente para sedimentar as células do sangue. Use uma pipeta estérilte para transferir a fracção de plasma (4-5 mL) para um tubo cónico de 25 ml. Dilui-se o plasma com 10 ml de 1 x PBS. Descarte as células do sangue (glóbulos vermelhos e glóbulos brancos, também conhecidos como PBMC) em um recipiente devidamente marcados para resíduos de risco biológico.
      NOTA: No caso de amostras de sangue de doadores não infectados, a PBMC podem ser reservados para uso posterior (ver procedimento IV.2, abaixo).
    3. Armazene as amostras de plasma a 4 ° C para o curto prazo (2-3 dias) ou a -80 ° C para armazenamento de longo prazo.
      NOTA: Traga quaisquer amostras de plasma congeladas a 4 ° C antes do processamento adicional.
  2. Preparação da Fracção de plasma exossomo
    1. Plasma Centrifugar a 10.000 xg durante 30 min a 4 ° C para remover os restos celulares. Usar uma pipeta serológica estéril para transferir o sobrenadante de plasma foi afastada para um tubo de ultracentrífuga 25 ml limpo. Descarte o pellet no recipiente de risco biológico.
    2. Centrifugar o plasma limpou a 100.000 xg durante 2hora a 4 ° C para remover grandes vesículas. Remover o sobrenadante 100.000 xg cuidadosamente por pipetagem, e descartar em resíduos de risco biológico. Ressuspender o sedimento de 100.000 XG em 1 ml de PBS 1X num tubo limpo e incubar à TA durante 30 min, agitando suavemente para desalojar e partículas separadas.
    3. Lava-se a pelete de 100.000 XG exossoma / vírus suspenso pela adição de 25 ml de PBS. Inverter cuidadosamente o tubo de cinco vezes para misturar, depois centrifugar novamente a 100.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. Descartar a solução de lavagem PBS no recipiente de resíduos de risco biológico.
    4. Ressuspender o sedimento de 100.000 XG em 1 ml de 1 x PBS e incubar à TA durante 30 min agitando suavemente para desalojar e dissolver o sedimento.
      NOTA: Se não for possível deslocar-se directamente para o passo de gradiente de iodixanol, armazenar a pelete, contendo exossomas e partículas de vírus, a 4 ° C durante 1-2 dias até o passo do gradiente de iodixanol.

2. Purificação de exossomas

  1. Gerar 6% -18% velocgradientes dade de iodixanol usando um antigo aparelho de gradiente de dupla câmara.
    1. Prepare a 6% e 18% de soluções de reagente iodixanol, fornecido como uma solução 60% em água, por diluição em PBS. Pipetar 5,5 ml de solução a 18% para a câmara de agitação, e pipeta de 5,5 ml de solução a 6% para a câmara de reservatório. Ligar o agitador, abrir a torneira, e permitir a cada gradiente a fluir para um tubo de ultracentrífuga 14 ml.
      NOTA: Ou utilizar imediatamente ou armazenar gradientes preparados o / n a 4 ° C antes de usar.
    2. Camada cuidadosamente 1 ml da solução de exossoma / vírus no topo de cada gradiente de 11 ml. Gradientes de centrifugar a 250.000 xg durante 2 horas a 4 ° C, utilizando um rotor basculante SW40Ti.
    3. Rotular doze (12) 1,5 ml microtubos. Retirar 1,0 mL a partir do topo do gradiente e transferir para um tubo # 1. Transfira os restantes fracções de 1 ml para tubos de 2-12 em ordem seqüencial.
      NOTA: A fração de nível superior será, assim, nº 1, a fracção de fundo, # 12. Stminério de fracções do gradiente, a 4 ° C. Os exossomas purificadas, que deve estar nas fracções 1-3 no topo do gradiente, são estáveis ​​durante 3-4 semanas quando armazenadas a 4 ° C.

3. exossomo Caracterização

  1. A acetilcolinesterase (AChE) ensaio de actividade
    1. Prepare estoque de substrato 100 mM de iodeto de acetiltiocolina por mistura de 28,9 mg em 1 ml de PBS 1X. Loja estoque de substrato a -20 ° C até 1 mês.
    2. Prepare estoque 10 mM de indicador de cor por mistura de 39,6 mg de ácido benzóico e 15 mg de bicarbonato de sódio em 10 ml de PBS 1X. Loja estoque indicador de cor a 4 ° C até duas semanas.
    3. Preparar o reagente de ensaio por mistura de 1X PBS, substrato, e um indicador de cor na proporção de 100: 2: 5 (por exemplo, 10 ml de PBS 1X + 200 ul de substrato de indicador de cor + 500 ul).
    4. Transferir 50 uL de cada tubo 1,5 ml de fracção de gradiente (1-12 marcado, a partir de procedimento III.3) para os poços de uma de 96 poços microtiteplaca r. Prepare poços duplicados para cada amostra de gradiente.
    5. Preparar um conjunto de normas fazendo primeiro um estoque � / ml AChE de 2000, em PBS. Adicione onze (11) 2-diluições em série desta unidade e adicionar 50 ul de cada diluição a um único poço de uma placa de microtitulação, de modo que padrão # 1 = 2000 mU / ml, # 2 = 1,000 mU / ml, # 3 = 500 mU / ml, etc, até que # 12 = 0,98 mU / ml. Os doze padrões AchE ocupará, consequentemente, uma única linha de uma placa de ensaio de 96 poços.
    6. Adicionar 200 uL de mistura de reagente de ensaio a cada cavidade e incubar 20 min (no escuro) à temperatura ambiente para permitir o desenvolvimento do produto de reacção colorido. Medir a actividade da AChE em um comprimento de onda de 450 nm utilizando um leitor de microplacas fluorescente.
      NOTA: A percentagem de material remanescente depois da purificação exossoma de partida é avaliada pelo ensaio de AChE do plasma não fraccionada.
  2. A análise de imunotransferência
    1. Proteínas separadas em fracções de gradiente de 1-12 (de Procedure 2.1.3) por SDS-PAGE 4-20% de Tris-HCl géis pré-fabricados em 100V x 1 h. Proteínas de transferência em que o gel para uma membrana de nitrocelulose usando uma célula de transferência de electro-blotting de acordo com as instruções do fabricante. Permitir que as transferências para apagar de 12-16 horas (O / N) em 350V.
    2. Remover a membrana do aparelho de blotting e lavar em Tris-salino tamponado (TBS) durante 5 min. Bloco com 5% de leite desnatado em TTBS (TBS com Tween 20 a 0,1%) durante 1 hora, agitando à temperatura ambiente.
    3. Incubar a membrana com anticorpos primários específicos para exossomas (CD9, CD45, CD63) ou o HIV-1 da proteína da cápside (p24) em 5% de leite desnatado com agitação a 4 ° C durante 12-16 hr (S / N). As diluições de anticorpos primários para imunoblots variar de 1: 2,000 1: 5,000.
    4. Lava-se a mancha em TTBS durante 20 min, seguido por incubação com uma diluição de 1: peroxidase de rábano (HRP) conjugado a 2000 para anti-IgG (anticorpo secundário), em 5% de leite desnatado durante 1 hora à TA. Lave a mancha 3 vezes com TTBS, 10 min por lavagem.
    5. Salve as imagens como arquivos TIFF que podem ser visualizados no Adobe Photoshop. Realizar análise de densitometria das bandas que usam software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
  3. Citocina Assay
    1. Antes do ensaio de citocinas, interromper complexos imunes que estão normalmente presentes no plasma humano por dissociação de ácido e lisar os exossomas por tratamento com detergente. Ensaio de ambas as amostras de plasma de partida e as preparações purificadas de exossoma.
      1. A 100 ul de plasma humano adicionar 100 ul 0,33 N de HCl e incubar a 37 ° C durante 1 h. Adicionam-se 100 ul de NaOH 0,33 N para neutralizar o plasma tratado com ácido. Adicionar Triton X-100 para ambas as amostras de plasma a neutralizado e purificado de exossoma, a um ficoncentração final de 1%, para provocar a lise de exossomas.
    2. Para este ensaio (um procedimento à base de grânulo fluorescente), utilizam esferas magnéticas pré-revestidas com anticorpos pelo fabricante. Use um painel de design personalizado de contas revestidas de anticorpo de citocinas anti-humanos; listadas na Tabela 1. Vortex as esferas magnéticas revestidas com anticorpo a partir do kit de ensaio de citocina durante 30 seg e adicionar 50 ul de esferas de cada poço de uma placa de 96 poços para ser usado no ensaio.
    3. Prepara-se uma série de diluições de padrões em tampão padrão de plasma (ambos contidos no kit de ensaio de citocina) como descrito no manual de instruções do kit de ensaio de citocina, para gerar uma curva padrão de 8 pontos.
    4. Adicionar 150 ul de tampão de lavagem 1 X (a partir Kit) para cada poço e lavar as contas, usando uma máquina de lavar esférulas magnéticas, conforme descrito no manual. Adicionar 25 ul de tampão de ensaio de plasma (a partir de estojo) a cada poço. Adicionar 25 ul de padrões e as amostras a todos os poços utilizados no ensaio. Adicionar 25 uL de plasmatampão de amostra para os poços de controlo negativo. Selar e agitar a placa a 700 rpm durante 60 min à temperatura ambiente e incubar O / N a 4 ° C.
    5. Adicionar 150 ul de tampão de lavagem 1X a cada poço e lavar a placa (como no passo 3.3.4, supra). Adicionar 25 ul de anticorpos de detecção em cada poço, vedação e agitar a placa a 700 rpm durante 30 min à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem.
    6. Adicionar 50 ul de solução de estreptavidina (SAPE, do kit) para cada poço, vedação e agitar a placa a 700 rpm durante 30 min à temperatura ambiente. Lavagens placa de repetição como em 3.3.4.
    7. Adicionar 120 ul de tampão de leitura (no Kit) para cada poço e agitar sobre uma mesa de laboratório agitador a 700 rpm durante 5 min à temperatura ambiente para permitir que o sinal fluorescente para se desenvolver. Ler a placa no leitor de placas de acordo com as instruções do fabricante.
    8. A fim de ter em conta a quantidade de exossomos perdidos durante o processo de isolamento, use a seguinte equação: [(/ volume original plasma leitura) x 66,6 = leitura citocina ajustado].

4. Ensaio para potencial imunomodulatório

  1. Preparação de Meio de Cultura com exossomo-empobrecido Soro Fetal Bovino
    1. Centrifugar 500 ml de soro fetal de bovino (FBS) a 100.000 xg durante 20 horas a 4 ° C para sedimentar os contaminantes exossomas e microvesículas. Remova cuidadosamente e guarde o líquido sobrenadante isento de FBS exosome. Descarte o pellet no resíduos de risco biológico.
    2. Combinar 20% de FBS o líquido sobrenadante isento de exossoma com 500 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 1640) médio. Filtra-se o meio através de um filtro de membrana de 0,45 um.
    3. Adicionar estreptomicina (100 U / ml), penicilina (100 U / ml), L-glutamina (2 mM), solução salina tamponada com HEPES (10 mM), e IL-2 (20 U / ml) ao meio filtrado.
  2. Cultura de Células e exossomo Exposição
    1. Expor exossomas ao doador células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de voluntários clínicos obtidos saudáveis. Suspender em PBMCpreparado meio de cultura e contar as células utilizando um contador de células / partícula (de acordo com o método padrão do fabricante).
      NOTA: As PBMC são obtidos durante a preparação de plasma descrito acima (Passo 1.2).
    2. Usando o meio preparados a partir de procedimento 4.1.3, co-cultura de 3,0 x 10 6 (PBMC) com 1 ug / ml de exossomas obtidos a partir de três (3) do HIV-1 seropositivos ou de três (3) HIV-1 seronegativos indivíduos em um total volume de 1 ml em poços de uma placa de cultura de 12 poços (com tampa). Incubar as culturas durante 48 horas a 37 ° C.
    3. Prepare culturas não tratadas e culturas de PBMC tratadas com Concanavalina A (Con A; 5 ug / ml) para servir como controlos negativos e positivos, respectivamente, como descrito acima (4.2.2). Incubar todas as culturas de PBMC durante 48 horas a 37 ° C.
    4. Imediatamente antes da colheita das células, preparar as seguintes diluições de anticorpos monoclonais conjugados de fluorocromo-: Alexa Fluor 700 anticorpo anti-CD3 (1: 400 de diluição), allophycocyanin (APC) / cianina 7 (Cy7) marcado com anti-CD4 (1: 400), proteína peridinina clorofila anti-CD4 (1: 400) marcado com complexo, anti-CD8 marcados com V450 (1: 400), biotina anticorpo anti-CD45RA (1: 1000), ficoeritrina (PE) / Cy7-anticorpos marcados anti-CD62L (1: 1000), PE / cianina 5 (Cy5) marcado com anti-CD38 (1: 200), o PE-Texas Red- anticorpo anti-estreptavidina (1: 2000), e PE / marcado com Cy5 rato de controlo de isotipo IgG1K (1: 200).
    5. Após o período de incubação de 48 horas, recolher o PBMC. Lavar as PBMC em PBS para remover os exossomas e corar as células por incubação durante 1 hora a 4 ° C com anticorpos marcado com fluorocromo individuais. Analisar o PBMC coradas por citometria de fluxo para quantificar a expressão de quimiocinas (como descrito 21).

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Representative Results

Os exossomas são eficientemente purificado a partir do HIV-1 no plasma humano positivo. Exossomas isoladas identificadas pela acetilcolinesterase (AChE), segregados em fracções de baixa densidade de 1-3, na parte superior dos gradientes de iodixanol, enquanto que as partículas de vírus, identificados por VIH-1 do antigénio p24 , segregados nas fracções de maior densidade (10-12, perto do fundo). A presença de exossomas foi ainda confirmada através da identificação de marcadores de imunotransferência de exossoma AChE, CD9, CD45, CD63 e, e por microscopia electrónica (Figura 2).

As citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas são associados com e significativamente elevados nos exossomas de HIV-1 em indivíduos seropositivos. Exossomas purificada e plasma não fraccionada a partir de HIV-1 e infectadas pelo VIH-1 indivíduos seronegativos foram analisados ​​por citocinas / quimiocinas 21 por ensaio multiplex. Todos os 21 citocinas / quimioterapiaKines foram detectados em exossomas a partir de isolados de HIV-1 em indivíduos positivos. Além disso, os níveis eram significativamente elevados, em comparação com o plasma e os exossomas a partir de HIV-1 seronegativos controlos (Tabela 1).

Expressão de CD38 foi aumentada sobre a superfície de células expostas a exossomas a partir do HIV-1 em indivíduos seropositivos. PBMC de dadores humanos não infectadas foram expostas durante 48 horas a exossomas agrupados de indivíduos seronegativos HIV-1 seropositivos ou e avaliado para níveis de CD38 marcador de activação sobre CD4 + e T-CD8 + por citometria de fluxo. Observou-se que em 48 horas após a exposição, a expressão de CD38 na superfície de memória naïve central e as células T CD4 + e CD8 + foram significativamente elevados em células T expostas a exossomas a partir do HIV-1 em indivíduos positivos em relação ao tratamento exossoma HIV-negativo e não tratada controlos (Figura 3).


Figura 1. Representação esquemática de isolamento exossoma a partir do HIV-1 no plasma humano positivo. (A) 10 ml de sangue periférico foi coletado de HIV-1 seropositve e soronegativos. (B) Os tubos de recolha de sangue com EDTA foram centrifugadas a 1000 xg durante 20 min à temperatura ambiente. (C) O plasma separado foi transferido para tubos cónicos de 50 ml e diluiu-se com ½ PBS 1x e (D) centrifugado 10.000 x g durante 30 min. (E) O sobrenadante foi transferido para tubos de ultracentrífuga e (F), centrifugado a 10000 xg durante 2 hr. (G, H) O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de exossoma re-suspenso e lavado em 1 ml de PBS 1X. (I) A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e o sedimento ressuspenso em 1 ml de PBS 1x e sobrepostos em 6-18% gradiente de velocidade de iodixanol e (J) centrifugado a 250.000 xg durante 2 hr. (K) A seguir à centrifugação, fracções de 1 ml, de cima para baixo do gradiente foram transferred para tubos de 1,5 ml e analisadas quanto ao teor de AChE e análise de imunotransferência. (L) As fracções 2 e 3 foram então combinadas e diluiu-se com 4 ml de PBS 1X e (M), centrifugado a 400.000 xg durante 2 hr. (N) A seguir à centrifugação, o sobrenadante foi rejeitado e o sedimento ressuspenso em 1 ml de PBS 1X para análise de citocina pró-inflamatória e expressão de quimiocinas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Os exossomas são eficientemente purificado a partir de plasma humano. Iodixanol Pessoa fracções de gradiente de velocidade a partir de indivíduos seropositivos de HIV-ou seronegativos foram sujeitos a (A) ensaio enzimático para a acetilcolinesterase (AChE), e (B) análise por transferência de Western para marcadores exosomal CD9, CD45, e CD63 e p24 viral proteína e foram (C) immunolabeled com anti-CD63 e examinadas por microscopia de electrões para confirmar a preparação de exossomas purificada (C). (Figura de Konadu et al, 2014 21, usado com permissão). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Ensaio para Potencial imunomodulador. PBMC de HIV-1 soronegativos foram exposto a exossomos obtidos a partir de plasma de HIV-1 soropositivos (HIV + Exo) ou soronegativos (HIV- exo) indivíduos, não tratada, ou tratada com 5 mg / ml de Concanavalina A (Con A), como um controlo positivo. Após 48 horas de exposição, Naïve (CD45RA + / CD62L +), Central (TCM; CD45RA- / CD62L +) e Effector (TEM; CD45RA- / CD62L-) De memória CD4 + e As células T CD8 + foram analisadas quanto à expressão de CD38 por citometria de fluxo. Concentração exosome foi normalizada pela proteína total e adicionada a 1 ug / ml. As barras de erro representam a média +/- SEM de seis dadores independentes. Diferença entre os grupos foram testadas para significância estatística pelo teste ANOVA One Way. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figura de Konadu et al, 2014 21, usado com permissão). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1. Análise de exossomos purificadas e plasma inteiro de HIV-1 soropositivos e soronegativos para citocina pró-inflamatória e expressão de quimiocinas. P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figura de Konadu et al, 2014 21, usado com permissão). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Activação imunitária crónica (CIA) e a depleção de células T CD4 + são duas características importantes da infecção por HIV-1. Eles foram estabelecidos como preditores para patogênese, com CIA ser o melhor preditor. No entanto, os mecanismos subjacentes que impulsionam ativação imune crônica sistêmica e declínio de células CD4 + T ainda não foram completamente elucidados. Nós e outros laboratórios têm desenvolvido evidência sólida de que exossomas segregadas a partir de HIV-1 de células infectadas desempenhar um papel em ambas as marcas.

O interesse continuado na composição e função de vesículas extracelulares levou à publicação de vários métodos para o isolamento de exossoma ambos os meios de cultura de células e fluidos biológicos 24-26. No entanto, uma barreira para investigar o papel de exossomas na patogénese do HIV-1 tem sido a separação eficiente de exossomas a partir de partículas de HIV-1, mantendo a capacidade para investigar tanto conteúdo exossoma e actividade funcional. Nós desenvolvemos um protoCOL para purificação de exossomas a partir de partículas de HIV-1 no plasma humano, utilizando gradientes de velocidade iodixanol. Os doadores seropositivos usadas neste estudo não tinham recebido tratamento anti-retroviral e as amostras de plasma usadas para estas experiências contidos de 1500 a 400.000 partículas de vírus / ml com uma média de 206.000 partículas de vírus / ml 21. Assim, demonstra-se que os exossomas no plasma de HIV-1 em indivíduos infectados podem ser eficientemente separados de partículas de vírus HIV-1, mesmo quando o vírus cargas são elevadas. Embora semelhantes em tamanho e densidade, segregados nos exossomas de baixa densidade / fracções superiores dos gradientes de iodixanol, em comparação com as partículas virais, que segregadas em alta densidade / fracções inferiores. Os exossomos preparados pelo método de gradiente de iodixanol são altamente purificada e livre de proteínas contaminantes extracelulares. A pureza da população exossomas isolado foi confirmada utilizando ELISA p24 e análise de transferência de Western de HIV-1 p24 proteína da cápsidebem como a análise ocidental por marcadores exosomal, dor, CD9, CD45 e CD63. O uso destes marcadores é consistente com as diretrizes recentemente publicadas para identificação exosome 27.

Mais fisiologicamente relevante para a activação imunitária, os exossomas purificadas de HIV-1 em indivíduos infectados foram encontrados para conter citocinas / quimiocinas a concentrações significativamente mais elevadas do que os exossomas a partir de HIV-1 seronegativos controlos. Além disso, os exossomas a partir de HIV-1 em indivíduos infectados eram biologicamente activa, exibindo a capacidade de induzir um aumento dos níveis do marcador de activação CD38, na superfície de células de memória central e ingénuos CD4 + e CD8 +. Colectivamente, estes dados sugerem um mecanismo que poderia conduzir a activação imunitária persistente durante a infecção pelo HIV.

Os resultados que foram capazes de obter usando o nosso processo de purificação de exossoma, que combina centrifugação diferencial e separação por gradiente de iodixanol velocidade mostrar o valordo uso de exossomos altamente purificadas para bioensaios fisiológicas e funcionais. O procedimento tem certas armadilhas e limitações. Uma quantidade considerável dos exossomas, muitas vezes a maioria do material de partida tal como calculado por medição da actividade da AChE, são perdidas durante o processo. Além disso, o procedimento é também consome tempo e requer o acesso ao equipamento caro. Finalmente, a geração de gradientes de iodixanol utilizando o aparelho fromer gradiente requer uma prática considerável para assegurar a reprodutibilidade. Um método alternativo para a geração de gradiente pode ser para preparar uma série graduada de soluções de iodixanol, seguida por cuidadosa de estratificação das soluções em tubos de centrifugação e incubação O / N para permitir que os gradientes de formar. No entanto, nós não testei essa alternativa.

O protocolo experimental descrito aqui para o isolamento e separação de exossomas a partir de partículas de HIV-1 no plasma humano é um método eficaz para assegurar a pureza do exosomes. O uso deste método levou a avenidas emocionantes para investigação futura sobre o papel do exossomos na patogênese do HIV-1 e pode igualmente ser usada em inquéritos para outros processos biológicos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)  Becton Dickinson 368589 pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent Cosmo Bio AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent Sigma D1556
14ml ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344060 ultraclear tubes
Gradient Former Model 485 BIO-RAD 165-4120
Acetylthiocholine iodide Sigma 1480
Benzoic Acid Sigma D8130
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Acetyl Cholinesterase Sigma C3389
96-well clear microtiter plate Medical Supply Partners TR5003
SpectraMax 190 microplate reader Molecular Devices 190 Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell BIO-RAD 165-6001
Transblot Gel  BIO-RAD 170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels BIO-RAD 567-1093
Anti-CD45 antibody  Abcam  Ab10558
CD63 Antibody (H-193) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-15363
CD9 Antibody (H-110) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1  ImmunoDX, LLC 1303
Nitrocellulose membrane  BIO-RAD G1472430
Tris Buffered Saline BIO-RAD 170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31460 Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31430 Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotech, Inc. SC-2048
GE LAS-4010 Imager GE Healthcare LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit Affymetrix  N/A Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader BIO-RAD 171-000201
Coulter Z2 Particle Counter Beckman Coulter 383552 Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 BD Bioscience (UCHT1) 300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4 Biolegend (OKT4) 317418
PerCP-labeled anti-CD4 BD Bioscience (RPA-T8) 550631
V450-labeled anti-CD8 BD Bioscience (RPA-T8) 560347
Biotin-labeled anti-CD45RA BD Bioscience (HI100) 555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L Biolegend (DREG-56) 304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38 Biolegend (HIT2) 303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR Biolegend (L243) 307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin BD Bioscience 551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K Biolegend (MOPC-21) 400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK Biolegend (MOPC-173) 400229

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References

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Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos
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Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).

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