Abstract
Exosomer er små vesikler varierer i størrelse fra 30 nm til 100 nm, der frigives både konstitutivt og ved stimulering fra en række celletyper. De findes i en række biologiske væsker og er kendt for at bære en række proteiner, lipider og nucleinsyre-molekyler. Oprindeligt menes at være lidt mere end reservoirer til celleaffald, er roller exosomer regulerer biologiske processer og i sygdomme i stigende grad værdsat.
Der er blevet beskrevet adskillige fremgangsmåder til isolering af exosomer fra cellulære dyrkningsmedier og biologiske væsker. På grund af deres lille størrelse og lav densitet, forskellen ultracentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest almindeligt anvendte teknikker til exosome isolation. Imidlertid plasma fra HIV-1-inficerede individer indeholder både exosomer og HIV virale partikler, som er ens i størrelse og tæthed. Således har en effektiv adskillelse af exosomer fra HIV virale partikler i humant plasma væreten udfordring.
For at løse denne begrænsning, har vi udviklet en procedure, modificeret fra Cantin et. al., 2008 til oprensning af exosomer fra HIV-partikler i humant plasma. Iodixanol hastighedsgradienter blev anvendt til at adskille exosomer fra HIV-1-partikler i plasmaet hos HIV-1-positive individer. Viruspartikler blev identificeret ved p24-ELISA. Blev identificeret exosomer på grundlag af exosom markører acetylcholinesterase (AChE), og CD9, CD63, CD45 og antigener. Vores gradient procedure gav exosom præparater fri for viruspartikler. Den effektive rensning af exosomer fra humant plasma muligt for os at undersøge indholdet af plasma-afledt exosomer og til at undersøge deres immunmodulerende potentiale og andre biologiske funktioner.
Introduction
HIV-1-epidemien fortsat have en betydelig indvirkning i hele verden. Som i 2013 blev omkring 35 millioner mennesker verden over lever med hiv, og 2,1 millioner af disse var nyligt inficerede individer 1. Forebyggelsesstrategier og øget adgang til antiretroviral behandling har været nyttige i at reducere den samlede overtagelse af HIV. Dog er enkelte befolkninger stadig oplever stigninger i købet af HIV 1. Således er der et behov for en fortsat indsats for at løse denne epidemi.
En af de stærkeste prædiktorer for HIV sygdomsprogression er kronisk immunaktivering (CIA) 2-10. Defineret ved vedvarende høje niveauer af detekterbare cytokiner og forhøjede ekspressionsniveauer markører på overfladen af T-lymfocytter, har CIA blevet tilskrevet: i) kontinuerlig dendritisk celle produktion af type I IFN 11; (ii) direkte immunaktivering drevet af HIV-proteiner Tat, Nef og gp120 12; (iii) Translokation af bakterielle proteiner i tarmrelateret immunceller 6. Den nøjagtige mekanisme (r) underliggende kronisk, systemisk immunrespons aktivering i HIV-infektion er dog stadig at blive fuldstændigt belyst.
Vores forskning gruppe og andre har vist en rolle exosomer i hiv patogenese 15-18. Vores gruppe har fastslået, at Nef proteinet udskilles fra inficerede celler i exosomer 15, og exosomal Nef (exNef) er til stede i plasma af HIV-inficerede individer på nanogram niveauer 18. Vi har vist, at bystander CD4 + -T-celler eksponeret for exNef resulterede i aktiverings-induceret celledød afhængig af CXCR4-vejen 19, 20. Alternativt monocyt / makrofager var refraktære over for exNef-induceret apoptose, men udviste ændrede cellulære funktioner og cytokinekspression. Senest har vores gruppe viste exosomer isoleret fra plasma fra HIV-inficerede individer indeholder en række pro-inflammatoriske cytokiner. Further, naive perifere mononukleare celler udsat for plasmaafledte exosomer fra HIV-inficerede patienter inducerede ekspression af CD38 på naive og centrale hukommelse CD4 + og CD8 + T-celler. Dette bidrager sandsynligvis systemisk inflammation og viral propagering via bystander-celleaktivering 21, og foreslår, at exosomer spiller en væsentlig rolle i HIV patogenese.
Ved at undersøge den rolle, exosomer i HIV-patogenese, er en udfordring at udvikle teknikker til effektivt adskilte exosomer fra HIV-partikler, samtidig med at indholdet exosomal samt deres funktionelle immunmodulerende kapacitet. Der er blevet beskrevet adskillige fremgangsmåder til isolering af exosomer fra cellekultur og biologiske væsker 22,23. På grund af deres lille størrelse og lav densitet (exosomer flyde ved en densitet på 1,15 - 1,19 g / ml), differential ultracentrifugering og / eller ultrafiltrering er de mest almindeligt anvendte teknikker til isolering exosome 23.Men HIV-inficeret celle kultursupernatanter og patienternes plasma indeholder både exosomer og HIV-1 viruspartikler. Exosomer og HIV-1-partikler er meget ens i både størrelse og tæthed. Alternativt udnytter ekspressionen af unikke exosomal markører, såsom CD63, CD45, CD81 og, exosomer er blevet isoleret under anvendelse af immunaffinitetskromatografi capture metoder 23. Denne procedure kan separere virus fra exosomer. Imidlertid er ulempen ved denne teknik er den tætte binding af antistoffer til de oprensede exosomer, som kunne interferere med vurderingen af immunmodulerende potentiale exosomer i kultur.
For at løse disse begrænsninger, har vi udviklet en procedure for rensning af exosomer fra HIV-partikler i humant plasma modificerede fra Cantin og kolleger 22 Brug iodixanol hastighedsgradienter. Exosomer blev fundet at adskille i lav-densitet / øvre fraktioner af iodixanol gradienter, mens viruspartikler adskilt i høj-densitet / lavere fraktioner. Viruspartikler blev identificeret ved p24 ELISA og exosomer blev identificeret under anvendelse exosom markører AChE, CD9, CD63, CD45 og. De øvre lav densitet opsamlede fraktioner indeholdt exosomer der var negative for HIV-1 p24 forurening. Den effektive rensning og adskillelse af exosomer fra HIV-partikler i humant plasma muliggør nøjagtig undersøgelse af indholdet af exosomer fra humant plasma samt undersøgelse af deres immunmodulerende potentiale og den diagnostiske og prognostiske værdi exosomer i HIV-1 patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En generel diagram over exosomet isolering og oprensning procedure er fastsat i figur 1. Fuldblod blev opnået fra raske frivillige donorer og fra hiv-positive personer, som ikke modtager antiretroviral theraoy deltage i Hope Klinik for Emory Universitet og Infektionsmedicinsk Program for Grady Health System i Atlanta, Georgia. Denne undersøgelse blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelserne for Emory University og Morehouse School of Medicine. Alle personer, der deltager i undersøgelsen gav skriftligt og informeret samtykke.
1. Fremstilling af Exosomer fra Blood Plasma
- Menneskeblod Indsamling og behandling
- Collect 10 ml perifert blod ved venepunktur i EDTA-blod indsamling rør (indeholdende 18 mg kalium EDTA), og vend forsigtigt fem gange for at blande.
- Centrifuger blodopsamlingsrør ved 1.000 xg i 20 minutter ved stuetemperatur for at pelletere blodlegemer. Brug en sterilte at overføre plasmafraktionen (4-5 ml) til en 25 ml konisk rør. Fortynd plasma med 10 ml 1 x PBS. Kassér blodlegemer (røde blodlegemer og hvide blodlegemer, også kendt som PBMC) i en passende markant beholder til biologisk farligt affald.
BEMÆRK: I tilfælde af ikke-inficerede donor blodprøver kan PBMC reserveres til videre brug (se procedure IV.2, nedenfor). - Opbevar plasmaprøverne ved 4 ° C for kort sigt (2-3 dage) eller ved -80 ° C i længere tids opbevaring.
BEMÆRK: Medbring eventuelle frosne plasmaprøver til 4 ° C før yderligere behandling.
- Fremstilling af exosome fraktion fra plasma
- Centrifuge plasma ved 10.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for at fjerne cellerester. Brug en steril pipette serologisk at overføre blokerede plasma supernatant til et rent 25 ml ultracentrifugerør. Kassér pillen i biologisk farligt beholder.
- Centrifugeres blokerede plasma ved 100.000 xg i 2time ved 4 ° C for at fjerne store vesikler. Fjern 100.000 xg supernatanten omhyggeligt ved pipettering, og kassér i biologisk farligt affald. Resuspender 100.000 x g pellet i 1 ml 1X PBS i et rent rør og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter, hvirvlende forsigtigt for at løsne og separate partikler.
- Vask den suspenderede 100.000 xg exosome / viruspellet ved tilsætning af 25 ml PBS. Vend forsigtigt røret fem gange for at blande, centrifugeres igen ved 100.000 xg i 2 timer ved 4 ° C. Kassér PBS vaskeopløsningen i biologisk farligt affaldsbeholder.
- Resuspender 100.000 x g pellet i 1 ml 1 X PBS og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter hvirvlende forsigtigt for at løsne og pellet opløses.
BEMÆRK: Hvis det ikke er muligt at gå direkte til den iodixanol gradient trin, gemme pillen, der indeholder exosomer og viruspartikler, ved 4 ° C i 1-2 dage indtil iodixanol gradient trin.
2. Oprensning af Exosomer
- Generer 6% -18% velocity gradienter af iodixanol ved hjælp af en dual-kammer gradient tidligere apparat.
- Forbered 6% og 18% opløsninger af iodixanol reagens, leveret som en 60% opløsning i vand, ved fortynding i PBS. Pipetter 5,5 ml af 18% opløsning i den omrørte kammeret, og pipette 5,5 ml af 6% opløsning i reservoirkammeret. Tænd for omrører, åbn stophanen, og give hver gradient til at flyde ind i en 14 ml ultracentrifugerør.
BEMÆRK: Brug enten straks eller opbevar forberedte gradienter O / N ved 4 ° C før brug. - Forsigtigt lag 1 ml exosomet / virusopløsning på toppen af hver 11 ml gradient. Centrifuger gradienter på 250.000 x g i 2 timer ved 4 ° C, under anvendelse af en SW40Ti svingende spand rotor.
- Label tolv (12) 1,5 ml mikrocentrifugerør. Fjern 1,0 ml fra toppen af gradienten og overføres til røret # 1. Overfør de resterende 1 ml fraktioner til rør 2-12 i rækkefølge.
BEMÆRK: øverste fraktion vil således være # 1, den nederste fraktion, # 12. Stmalm de gradientfraktionerne ved 4 ° C. De oprensede exosomer, som bør være i fraktionerne 1-3 i toppen af gradienten, er stabile i 3-4 uger, når de opbevares ved 4 ° C.
- Forbered 6% og 18% opløsninger af iodixanol reagens, leveret som en 60% opløsning i vand, ved fortynding i PBS. Pipetter 5,5 ml af 18% opløsning i den omrørte kammeret, og pipette 5,5 ml af 6% opløsning i reservoirkammeret. Tænd for omrører, åbn stophanen, og give hver gradient til at flyde ind i en 14 ml ultracentrifugerør.
3. exosomet Karakterisering
- Acetylcholinesterase (AChE) Aktivitet Assay
- Forbered 100 mM substrat lager ved at blande acetylthiocholiniodid 28,9 mg i 1 ml 1X PBS. Store substrat lager ved -20 ° C op til 1 måned.
- Forbered 10 mM farveindikator lager ved at blande benzoesyre 39.6mg og natriumhydrogencarbonat 15 mg i 10 ml 1X PBS. Store farveindikator lager ved 4 ° C op til to uger.
- Forbered assayreagens ved at blande 1X PBS, substrat og farveindikator i et forhold på 100: 2: 5 (for eksempel 10 ml 1X PBS + 200 pi substrat farveindikator + 500 pi).
- Transfer 50 pi fra hver 1,5 ml gradientfraktion rør (mærket 1-12, fra proceduren III.3) til brøndene i en 96-brønds microtiteR plade. Forbered dobbelte brønde for hver prøve gradient.
- Forbered et sæt standarder ved først at gøre en 2000 g enhed / ml AChE lager i PBS. Gør elleve (11) 2-fold seriefortyndinger af denne bestand og der tilsættes 50 pi af hver fortynding til en enkelt brønd i en mikrotiterplade, således at standard # 1 = 2.000 g enhed / ml, # 2 = 1.000 g enhed / ml, # 3 = 500 g enhed / ml, etc. indtil # 12 = 0,98 g enhed / ml. De tolv AChE standarder vil således indtage en enkelt række på en 96-brønds assayplade.
- Tilsæt 200 pi assay reagensblanding til hver brønd og inkuberes 20 min (i mørke) ved stuetemperatur for at tillade udvikling af det farvede reaktionsprodukt. Mål AChE aktivitet ved en bølgelængde på 450 nm under anvendelse af et fluorescerende mikropladelæser.
BEMÆRK: Procentdelen af udgangsmateriale tilbage efter exosome rensning vurderes ved AchE assay af ufraktioneret plasma.
- Immunoblotanalyse
- Separate proteiner i gradientfraktioner 1-12 (fra procedure 2.1.3) ved SDS-PAGE på 4-20% Tris-HCI færdigstøbte geler på 100V x 1 time. Overfør proteiner i gelen til en nitrocellulosemembran under anvendelse af en elektro-blotting transfer celle ifølge producentens anvisninger. Lad overførsler til skamplet for 12-16 timer (O / N) ved 350V.
- Fjern membranen fra blotting apparat og vask i Tris-saltvand (TBS) i 5 min. Blok med 5% fedtfri mælk i TTBS (TBS med 0,1% Tween 20) i 1 time ved omrystning ved stuetemperatur.
- Inkuber membranen med primære antistoffer specifikke for exosomer (CD9, CD45, CD63) eller HIV-1 capsidprotein (p24) i 5% fedtfri mælk med omrystning ved 4 ° C i 12-16 timer (O / N). Fortyndinger af primære antistoffer til immunblots området fra 1: 2.000 -1: 5.000.
- Vask blottet i TTBS i 20 minutter, efterfulgt af inkubering med en 1: 2.000 fortynding af peberrodsperoxidase (HRP) til anti-IgG (sekundært antistof), i 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur. Vask blottet 3 gange med TTBS, 10 min per vask.
- Gemme billederne som TIFF-filer, som kan ses i Adobe Photoshop. Udfør densitometrianalyse af bands der bruger ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
- Cytokin Assay
- Forud for cytokin assay, forstyrre immunkomplekser, der normalt er til stede i humant plasma ved sur dissociation og lysere exosomerne efter detergentbehandling. Assay begge starter plasmaprøver og oprensede exosom præparater.
- Til 100 pi humant plasma tilsættes 100 pi 0,33 N HCI og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Tilføj 100 pi 0,33 N NaOH for at neutralisere syre-behandlede plasma. Tilføj Triton X-100 til både den neutraliserede plasma og oprenset exosom prøver, til en final koncentration på 1%, for at forårsage lysis af exosomer.
- Til dette assay (en fluorescerende perle-baseret procedure), brug magnetiske perler præ-coatet med antistoffer af fabrikanten. Brug et specialfremstillet panel af anti-humane antistof cytokin-overtrukne perler; anført i tabel 1. Vortex antistof- coatede magnetiske perler fra cytokin assay kit til 30 sek, og der tilsættes 50 pi perler til hver brønd i en 96-brønds plade, der skal anvendes i assayet.
- Der fremstilles en fortyndingsrække af standarder i plasma standard puffer (begge indeholdt i cytokin assay kit) som beskrevet i brugsanvisningen for cytokin assay kit, til at generere et 8-punkts standardkurve.
- Tilsæt 150 pi 1X vaskebuffer (fra kit) til hver brønd og vask af perlerne ved hjælp af en magnetisk perle vaskemaskine, som beskrevet i manualen. 25 pi plasma assaybuffer (fra kit) til hver brønd. 25 pi af standarder og prøver til alle brønde, der anvendes i assayet. 25 pi af plasmaprøve buffer til negative kontrolbrønde. Seal og ryst pladen ved 700 rpm i 60 minutter ved stuetemperatur og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Tilsæt 150 pi 1X vaskebuffer til hver brønd og vask af pladen (som i trin 3.3.4, ovenfor). 25 pi af detektionsantistoffer i hver brønd, tætning og ryst pladen ved 700 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur. Gentag vasketrinet.
- Der tilsættes 50 pi streptavidin-opløsning (SAPE fra kit) i hver brønd, tætning og ryst pladen ved 700 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur. Gentag plade vasker som i 3.3.4.
- Tilføj 120 pi læsning puffer (fra kit) i hver brønd og rystes et laboratorium bordplade-ryster ved 700 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur for at tillade det fluorescerende signal at udvikle sig. Læs pladen på læseren i henhold til fabrikantens anvisninger.
- For at tage højde for mængden af exosomer tabt under isoleringsproceduren brug bør følgende ligning: [(original læsning / plasmavolumen) x 66,6 = justeret cytokin læsning].
- Forud for cytokin assay, forstyrre immunkomplekser, der normalt er til stede i humant plasma ved sur dissociation og lysere exosomerne efter detergentbehandling. Assay begge starter plasmaprøver og oprensede exosom præparater.
4. Assay for Immunmodulatorisk Potential
- Udarbejdelse af Kultur Mellem med exosom-forarmet kalvefosterserum
- Centrifuge 500 ml kalvefosterserum (FBS) ved 100.000 xg i 20 timer ved 4 ° C for at pelletere kontaminerende exosomer og mikrovesikler. Fjern forsigtigt og gem exosomet-udtømte FBS supernatant. Kassér pillen i biologisk farligt affald.
- Kombiner 20% af exosomet-depleteret FBS supernatant med 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medium. Filtrer mediet gennem et 0,45 um membranfilter.
- Tilføj streptomycin (100 U / ml), penicillin (100 U / ml), L-glutamin (2 mM), HEPES-bufret saltopløsning (10 uM), og IL-2 (20 U / ml) til den filtrerede medium.
- Cell Kultur og exosome Exposure
- Udsætte exosomer til donor perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra sunde frivillige klinik. Suspender PBMC ifremstillet dyrkningsmedium og tælle cellerne under anvendelse af en celle / partikeltæller (ifølge producentens standardmetoden).
BEMÆRK: PBMC opnås under forberedelsen plasma beskrevet ovenfor (trin 1.2). - Brug af tilberedt medium fra proceduren 4.1.3, co-kultur 3,0 x 10 6 (PBMC) med 1 ug / ml poolede exosomer fra tre (3) HIV-1 seropositive eller fra tre (3) HIV-1 seronegative individer i alt volumen på 1 ml i brøndene på en 12-brønds dyrkningsplade (med låg). Inkuber kulturer i 48 timer ved 37 ° C.
- Forbered ubehandlede PBMC kulturer og kulturer behandlet med Concanavalin A (Con A; 5 ug / ml) for at tjene som negative og positive kontroller, henholdsvis som beskrevet ovenfor (4.2.2). Inkuber alle PBMC kulturer i 48 timer ved 37 ° C.
- Umiddelbart før høst af cellerne, forberede fortyndinger af følgende fluorokromkonjugerede monoklonale antistoffer: Alexa Fluor 700-mærket anti-CD3 (1: 400 fortynding), allophycocyAnin (APC) / cyanin 7 (Cy7) -mærket anti-CD4 (1: 400), peridinin klorofyl proteinkompleks-mærket anti-CD4 (1: 400), V450-mærket anti-CD8 (1: 400), biotin mærket anti-CD45RA (1: 1000), phycoerythrin (PE) / Cy7-mærket anti-CD62L (1: 1000), PE / cyanin 5 (Cy5) -mærket anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- mærket anti-streptavidin (1: 2.000) og PE / Cy5-mærket muse IgG1K isotypekontrol (1: 200).
- Efter 48 timers inkubationstid, høste PBMC. Vask PBMC i PBS til fjernelse af exosomer og plette cellerne ved inkubering i 1 time ved 4 ° C med individuelle fluorochrom-mærkede antistoffer. Analysere farvede PBMC ved flowcytometri at kvantificere ekspressionen af chemokiner (som beskrevet 21).
- Udsætte exosomer til donor perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra sunde frivillige klinik. Suspender PBMC ifremstillet dyrkningsmedium og tælle cellerne under anvendelse af en celle / partikeltæller (ifølge producentens standardmetoden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exosomer effektivt oprenses fra HIV-1 positive human plasma. Isolerede exosomer, der er konstateret ved acetylcholinesterase (AChE) aktivitet, adskilt i lavere densitet fraktioner 1-3 på toppen af iodixanol gradienter, mens viruspartikler, der er konstateret ved HIV-1-antigenet p24 , adskilt i højere tæthed fraktioner (10-12, nær bunden). Tilstedeværelsen af exosomer blev yderligere bekræftet ved immunoblot identifikation af exosom markører AChE CD9, CD45, CD63 og og ved elektronmikroskopi (figur 2).
Pro-inflammatoriske cytokiner og chemokiner er forbundet med og signifikant forhøjet i exosomer af HIV-1-seropositive individer. Oprensede exosomer og ufraktioneret plasma fra HIV-1-inficerede og HIV-1 seronegative individer blev analyseret for 21 cytokiner / chemokiner ved multiplex assay. Alle 21 cytokiner / kemoKines blev påvist i exosomer isoleret fra HIV-1-positive individer. Derudover blev deres niveauer signifikant forhøjet sammenlignet med plasma og exosomer fra HIV-1 seronegative kontroller (tabel 1).
CD38-ekspression blev øget på overfladen af celler udsat for exosomer fra HIV-1 seropositive individer. PBMC'er fra uinficerede humane donorer blev eksponeret i 48 timer for at poolede exosomer fra HIV-1 seropositive eller seronegative individer og vurderes for niveauer af aktivering markør CD38 på CD4 + og CD8 + T-celler via flowcytometri. Vi observerede, at ved 48 timer efter eksponering, CD38 ekspression på overfladen af naive og centrale hukommelse CD4 + og CD8 + T-celler var signifikant forhøjet i T-celler eksponeret for exosomer fra HIV-1-positive individer i forhold til HIV-negative exosome behandling og ubehandlet kontroller (figur 3).
Figur 1. Skematisk repræsentation af exosome isolation fra HIV-1 positive human plasma. (A) 10 ml perifert blod blev opsamlet fra HIV-1 seropositve og seronegative individer. (B) EDTA-blod opsamlingsrør blev centrifugeret ved 1.000 xg i 20 minutter ved stuetemperatur. (C) separerede plasma blev overført til 50 ml koniske rør og fortyndet ½ med 1x PBS og (D) centrifugeret 10.000 x g i 30 min. (E) Supernatanten blev overført til ultracentrifugerør og (F) centrifugeret ved 10.000 x g i 2 timer. (G, H) Supernatanten blev kasseret, og exosomet pellet resuspenderes og vaskes i 1 ml 1X PBS. (I) Efter centrifugering blev supernatanten kasseret, og pelleten resuspenderet i 1 ml 1x PBS og overlejret på 6-18% iodixanol hastighedsgradient og (J) centrifugeret ved 250.000 x g i 2 timer. (K) Efter centrifugering, 1 ml fraktioner fra top til bund af gradienten var transferred til 1,5 ml rør og analyseres for AChE indhold og immunoblotanalyse. (L) Fraktioner 2 og 3 blev derefter kombineret og fortyndet med 4 ml 1X PBS og (M) centrifugeret ved 400.000 x g i 2 timer. (N) Efter centrifugering supernatanten blev kasseret, og pelleten resuspenderet i 1 ml 1X PBS i til analyse af pro-inflammatoriske cytokin og chemokinekspression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Exosomer effektivt oprenset fra humant plasma. Individuel iodixanol hastighedsgradient fraktioner fra HIV-seropositive eller seronegative individer blev udsat for (A) enzymatisk assay for acetylcholinesterase (AChE) og (B) Western blot-analyse for exosomal markører CD9, CD45 og CD63 og viral protein p24 og var (C) immunolabeled med anti-CD63 og undersøgt med elektronmikroskopi for at bekræfte fremstilling af oprensede exosomer (C). (Figur fra Konadu et al, 2014 21, der anvendes med tilladelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Assay for Immunmodulatorisk potentiale. PBMC'er fra HIV-1 seronegative personer blev udsat for enten poolede exosomer fra plasma fra HIV-1 seropositive (HIV + Exo) eller seronegative (HIV Exo) personer, ubehandlet eller behandlet med 5 ug / ml Concanavalin A (Con A) som en positiv kontrol. Efter 48 timers udsættelse, Naïve (CD45RA + / CD62L +), Central (TCM, CD45RA- / CD62L +) og Effector (TEM; CD45RA- / CD62L-) Memory CD4 + og CD8 + -T-celler blev analyseret for CD38-ekspression ved flowcytometri. Exosome koncentrationen blev normaliseret ved total protein og tilsat ved 1 ug / ml. Fejlsøjler repræsenterer middelværdien +/- SEM af seks uafhængige donorer. Forskel mellem grupperne blev testet for statistisk signifikans ved envejs-ANOVA-test. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figur fra Konadu et al, 2014 21,, brugt med tilladelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Analyse af oprensede exosomer og hele plasma fra HIV-1 seropositive og seronegative individer for pro-inflammatoriske cytokin og chemokinekspression. P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figur fra Konadu et al, 2014 21, der anvendes med tilladelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk immunaktivering (CIA) og CD4 + T-celle depletion er to vigtige kendetegnende for HIV-1-infektion. De er blevet etableret som prædiktorer for patogenese, med CIA at være den bedste prædiktor. Men de underliggende mekanismer kørsel kronisk systemisk immun aktivering og CD4 + T-celle tilbagegang har stadig ikke fuldt belyst. Vi og andre laboratorier har udviklet fast beviser for, at exosomer udskilles fra HIV-1-inficerede celler spiller en rolle i begge stempler.
Den fortsatte interesse i både sammensætning og funktion af ekstracellulære vesikler har ført til offentliggørelsen af forskellige metoder til exosom isolering fra både cellekultur medier og biologiske væsker 24-26. Imidlertid har en barriere for at undersøge betydningen af exosomer i HIV-1 patogenese været effektiv adskillelse af exosomer fra HIV-1-partikler, samtidig med at evnen til at undersøge både exosome indhold og funktionel aktivitet. Vi har udviklet en protocol til oprensning af exosomer fra HIV-1-partikler i humant plasma, der anvender iodixanol hastighedsgradienter. HIV-positive donorer anvendt i denne undersøgelse havde ikke modtaget antiretroviral behandling og plasmaprøverne anvendt til disse eksperimenter indeholdt fra 1500 til 400.000 viruspartikler / ml med et gennemsnit på 206.000 viruspartikler / ml 21. Således viser vi, at exosomer i plasmaet hos HIV-1-inficerede individer kan effektivt separeres fra HIV-1 viruspartikler, selv når virus belastninger er høje. Selvom ens i størrelse og densitet, exosomer adskilt i low-density / øvre fraktioner af iodixanol gradienter sammenlignet med virale partikler, der adskilles i høj massefylde / lavere fraktioner. Exosomerne fremstillet ved iodixanol gradient metode stærkt oprenset og fri for kontaminerende ekstracellulære proteiner. Renheden af det isolerede exosomer population blev bekræftet under anvendelse p24 ELISA og Western blot-analyse for HIV-1 p24 capsidproteinsamt Western analyse for exosomal markører, AChE, CD9, CD45, CD63 og. Anvendelse af disse markører er i overensstemmelse med nyligt offentliggjorte retningslinjer for exosome identifikation 27.
Flere fysiologisk relevant for immunaktivering, blev de oprensede exosomer fra HIV-1 inficerede individer viste sig at indeholde cytokiner / chemokiner til betydeligt højere koncentrationer end exosomer fra HIV-1 seronegative kontroller. Desuden exosomer fra HIV-1 inficerede individer var biologisk aktive, som udviser evnen til at inducere forøgede niveauer af aktivering markering, CD38, på overfladen af naive og centrale hukommelse CD4 + og CD8 + T-celler. Kollektivt antyder disse data en mekanisme, der kunne køre vedvarende immunrespons aktivering under HIV-infektion.
De resultater, vi har kunnet opnå ved hjælp af vores exosome rensningsproces, som kombinerer differentiel centrifugering og iodixanol hastighedsgradient separation viser værdienfor at anvende stærkt oprensede exosomer for fysiologiske og funktionelle bioassays. Proceduren har visse faldgruber og begrænsninger. En betydelig mængde af exosomer, ofte et flertal af udgangsmaterialet som beregnet ved måling af AChE-aktivitet, går tabt under processen. Hertil kommer, at fremgangsmåden er også tidskrævende og kræver adgang til dyrt udstyr. Endelig genereringen af iodixanol gradienter ved hjælp af gradient fromer apparatet kræver betydelig praksis for at sikre reproducerbarhed. En alternativ fremgangsmåde til gradient generation kunne være at fremstille en gradueret serie af iodixanol løsninger, efterfulgt af omhyggelig lagdeling af løsningerne i centrifugerør og inkubering O / N at tillade gradienterne at danne. Vi har dog ikke testet dette alternativ.
Forsøgsprotokollen beskrevet her til isolering og adskillelse af exosomer fra HIV-1-partikler i humant plasma er en effektiv metode til at sikre renheden af exosomes. Anvendelse af denne fremgangsmåde har ført til spændende muligheder for fremtiden undersøgelse vedrørende den rolle, som exosomer i HIV-1 patogenese og kunne ligeledes anvendes i undersøgelser for andre biologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
