Abstract
Exosomes kleine blaasjes variërend in grootte van 30 nm tot 100 nm dat zowel constitutief en na stimulering vrijkomen uit verschillende celtypen. Ze worden gevonden in een aantal biologische vloeistoffen en staan bekend om een verscheidenheid van eiwitten, lipiden en nucleïnezuurmoleculen dragen. Aanvankelijk gedacht dat iets meer dan reservoirs voor cellulaire resten, worden de rollen van exosomes reguleren van biologische processen en ziekten steeds gewaardeerd.
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren exosomes van cellulaire cultuurmedia en biologische vloeistoffen. Door hun kleine omvang en lage dichtheid, differentieel ultracentrifugatie en / of ultrafiltratie zijn de meest gebruikte technieken om exosome isolatie. Echter, plasma van HIV-1 geïnfecteerde individuen bevat zowel exosomes en HIV virusdeeltjes, die van vergelijkbare grootte en dichtheid. Aldus efficiënte scheiding van exosomen uit HIV virale deeltjes in menselijk plasma iseen uitdaging.
Om deze beperking te pakken we een gemodificeerde procedure van Cantin et ontwikkeld. al., 2008 voor de zuivering van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma. Iodixanol snelheidsgradiënten gebruikt om exosomes scheiden van HIV-1 deeltjes in het plasma van HIV-1 positieve personen. Virusdeeltjes werden geïdentificeerd door p24 ELISA. Exosomes werden geïdentificeerd op basis van exosome markers acetylcholinesterase (AChE), en de CD9, CD63 en CD45 antigenen. Onze gradiënt procedure leverde exosome voorbereidingen virus- deeltjes. De efficiënte zuivering van exosomen uit menselijk plasma konden wij het gehalte aan plasma-afgeleide exosomes onderzoeken en hun immuunsysteem modulerende potentie en andere biologische functies te onderzoeken.
Introduction
De HIV-1-epidemie blijft een belangrijke invloed in de hele wereld hebben. Met ingang van 2013, ongeveer 35 miljoen mensen wereldwijd werden met hiv, en 2,1 miljoen daarvan waren nieuw geïnfecteerden 1. Preventiestrategieën en een betere toegang tot antiretrovirale therapie zijn nuttig in het verminderen van de totale overname van HIV geweest. Er zijn echter individuele populatie nog steeds ervaren stijgingen in de overname van HIV-1. Aldus is er een behoefte aan verdere inspanningen om deze epidemie.
Eén van de sterkste voorspellers van HIV progressie van de ziekte chronische immuunactivatie (CIA) 2-10. Bepaald door voortdurend hoge detecteerbare cytokines en verhoogde expressie merkers op het oppervlak van T-lymfocyten, is CIA toegeschreven aan: i) continue dendritische cel productie van type I IFN 11; (ii) directe immuunactivatie gedreven door HIV eiwitten Tat, Nef en gp120 12; (iii) Translocatie van bacteriële eiwitten in darm geassocieerd immuuncellen 6. De exacte mechanisme (s) onderliggende chronische systemische immuunactivatie in HIV-infectie nog volledig worden opgehelderd.
Onze onderzoeksgroep en anderen hebben een rol van exosomes bij HIV pathogenese 15-18 aangetoond. Onze fractie heeft vastgesteld dat Nef-eiwit wordt uitgescheiden uit de geïnfecteerde cellen in exosomes 15 en exosomaal Nef (exNef) aanwezig in het plasma van HIV-geïnfecteerde individuen in nanogram niveau 18 is. We hebben aangetoond dat omstander CD4 + T-cellen blootgesteld aan exNef resulteerde in activatie geïnduceerde celdood afhankelijk van de CXCR4 traject 19, 20. Alternatief, monocyt / macrofagen waren ongevoelig voor exNef-geïnduceerde apoptose, maar vertoonde veranderde cellulaire functies en cytokine expressie. Onlangs heeft onze groep getoond exosomes geïsoleerd uit plasma van HIV-geïnfecteerde individuen bevatten een verscheidenheid van cytokines. Further, naïeve perifere mononucleaire cellen blootgesteld aan plasma bereide exosomes uit HIV-geïnfecteerde patiënten geïnduceerde expressie van CD38 op naïeve en memory CD4 + centrale en CD8 + T-cellen. Dit zal waarschijnlijk bijdraagt aan systemische ontsteking en virale propagatie via bystander celactivering 21, en stelt exosomes spelen een belangrijke rol bij HIV-pathogenese.
In het onderzoek naar de rol van exosomes bij HIV pathogenese, is een uitdaging ontwikkelen van technieken om efficiënt scheiden exosomes van HIV-deeltjes terwijl de exosomaal inhoud en hun functionele immune modulerende vermogen. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren van exosomen uit celkweek en biologische vloeistoffen 22,23. Vanwege hun kleine omvang en lage dichtheid (exosomes drijven met een dichtheid van 1,15 - 1,19 g / ml), differentiële ultracentrifugatie en / of ultrafiltratie zijn de meest gebruikte technieken voor het isoleren exosome 23.Echter, HIV-geïnfecteerde celkweek supernatanten en plasma van patiënten bevatten zowel exosomes en HIV-1 virale deeltjes. Exosomes en HIV-1 deeltjes zeer vergelijkbaar in grootte en dichtheid. Als alternatief, gebruik te maken van de expressie van unieke exosomaal markers zoals CD63, CD45 en CD81, exosomes zijn geïsoleerd met behulp immunoaffiniteits- capture methoden 23. Deze procedure kan virus scheiden van exosomes. Echter, het nadeel van deze techniek is de strakke binding van antilichamen tegen het gezuiverde exosomes, die kunnen interfereren met de beoordeling van de immuunmodulerende potentieel van exosomes in kweek.
Om deze beperkingen te pakken we een procedure voor de zuivering van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma modificatie van Cantin en collega's 22 gebruikt iodixanol snelheidsgradiënten ontwikkeld. Exosomes bleken te scheiden in de low-density / bovenste fracties van iodixanol hellingen, terwijl virusdeeltjes gescheiden in de hoog-dichtheid / lagere fracties. Virusdeeltjes werden geïdentificeerd door p24 ELISA en exosomes werden geïdentificeerd met behulp van exosome markers AChE, CD9, CD63 en CD45. De bovenste lage dichtheid fracties verzameld bevatte exosomes die negatief voor HIV-1 p24 besmetting waren. De efficiënte zuivering en scheiding van exosomen uit HIV-deeltjes in menselijk plasma een accurate onderzoek van de inhoud van exosomen uit menselijk plasma en het onderzoeken van hun immuunsysteem modulerende potentiaal en de diagnostische en prognostische waarde van exosomen in HIV-1 pathogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een algemeen schema van de exosome isolatie en zuivering procedure wordt gegeven in figuur 1. Volbloed werd verkregen van gezonde vrijwillige donoren en van hiv-positieve personen niet die antiretrovirale theraoy bijwonen van de Hope Clinic van Emory University en de Infectious Disease Program van Grady Health System in Atlanta, Georgia. Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele review boards van Emory University en Morehouse School of Medicine. Alle personen die deelnemen aan het onderzoek gaf schriftelijke en geïnformeerde toestemming.
1. Voorbereiding van exosomen uit bloedplasma
- Human bloedafname en verwerking
- Verzamel 10 ml perifeer bloed door venapunctie in EDTA bloedafnamebuizen (bevattende 18 mg kalium EDTA) en voorzichtig omkeren vijfmaal te mengen.
- Centrifugeer de bloedafnamebuisjes bij 1000 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur bloedcellen pellet. Gebruik een steriele pipette de plasmafractie (4-5 ml) overbrengen naar een 25 ml conische buis. Verdun het plasma met 10 ml 1 x PBS. Gooi bloedcellen (rode bloedcellen en witte bloedcellen, ook wel bekend als PBMC) in een voldoende duidelijke container voor biologisch gevaarlijk afval.
NB: In het geval van niet-geïnfecteerde donor bloedmonsters kan de PBMC worden gereserveerd voor verder gebruik (zie procedure IV.2, hieronder). - Bewaar de plasma monsters bij 4 ° C voor de korte termijn (2-3 dagen) of bij -80 ° C voor langere termijn opslag.
OPMERKING: Breng elke bevroren plasma monsters tot 4 o C voor verdere verwerking.
- Voorbereiding van exosome fractie uit plasma
- Centrifugeer bij 10.000 xg plasma gedurende 30 minuten bij 4 ° C om celresten te verwijderen. Gebruik een steriele serologische pipet om de ontruimde bovenstaande plasma over te dragen aan een schone 25 ml ultracentrifuge buis. Gooi de pellet in de biohazard container.
- Centrifugeer de geklaard plasma bij 100.000 xg gedurende 2uur bij 4 ° C om grote vesicles te verwijderen. Verwijder de 100.000 xg supernatant voorzichtig door pipetteren, en gooi in biologisch gevaarlijk afval. Resuspendeer de 100.000 x g pellet in 1 ml 1X PBS in een schone buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min, zwenken te verjagen en aparte deeltjes.
- Was de zwevende 100.000 xg exosome / viruspellet door toevoeging van 25 ml PBS. Zwenk de buis vijf keer te mengen, centrifugeer opnieuw bij 100.000 g gedurende 2 uur bij 4 ° C. Gooi de PBS-wash oplossing in de biologisch gevaarlijk afval container.
- Resuspendeer de 100.000 x g pellet in 1 ml van 1 X PBS en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min zwenken te verjagen en los de pellet.
OPMERKING: Indien het niet mogelijk is om rechtstreeks naar de iodixanol gradiëntstap, bewaar de pellet gemaakt met exosomes en virusdeeltjes, bij 4 ° C gedurende 1-2 dagen tot de iodixanol gradiëntstap.
2. Zuivering van exosomen
- Genereren van 6% -18% velocteit gradiënten van iodixanol met een dual-kamer gradiënt voormalige apparaat.
- Bereid 6% en 18% oplossingen van de IODIXANOL reagens, als een oplossing 60% in water, door verdunning in PBS geleverd. Pipetteer 5,5 ml van de 18% oplossing in de geroerde kamer en Pipetteer 5,5 ml van 6% oplossing in de reservoirkamer. Schakel de roerder, open de kraan en laat elke helling te stromen in een 14 ml ultracentrifuge buis.
OPMERKING: Ofwel direct gebruiken of op te slaan bereid gradiënten O / N bij 4 ° C voor gebruik. - Laag voorzichtig 1 ml van de exosome / virusoplossing op de bovenkant van elk 11 ml gradiënt. Centrifugeer gradiënten bij 250.000 g gedurende 2 uur bij 4 ° C, met een swinging bucket rotor SW40Ti.
- Label twaalf (12) 1,5 ml microcentrifuge buizen. Verwijder 1,0 ml van de bovenkant van de gradiënt en transfer naar buis # 1. Breng de resterende 1 ml fracties buizen 2-12 in de juiste volgorde.
Opmerking: De bovenste fractie zal dus # 1, de bodemfractie, # 12. Sterts de gradiëntfracties bij 4 ° C. Het gezuiverde exosomes, die moet worden in de fracties 1-3 aan de top van de gradiënt, zijn stabiel gedurende 3-4 weken indien bewaard bij 4 ° C.
- Bereid 6% en 18% oplossingen van de IODIXANOL reagens, als een oplossing 60% in water, door verdunning in PBS geleverd. Pipetteer 5,5 ml van de 18% oplossing in de geroerde kamer en Pipetteer 5,5 ml van 6% oplossing in de reservoirkamer. Schakel de roerder, open de kraan en laat elke helling te stromen in een 14 ml ultracentrifuge buis.
3. exosome karakterisering
- Acetylcholinesterase (AChE) activiteit Assay
- Bereid 100 mM substraat voorraad door het mengen van acetylthiocholine jodide 28,9 mg in 1 ml 1X PBS. Store substraat voorraad bij -20 ° C tot 1 maand.
- Bereid 10 mM kleurindicator leverbaar door mengen benzoëzuur 39.6mg en natriumbicarbonaat 15 mg in 10 ml 1X PBS. Store kleurindicator voorraad bij 4 ° C tot twee weken.
- Bereid assayreagens door mengen 1X PBS, substraat en kleurindicator in een verhouding van 100: 2: 5 (bijvoorbeeld 10 ml 1X PBS + 200 gl substraat + 500 gl kleurindicator).
- Breng 50 gl van elk 1,5 ml gradiënt fractie buis (gelabeld 1-12, uit procedure III.3) aan de putjes van een 96 putjes microtiter plaat. Bereid duplo voor elk gradiënt monster.
- Bereid een reeks normen door eerst een 2000 pU / ml AChE voorraad in PBS. Voeg elf (11) 2-voudige seriële verdunningen van deze voorraden en voeg 50 ul van elke verdunning tot een enkel putje van een microtiterplaat, zodat standaard # 1 = 2000 pU / ml, # 2 = 1000 pU / ml, # 3 = 500 pU / ml, etc. tot # 12 = 0,98 pU / ml. De twaalf AChE normen zullen derhalve nemen een enkele rij van een 96-wells assay plaat.
- Voeg 200 ul bepalingsbuffer mengsel van reagentia aan elk putje en incubeer 20 min (in het donker) bij kamertemperatuur tot de ontwikkeling van het gekleurde reactieproduct mogelijk maken. Meet AChE-activiteit bij een golflengte van 450 nm onder toepassing van een fluorescerende microplaatlezer.
Opmerking: Het percentage overblijvend uitgangsmateriaal na exosome zuivering wordt bepaald door AChE bepaling van de gefractioneerde plasma.
- Immunoblotanalyse
- Afzonderlijke eiwitten gradiënt fracties 1-12 (van procedure 2.1.3) door SDS-PAGE op 4-20% Tris-HCl voorgegoten gels bij 100V x 1 uur. Breng eiwitten in de gel naar een nitrocellulosemembraan met behulp van een electro-blotting transfercel volgens de instructies van de fabrikant. Laat de transfers te wissen voor 12-16 uur (O / N) bij 350V.
- Verwijder het membraan uit de blotapparaat en wassen in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gedurende 5 min. Blokkeren met 5% magere melk in TTBS (TBS met 0,1% Tween 20) gedurende 1 uur met schudden bij kamertemperatuur.
- Incubeer het membraan met primaire antilichamen specifiek voor exosomes (CD9, CD45, CD63) of HIV-1 capside-eiwit (p24) in 5% niet vette melk met schudden bij 4 ° C gedurende 12-16 uur (O / N). Verdunningen van de primaire antilichamen immunoblots variëren van 1: 2.000 -1: 5000.
- Was de vlek in TTBS gedurende 20 minuten, gevolgd door incubatie met een 1: 2000 verdunning van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-IgG (secundair antilichaam), in 5% niet vette melk gedurende 1 uur bij KT. Was de vlek 3 maal met TTBS, 10 min per wasbeurt.
- Sla de afbeeldingen als TIFF-bestanden die in Adobe Photoshop kan worden bekeken. Voeren densitometrie analyse van bands met ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
- Cytokine Assay
- Voor de cytokine test verstoren immuuncomplexen die zijn gewoonlijk aanwezig in menselijk plasma door zure dissociatie en lyseren de exosomes door detergensbehandeling. Assay zowel beginnend plasmamonsters en gezuiverd exosome preparaten.
- Aan 100 pl menselijke plasma voeg 100 pl 0,33 N HCl en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Voeg 100 pl 0,33 N NaOH tot zuurbehandeld plasma neutraliseren. Voeg Triton X-100 aan zowel de geneutraliseerde plasma en gezuiverde exosome monsters, een final concentratie van 1%, tot lysis van exosomes veroorzaken.
- Voor deze test (een fluorescerende bead-based procedure), gebruik magnetische beads vooraf bekleed met antilichamen door de fabrikant. Gebruik een speciaal ontworpen panel van anti-humaan cytokine-antilichaam beklede parels; in Tabel 1 opgesomd. Vortex de met antilichaam beklede magnetische kralen uit de cytokine testkit voor 30 seconden en voeg 50 ul kralen aan elk putje van een 96-wells plaat voor gebruik in de assay.
- Bereid een verdunningsreeks van normen plasmastandaard buffer (zowel in de cytokine assay kit) zoals beschreven in de gebruiksaanwijzing van de cytokine testkit, een 8-punts standaardcurve.
- Voeg 150 ul 1X wasbuffer (van kit) aan elk putje en was de kralen met een magnetische bead ring, zoals beschreven in de handleiding. Voeg 25 ul plasma assay buffer (van kit) aan elk putje. Voeg 25 ul van standaarden en monsters aan alle putjes in de test gebruikt. Voeg 25 pl plasmamonsterbuffer negatieve controleputjes. Seal en schud de plaat bij 700 rpm gedurende 60 min bij kamertemperatuur en geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
- Voeg 150 ul 1X wasbuffer aan elk putje en de plaat was (zoals in stap 3.3.4, hierboven). Voeg 25 ul van detectie antilichamen in elk putje, afdichting en schud plaat bij 700 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstap.
- Voeg 50 ul streptavidine-oplossing (SAPE vanaf kit) in elk putje, afdichting en schud plaat bij 700 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Herhaal plaat wast zoals in 3.3.4.
- Voeg 120 ul van buffer lezen (uit kit) aan elk putje en schud op laboratoriumschaal tafelblad schudinrichting bij 700 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het fluorescentiesignaal te ontwikkelen. Lees plaat op de plaat lezer volgens de instructies van de fabrikant.
- Om rekening te houden met de hoeveelheid exosomes verloren tijdens de isolatie procedure, gebruik maken van de volgende vergelijking: [(origineel lezen / plasma volume) x 66,6 = aangepast cytokine lezing].
- Voor de cytokine test verstoren immuuncomplexen die zijn gewoonlijk aanwezig in menselijk plasma door zure dissociatie en lyseren de exosomes door detergensbehandeling. Assay zowel beginnend plasmamonsters en gezuiverd exosome preparaten.
4. Test voor Immuunmodulerende Potentiële
- Bereiding cultuurmedium met exosome-verarmd foetaal runderserum
- Centrifuge 500 ml foetaal runderserum (FBS) bij 100.000 xg gedurende 20 uur bij 4 ° C tot pellet verontreinigende exosomes en microvesicles. Te verwijderen en sla de-exosome uitgeputte FBS supernatant zorgvuldig. Gooi de pellet in het biologisch afval.
- Combineer 20% van de exosome uitgeputte FBS supernatant met 500 ml van het Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) medium. Filtreer het medium door een 0,45 urn membraanfilter.
- Streptomycine (100 U / ml), penicilline (100 U / ml), L-glutamine (2 mM), HEPES-gebufferde zoutoplossing (10 uM) en IL-2 (20 U / ml) aan het gefiltreerde medium.
- Cel Cultuur en exosome Exposure
- Expose exosomes donoren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) van gezonde vrijwilligers kliniek. Schorten PBMC inbereide kweekmedium en tel de cellen met behulp van een cel / deeltjesteller (volgens standaardmethode van de fabrikant).
Opmerking: De PBMC worden verkregen tijdens de bereiding plasma hierboven beschreven (stap 1,2). - Het gebruik van bereide medium procedure 4.1.3, co-kweek 3,0 x 10 6 (PBMC) met 1 ug / ml samengevoegd exosomes drie (3) HIV-1 seropositieve of drie (3) HIV-1 seronegatieve individuen in totaal volume van 1 ml in de putjes van een 12-well kweekplaat (met deksel). Incubeer kweken gedurende 48 uur bij 37 ° C.
- Bereid onbehandelde PBMC kweken en kweken behandeld met concanavaline A (Con A; 5 ug / ml) als negatieve en positieve controles dienen, respectievelijk, zoals hierboven (4.2.2) beschreven. Incubeer alle PBMC kweken gedurende 48 uur bij 37 ° C.
- Onmiddellijk voorafgaand aan het oogsten van de cellen te bereiden verdunningen van de volgende fluorochroom-geconjugeerde monoklonale antilichamen: Alexa Fluor 700-gelabeld anti-CD3 (1: 400 verdunning), allophycocyAnIn (APC) / cyanine 7 (Cy7) -gelabeld anti-CD4 (1: 400), peridinin chlorofyl-eiwit complex gelabeld anti-CD4 (1: 400) V450-gelabeld anti-CD8 (1: 400), biotine gelabeld anti-CD45RA (1: 1000), fycoerythrine (PE) / Cy7-gelabeld anti-CD62L (1: 1000), PE / cyanine 5 (Cy5) -gelabeld anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- gelabeld anti-streptavidine (1: 2000) en PE / Cy5-gelabelde muis IgG1K isotype controle (1: 200).
- Na de 48 uur incubatietijd, de oogst van de PBMC. Was PBMC in PBS exosomes om de cellen te verwijderen en vlekken door incubatie gedurende 1 uur bij 4 ° C met afzonderlijke fluorochroom gelabeld antilichamen. Analyseer het behandelde PBMC door flow cytometrie op de expressie van chemokines kwantificeren (zoals beschreven 21).
- Expose exosomes donoren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) van gezonde vrijwilligers kliniek. Schorten PBMC inbereide kweekmedium en tel de cellen met behulp van een cel / deeltjesteller (volgens standaardmethode van de fabrikant).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exosomes efficiënt gezuiverd uit HIV-1 positieve humane plasma. Geïsoleerde exosomes, die door acetylcholinesterase (AChE) activiteit, gescheiden in fracties 1-3 lagere dichtheid boven in de IODIXANOL gradiënten, dat virusdeeltjes, die door HIV-1-antigeen p24 , gescheiden in de hogere dichtheid fracties (10-12, dichtbij de bodem). De aanwezigheid van exosomen werd verder bevestigd door immunoblot geïdentificeerd exosome markers AChE, CD9, CD45 en CD63, en elektronenmicroscopie (figuur 2).
Cytokines en chemokines worden geassocieerd met en significant verhoogd in de exosomes van HIV-1 seropositieve individuen. Gezuiverd exosomes en gefractioneerde plasma van HIV-1 infectie en HIV-1 seronegatieve individuen werden geanalyseerd op 21 cytokines / chemokines door multiplex assay. Alle 21 cytokines / chemokines werden gedetecteerd in exosomes geïsoleerd uit HIV-1 positieve personen. Bovendien waren de niveaus significant verhoogd in vergelijking met plasma en exosomes van HIV-1 seronegatieve controles (tabel 1).
CD38-expressie was verhoogd op het oppervlak van cellen blootgesteld aan exosomes van HIV-1 seropositieve individuen. PBMC van niet-geïnfecteerde menselijke donoren werden blootgesteld gedurende 48 uur samengevoegde exosomes van HIV-1 seropositieve en seronegatieve individuen en beoordeeld op niveau van de activatie marker CD38 op CD4 + en CD8 + T-cellen via flowcytometrie. We vonden dat per 48 uur na blootstelling, CD38-expressie op het oppervlak van naïeve en centrale memory CD4 + en CD8 + T-cellen waren significant verhoogd in T-cellen blootgesteld aan exosomes van HIV-1 positieve personen vergeleken met HIV-negatieve exosome behandeling en onbehandeld (Afbeelding 3).
Figuur 1. Schematische weergave van exosome isolatie van HIV-1 positieve humane plasma. (A) 10 ml perifeer bloed werd verzameld van HIV-1 seronegatieve individuen en seropositve. (B) EDTA bloedafnamebuisjes werden gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur bij 1000 x g gecentrifugeerd. (C) afgescheiden plasma werd overgebracht naar 50 ml conische buizen en ½ verdund met 1x PBS en (D) 10.000 xg gecentrifugeerd gedurende 30 min. (E) Het supernatant werd overgebracht naar buisjes ultracentrifuge en (F) gecentrifugeerd bij 10.000 xg gedurende 2 uur. (G, H) Het supernatant werd verwijderd en de exosome pellet opnieuw gesuspendeerd en gewassen in 1 ml 1X PBS. (I) Na centrifugatie werd het supernatant verwijderd en de pellet opnieuw gesuspendeerd in 1 ml 1x PBS en bedekt op 6-18% iodixanol snelheidsgradiënt en (J) gecentrifugeerd bij 250.000 xg gedurende 2 uur. (K) Na centrifugatie, 1 ml fracties van boven naar beneden van de gradiënt werden transferred naar 1,5 ml buisjes en AChE inhoud en immunoblot analyse geanalyseerd. (L) De fracties 2 en 3 werden vervolgens gecombineerd en verdund met 4 ml 1X PBS en (M) gecentrifugeerd bij 400.000 xg gedurende 2 uur. (N) Na het centrifugeren, het supernatant werd verwijderd en de pellet opnieuw gesuspendeerd in 1 ml 1X PBS voor de analyse van pro-inflammatoire cytokine en chemokine expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. exosomes efficiënt gezuiverd uit menselijk plasma. Individuele iodixanol snelheidsgradient fracties uit HIV-seropositieve en seronegatieve individuen werden onderworpen aan (A) enzymatische test van acetylcholinesterase (AChE) en (B) Western blot-analyse voor exosomaal markers CD9, CD45 en CD63 en virale eiwitten p24 en zijn (C) immunologisch met anti-CD63 en onderzocht met elektronenmicroscopie voor bereiding van gezuiverde exosomes (C) bevestigen. (Figuur van Konadu et al, 2014 21, gebruikt met toestemming). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Test voor Immunomodulerende potentieel. PBMC van HIV-1 seronegatieve individuen werden blootgesteld aan samengevoegde exosomes uit plasma van HIV-1 seropositieve (HIV + Exo) of seronegatieve (HIV Exo) individuen, onbehandeld of behandeld met 5 ug / ml concanavaline A (Con A) als een positieve controle. Na 48 uur blootstelling, Naïve (CD45RA + / CD62L +), Central (TCM; CD45RA- / CD62L +) en Effector (TEM; CD45RA- / CD62L-) Geheugen CD4 + en CD8 + T-cellen werden geanalyseerd op CD38 expressie door flow cytometrie. Exosoom concentratie werd genormaliseerd op totaal eiwit en toegevoegd aan 1 ug / ml. Fout balken geven gemiddelde +/- SEM van zes onafhankelijke donoren. Verschil tussen de groepen werden getest op statistische significantie door One Way ANOVA test. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figuur van Konadu et al, 2014 21, gebruikt met toestemming). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Analyse van gezuiverde exosomes en hele plasma van HIV-1 seropositieve en seronegatieve individuen voor pro-inflammatoire cytokine en chemokine expressie. P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figuur van Konadu et al, 2014 21, gebruikt met toestemming). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chronische immuunactivatie (CIA) en CD4 + T cel depletie twee belangrijke kenmerken van HIV-1-infectie. Ze zijn gevestigd als voorspellers voor de pathogenese, met de CIA als de beste voorspeller. De onderliggende mechanismen die chronische systemische immuunactivatie en CD4 + T-cel afname nog niet volledig opgehelderd. Wij en andere laboratoria hebben harde bewijzen ontwikkeld dat exosomes afgescheiden van HIV-1 geïnfecteerde cellen spelen een rol in zowel kenmerken.
De aanhoudende interesse in zowel de samenstelling en functie van extracellulaire blaasjes heeft geleid tot de publicatie van de verschillende methoden voor exosome isolatie van beide media voor celkweek en biologische vloeistoffen 24-26. Echter, heeft een belemmering voor het onderzoeken van de rol van exosomes in HIV-1 pathogenese efficiënte scheiding van exosomen zijn van HIV-1 deeltjes met behoud van de mogelijkheid om zowel exosome inhoud functionele activiteit te onderzoeken. We hebben een prototype ontwikkeldcol voor de zuivering van exosomen uit HIV-1 deeltjes in menselijk plasma, gebruik iodixanol snelheidsgradiënten. De HIV-positieve donoren gebruikt in deze studie waren antiretrovirale behandeling en plasmamonsters voor deze experimenten bevatte van 1500 tot 400.000 virusdeeltjes / ml met een gemiddelde van 206.000 virusdeeltjes / ml 21 ontvangen. Zo hebben we aangetoond dat exosomes in het plasma van HIV-1 geïnfecteerde individuen efficiënt kunnen worden gescheiden van HIV-1 virusdeeltjes, zelfs wanneer het virus ladingen hoog. Hoewel vergelijkbaar in grootte en dichtheid, exosomes gescheiden in de lage-dichtheid / bovenste fracties van de IODIXANOL gradiënten ten opzichte van virusdeeltjes, die gescheiden in de high-density / kleine fracties. Het door de iodixanol gradientmethode exosomes sterk gezuiverd en vrij van verontreinigende cellulaire eiwitten. De zuiverheid van de geïsoleerde populatie exosomes werd bevestigd met p24 ELISA en Western blot-analyse van HIV-1 p24 capside-eiwitevenals Western-analyse voor exosomaal markers, AChE, CD9, CD45 en CD63. Het gebruik van deze markers is in overeenstemming met de recent gepubliceerde richtlijnen voor exosome identificatie 27.
Meer fysiologisch relevant immuunactivatie het gezuiverde exosomes van HIV-1 geïnfecteerde individuen bleken cytokines / chemokines bevatten aanzienlijk hogere concentraties dan exosomes van HIV-1 seronegatieve controles. Bovendien exosomes van HIV-1 geïnfecteerde individuen waren biologisch actief, vertoont het vermogen om verhoogde niveaus van de activatie marker CD38 induceren op het oppervlak van naïeve en memory CD4 + centrale en CD8 + T-cellen. Gezamenlijk suggereren deze gegevens een mechanisme dat persistente activering van het immuunsysteem zou kunnen trekken tijdens HIV-infectie.
De resultaten konden we krijgen in onze exosome zuiveringswerkwijze die het samen differentiële centrifugatie en iodixanol snelheidsgradiënt scheiding, de omvangvan het gebruik van zeer gezuiverde exosomes voor fysiologische en functionele bioassays. De procedure heeft wel bepaalde valkuilen en beperkingen. Een aanzienlijk deel van de exosomes, vaak een meerderheid van het uitgangsmateriaal berekend door meting van AChE activiteit verloren tijdens het proces. Daarnaast is de procedure eveneens tijdrovend en vereist toegang tot dure apparatuur. Tenslotte, het genereren van de IODIXANOL verlopen met de gradiënt fromer inrichting vereist aanzienlijke praktijk reproduceerbaarheid te waarborgen. Een alternatieve werkwijze voor het genereren helling zou zijn met een gegradeerde reeks IODIXANOL oplossingen, gevolgd door een zorgvuldige gelaagdheid van de oplossingen in centrifugebuizen en incuberen O / N bereiden zodat de gradiënten te vormen. We hebben echter niet deze alternatieve getest.
Het experimentele protocol beschreven voor isolatie en scheiding van exosomen uit HIV-1 deeltjes in humaan plasma is een effectieve methode om de zuiverheid van ex waarborgenosomes. Het gebruik van deze methode heeft geleid tot spannende mogelijkheden voor toekomstig onderzoek met betrekking tot de rol van exosomes in HIV-1 pathogenese en kan evengoed worden gebruikt in aanvragen voor andere biologische processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
