Abstract
Esosomi sono piccole vescicole di dimensioni variabili da 30 nm a 100 nm che vengono rilasciati sia costitutivamente e dopo stimolazione da una varietà di tipi di cellule. Si trovano in una serie di fluidi biologici e sono noti per portare una varietà di proteine, lipidi e molecole di acido nucleico. Originariamente pensato per essere poco più di serbatoi di detriti cellulari, i ruoli di esosomi che regolano processi biologici e nelle malattie sono sempre più apprezzati.
Diversi metodi sono stati descritti per isolare exosomes di terreni di coltura cellulare e fluidi biologici. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità, ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l'isolamento exosome. Tuttavia, il plasma di HIV-1 individui infetti contiene sia esosomi e particelle virali HIV, che sono simili per dimensioni e densità. Così, la separazione efficiente di esosomi da particelle virali HIV nel plasma umano è statouna sfida.
Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato una procedura modificata da Cantin et. al., 2008 per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano. Iodixanolo gradienti di velocità sono stati usati per separare esosomi da HIV-1 particelle nel plasma di HIV-1 individui positivi. Particelle virali sono stati identificati mediante p24 ELISA. Esosomi sono stati individuati sulla base dei marcatori exosome acetilcolinesterasi (AChE), e gli antigeni CD9, CD63, CD45 e. La nostra procedura gradiente prodotto preparativi exosome gratuitamente particelle virali. La purificazione efficiente di esosomi da plasma umano ci ha permesso di esaminare il contenuto di exosomes derivati dal plasma e di indagare il loro potenziale di modulazione immunitaria e altre funzioni biologiche.
Introduction
L'HIV-1 epidemia continua ad avere un impatto significativo in tutto il mondo. A partire dal 2013, circa 35 milioni di persone in tutto il mondo vivevano con l'HIV, e 2,1 milioni di questi erano individui contagiati 1. Le strategie di prevenzione e un maggiore accesso alla terapia antiretrovirale sono stati utili nel ridurre l'acquisizione complessiva di HIV. Tuttavia, singole popolazioni stanno ancora sperimentando aumenti per l'acquisizione di HIV-1. Quindi, vi è la necessità di proseguire gli sforzi per affrontare questa epidemia.
Uno dei più forti predittori di progressione della malattia da HIV è attivazione immunitaria cronica (CIA) 2-10. Definito da persistentemente elevati livelli di citochine rilevabili e marcatori di espressione elevati sulla superficie dei linfociti T, CIA è stato attribuito a: i) continua la produzione di cellule dendritiche di tipo I IFN 11; (ii) l'attivazione immunitaria diretta guidata da proteine dell'HIV Tat, Nef e gp120 12; (iii) Traslocazione di proteine batteriche intestinali associate a cellule immunitarie 6. Tuttavia, il meccanismo esatto (s) cronica sottostante, l'attivazione immunitaria sistemica nell'infezione da HIV devono ancora essere completamente chiariti.
Il nostro gruppo di ricerca e altri hanno dimostrato un ruolo di esosomi HIV patogenesi 15-18. Il nostro gruppo ha stabilito che la proteina Nef è escreto dalle cellule infette in esosomi 15, e exosomal Nef (exNef) è presente nel plasma di individui affetti da HIV a livelli nanogrammi 18. Abbiamo dimostrato che astante CD4 + T-cellule esposte a exNef provocato attivazione indotta morte cellulare dipendente dal percorso CXCR4 19, 20. In alternativa, monociti / macrofagi erano refrattari all'apoptosi exNef indotta, ma esposto funzioni cellulari alterati e di espressione di citochine. Esosomi Più di recente, il nostro gruppo ha dimostrato isolate dal plasma di individui affetti da HIV contengono una varietà di citochine pro-infiammatorie. Further, ingenui cellule mononucleate del sangue periferico esposti a exosomes plasmaderivati da pazienti con infezione da HIV indotta espressione di CD38 sulle cellule memoria ingenuo e centrale CD4 + e CD8 + T. Ciò probabilmente contribuisce ad infiammazione sistemica e la propagazione virale tramite l'attivazione delle cellule astante 21, e suggerisce che esosomi giocano un ruolo importante nella patogenesi dell'HIV.
Nel indagare il ruolo di esosomi nella patogenesi dell'HIV, una sfida sta sviluppando tecniche per esosomi efficacemente separati da particelle di HIV, pur mantenendo il contenuto exosomal così come la loro capacità funzionale modulazione immunitaria. Diversi metodi sono stati descritti per isolare esosomi da coltura cellulare e fluidi biologici 22,23. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità (esosomi galleggiare con una densità di 1,15 - 1,19 g / ml), ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l'isolamento exosome 23.Tuttavia, con infezione da HIV supernatanti di coltura cellulare e nel plasma dei pazienti contengono sia esosomi e HIV-1 particelle virali. Esosomi e HIV-1 particelle sono molto simili per dimensioni e densità. In alternativa, sfruttando l'espressione di marcatori exosomal unici come CD63, CD45, CD81 e, esosomi sono stati isolati con metodi di cattura immunoaffinità 23. Questa procedura può separare il virus da esosomi. Tuttavia, l'inconveniente di questa tecnica è la stretta attaccamento di anticorpi purificati esosomi, che potrebbero interferire con la valutazione del potenziale immunomodulante di esosomi in coltura.
Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una procedura per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano modificati rispetto Cantin e collaboratori 22 utilizzando iodixanolo gradienti di velocità. Esosomi sono stati trovati a segregare in bassa densità / frazioni superiori di gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali separati nel altadensità / frazioni inferiori. Particelle virali sono stati identificati da p24 ELISA e esosomi sono stati identificati utilizzando marcatori exosome AChE, CD9, CD63, CD45 e. Le frazioni a bassa densità superiori raccolti contenevano esosomi che erano negativi per la contaminazione da HIV-1 p24. La purificazione efficiente e la separazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano permette di accurato esame del contenuto di esosomi derivati dal plasma umano e l'indagine del loro potenziale modulatore immunitario e il valore diagnostico e prognostico di esosomi in HIV-1 patogenesi.
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Protocol
Uno schema generale della procedura di isolamento exosome e la purificazione è fornito nella figura 1. Sangue intero è stato ottenuto da donatori volontari sani e da persone sieropositive che non ricevono theraoy antiretrovirale che frequentano la speranza Clinica della Emory University e il Programma di Malattie Infettive di Grady Health System ad Atlanta, Georgia. Questo studio è stato approvato dai comitati etici di Emory University e Morehouse School of Medicine. Tutte le persone che hanno partecipato allo studio hanno firmato un consenso informato e.
1. Preparazione di Esosomi dal plasma del sangue
- Raccolta di sangue umano e alla trasformazione
- Raccogliere 10 ml di sangue periferico mediante prelievo venoso in provette di raccolta del sangue EDTA (contenenti 18 mg di potassio EDTA), e capovolgere delicatamente per cinque volte per mescolare.
- Centrifugare le provette per il prelievo di sangue a 1000 xg per 20 minuti a temperatura ambiente per far sedimentare le cellule del sangue. Utilizzare una pipetta sterile,te per trasferire la frazione di plasma (4-5 ml) in una provetta conica da 25 ml. Diluire il plasma con 10 ml di 1 x PBS. Eliminare cellule del sangue (globuli rossi e globuli bianchi, noto anche come PBMC) in un contenitore opportunamente marcata per i rifiuti a rischio biologico.
NOTA: Nel caso di non infetti campioni di sangue del donatore, il PBMC può essere riservato per un ulteriore uso (vedi procedura IV.2, di seguito). - Conservare i campioni di plasma a 4 ° C per breve termine (2-3 giorni) o a -80 ° C per la conservazione a lungo termine.
NOTA: Portare tutti i campioni di plasma congelati a 4 ° C prima di ulteriori trasformazioni.
- Preparazione di Exosome frazione di plasma
- Plasma Centrifugare a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire il surnatante del plasma cancellata per un 25 ml tubo ultracentrifuga pulito. Eliminare il pellet nel contenitore rischio biologico.
- Centrifugare il plasma eliminato a 100.000 xg per 2hr a 4 ° C per rimuovere grandi vescicole. Rimuovere il surnatante 100.000 xg accuratamente pipettando, e gettare nei rifiuti a rischio biologico. Risospendere il pellet 100.000 xg in 1 ml di 1X PBS in una provetta pulita ed incubare a temperatura ambiente per 30 min, agitando delicatamente per rimuovere particelle e separati.
- Lavare lo squalificato 100.000 xg pellet exosome / virus con l'aggiunta di 25 ml di PBS. Capovolgere delicatamente la provetta per cinque volte per miscelare, quindi centrifugare di nuovo a 100.000 xg per 2 ore a 4 ° C. Eliminare la soluzione di lavaggio PBS nel contenitore per rifiuti biologici.
- Risospendere il pellet 100.000 xg in 1 ml di 1 x PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti agitando delicatamente per rimuovere e sciogliere il precipitato.
NOTA: Se non è possibile procedere direttamente al gradiente passo iodixanolo, memorizzare il pellet, contenente exosomes e particelle virali, a 4 ° C per 1-2 giorni, fino alla fase iodixanolo gradiente.
2. Purificazione di Esosomi
- Generare 6% -18% velocgradienti lità di iodixanolo utilizzando una doppia camera di pendenza ex apparato.
- Preparare le soluzioni 6% e il 18% del reagente iodixanolo, forniti come una soluzione al 60% in acqua, per diluizione in PBS. Pipettare 5,5 ml della soluzione di 18% nella camera agitata e pipettare 5,5 ml della soluzione al 6% nella camera serbatoio. Accendere l'agitatore, aprire il rubinetto, e consentire ogni sfumatura di fluire in una provetta da 14 ml ultracentrifuga.
NOTA: o utilizzare immediatamente o conservare pendenze preparate O / N a 4 ° C prima dell'uso. - Strato con cautela 1 ml di soluzione exosome / virus sulla parte superiore di ogni 11 ml di gradiente. Gradienti centrifugare a 250.000 xg per 2 ore a 4 ° C, utilizzando un secchio SW40Ti rotore oscillante.
- Etichettare dodici (12) 1,5 ml microprovette. Rimuovere 1,0 ml dalla sommità del gradiente e trasferimento a tubo # 1. Trasferire i restanti frazioni 1ml a tubi 2-12 in ordine sequenziale.
NOTA: la frazione più in alto sarà dunque # 1, la frazione di fondo, # 12. StORE frazioni gradiente a 4 ° C. Gli esosomi purificati, che dovrebbero essere nelle frazioni 1-3 nella parte superiore del gradiente, sono stabili per 3-4 settimane se conservato a 4 ° C.
- Preparare le soluzioni 6% e il 18% del reagente iodixanolo, forniti come una soluzione al 60% in acqua, per diluizione in PBS. Pipettare 5,5 ml della soluzione di 18% nella camera agitata e pipettare 5,5 ml della soluzione al 6% nella camera serbatoio. Accendere l'agitatore, aprire il rubinetto, e consentire ogni sfumatura di fluire in una provetta da 14 ml ultracentrifuga.
3. Caratterizzazione Exosome
- (AChE) Attività Assay
- Preparare 100 mM substrato magazzino mescolando acetiltiocolina ioduro 28,9 mg in 1 ml di PBS 1X. Conservare substrato magazzino a -20 ° C fino a 1 mese.
- Preparare indicatore di colore 10 mM magazzino mescolando benzoico 39.6mg acido e bicarbonato di sodio 15 mg in 10 ml di PBS 1X. Indicatore di colore Conservare azione a 4 ° C fino a due settimane.
- Preparare reagente assay miscelando 1X PBS, substrato, e indicatore di colore in un rapporto di 100: 2: 5 (ad esempio, 10 ml 1X PBS + 200 + indicatore di colore 500 microlitri substrato microlitri).
- Trasferimento da 50 ml ciascuno 1,5 ml gradiente tubo frazione (etichettata 1-12, da procedura III.3) ai pozzetti di una microtite 96 pozzettipiatto r. Preparare i pozzetti in duplicato per ciascun campione di sfumatura.
- Preparare una serie di standard facendo prima un μU / ml AChE Stock 2000 in PBS. Fai undici (11) 2-diluizioni seriali di questo stock e aggiungere 50 ml di ogni diluizione di un singolo pozzo di una micropiastra, in modo che di serie # 1 = 2.000 μU / ml, # 2 = 1.000 μU / ml, # 3 = 500 μU / ml, ecc fino # 12 = 0.98 μU / ml. Le norme dodici AchE saranno quindi occupare una singola riga di una piastra di dosaggio 96 pozzetti.
- Aggiungere 200 pl di miscela reagente dosaggio in ciascun pozzetto ed incubare 20 min (al buio) a temperatura ambiente per consentire lo sviluppo del prodotto di reazione di colore. Misurare attività AChE alla lunghezza d'onda di 450 nm usando un lettore di micropiastre a fluorescenza.
NOTA: La percentuale di materiale di partenza che rimane dopo la purificazione exosome è valutata dal AchE dosaggio del plasma non frazionata.
- Analisi Immunoblot
- Proteine separate in frazioni gradiente 1-12 (da procedUre 2.1.3) mediante SDS-PAGE su 4-20% Tris-HCl gel prefabbricati a 100V x 1 ora. Trasferire proteine nel gel ad una membrana di nitrocellulosa utilizzando una cella di trasferimento elettro-blotting secondo le istruzioni del produttore. Lasciare i trasferimenti di cancellare per 12-16 ore (O / N) a 350V.
- Rimuovere la membrana dall'apparecchio blotting e lavare in Tris-Buffered Saline (TBS) per 5 min. Bloccare con il 5% senza grassi del latte a TTBS (TBS con 0,1% di Tween 20) per 1 ora a temperatura ambiente agitando.
- Incubare la membrana con anticorpi primari specifici per esosomi (CD9, CD45, CD63) o HIV-1 proteina del capside (p24) a 5% senza grassi del latte in agitazione a 4 ° C per 12-16 ore (O / N). Le diluizioni di anticorpi primari per immunoblots vanno da 1: 2.000 -1: 5.000.
- Lavare la macchia in TTBS per 20 minuti, seguita da incubazione con una diluizione 1: 2000 di perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-IgG (anticorpo secondario), in 5% di latte scremato per 1 ora a RT. Lavare la macchia 3 volte con TTBS, 10 minuti a lavaggio.
- Salvare le immagini come file TIFF che possono essere visualizzati in Adobe Photoshop. Eseguire l'analisi densitometrica delle bande utilizzando il software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
- Cytokine Assay
- Prima del test di citochine, interrompono complessi immuni che di solito sono presenti nel plasma umano mediante dissociazione acida e la lisi dei esosomi di trattamento detergente. Dosaggio entrambi i campioni di plasma di partenza e preparati exosome purificati.
- Per 100 ml di plasma umano aggiungere 100 microlitri 0,33 N HCL e incubare a 37 ° C per 1 ora. Aggiungere 100 ml 0,33 N NaOH per neutralizzare plasma acidato. Aggiungere esempi di Triton X-100 sia al plasma neutralizzato e exosome purificato, per un fila concentrazione finale di 1%, a causa lisi di esosomi.
- Per questo test (una procedura basata tallone-fluorescente), usano sfere magnetiche pre-rivestite con anticorpi da parte del produttore. Utilizzare un pannello custom-designed di perline anticorpi rivestite citochine anti-umani; elencati nella Tabella 1. Agitare le biglie magnetiche rivestite di anticorpo dal kit assay citochina per 30 secondi e aggiungere 50 microlitri perline a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da utilizzare nel dosaggio.
- Preparare una serie di diluizioni di norme in tampone standard plasma (sia contenuta nel kit di analisi di citochine) come descritto nel manuale di istruzioni del kit di analisi delle citochine, per generare una curva standard a 8 punti.
- Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio 1X (da kit) ad ogni pozzetto e lavare le perline con una rondella tallone magnetico, come descritto nel manuale. Aggiungere 25 microlitri tampone plasma (da kit) in ogni pozzetto. Aggiungere 25 ml di standard e dei campioni a tutti i pozzetti utilizzati nel test. Aggiungere 25 ml di plasmatampone campione di pozzetti di controllo negativo. Sigillare e agitare la piastra a 700 rpm per 60 minuti a temperatura ambiente e incubare O / N a 4 ° C.
- Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto e lavare la piastra (come al punto 3.3.4, di cui sopra). Aggiungere 25 ml di anticorpi di rilevamento in ogni pozzetto, guarnizione e agitare piastra a 700 rpm per 30 minuti a RT. Ripetere la fase di lavaggio.
- Aggiungere 50 ml di soluzione di streptavidina (SAPE, dal kit) in ogni pozzetto, guarnizione e agitare piastra a 700 rpm per 30 minuti a RT. Lavaggi piastra Ripetere come in 3.3.4.
- Aggiungere 120 ml di tampone di lettura (da kit) in ogni pozzetto e agitare su un tavolo di laboratorio agitatore a 700 rpm per 5 min a temperatura ambiente per permettere al segnale fluorescente di sviluppare. Leggere piastra sul lettore di piastre secondo le istruzioni del produttore.
- Al fine di tenere conto della quantità di esosomi perse durante la procedura di isolamento, utilizzare la seguente equazione: [(lettura volume originale / plasma) x 66,6 = lettura citochine regolata].
- Prima del test di citochine, interrompono complessi immuni che di solito sono presenti nel plasma umano mediante dissociazione acida e la lisi dei esosomi di trattamento detergente. Dosaggio entrambi i campioni di plasma di partenza e preparati exosome purificati.
4. Assay per potenziale immunomodulante
- Preparazione del terreno di coltura con Exosome impoverito siero fetale bovino
- Centrifuga 500 ml di siero fetale bovino (FBS) a 100.000 xg per 20 ore a 4 ° C a pellet contaminare esosomi e microvescicole. Rimuovere con cautela e salvare il exosome impoverito FBS surnatante. Eliminare il pellet in rifiuti a rischio biologico.
- Combina il 20% del exosome impoverito FBS surnatante con 500 ml di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) di media. Filtrare il mezzo attraverso un filtro a membrana da 0,45 micron.
- Aggiungere streptomicina (100 U / ml), penicillina (100 U / ml), L-glutammina (2 mM), soluzione salina HEPES-buffered (10 mM), e IL-2 (20 U / ml) al mezzo filtrato.
- Colture Cellulari e Exosome Esposizione
- Esporre esosomi a donatori periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) ottenute da volontari sani clinica. Sospendere PBMC inpreparato terreno di coltura e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule / particelle (secondo il metodo convenzionale del produttore).
NOTA: Il PBMC sono ottenuti durante la preparazione plasma sopra descritto (punto 1.2). - Usando il mezzo preparato dal procedimento 4.1.3, co-coltura 3.0 x 10 6 (PBMC) con 1 mg / ml di exosomes raccolti da tre (3) HIV-1 sieropositivi o da tre (3) HIV-1 sieronegativi individui in un totale volume di 1 ml in pozzetti di una piastra di coltura 12 pozzetti (con coperchio). Incubare culture per 48 ore a 37 ° C.
- Preparare colture non trattate PBMC e colture trattate con Concanavalina A (Con A, 5 mg / ml) per servire come controlli negativi e positivi, rispettivamente, come descritto sopra (4.2.2). Incubare tutte le culture PBMC per 48 ore a 37 ° C.
- Immediatamente prima raccolta delle cellule, preparare diluizioni dei seguenti anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi: Alexa Fluor 700-marcato anti-CD3 (1: 400 diluizione), allophycocyanin (APC) / cianinico 7 (Cy7) -labeled anti-CD4 (1: 400), peridinina proteina clorofilla complesso marcato anti-CD4 (1: 400), V450 marcato anti-CD8 (1: 400), biotin- etichettato anti-CD45RA (1: 1.000), ficoeritrina (PE) / Cy7-marcato anti-CD62L (1: 1.000), PE / cianina 5 (Cy5) -labeled anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- marcato anti-streptavidina (1: 2.000) e PE / Cy5 marcato controllo isotipico topo IgG1K (1: 200).
- Dopo il periodo di incubazione 48 ore, raccogliere il PBMC. Lavare PBMC in PBS per rimuovere esosomi e macchia le cellule mediante incubazione per 1 ora a 4 ° C con anticorpi individuali fluorocromi-tag. Analizzare il PBMC macchiata di citometria a flusso per quantificare l'espressione di chemochine (come descritto 21).
- Esporre esosomi a donatori periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) ottenute da volontari sani clinica. Sospendere PBMC inpreparato terreno di coltura e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule / particelle (secondo il metodo convenzionale del produttore).
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Representative Results
Esosomi vengono efficacemente purificati da HIV-1 plasma umano positivo. Isolato esosomi, identificate da acetilcolinesterasi (AChE), segregati in frazioni bassa densità 1-3 in cima gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali, identificate da HIV-1 dell'antigene p24 , segregata nelle frazioni ad alta densità (10-12, nella parte inferiore). La presenza di esosomi è stata ulteriormente confermata dalla individuazione di marcatori immunoblot exosome AChE, CD9, CD45, CD63 e, e mediante microscopia elettronica (Figura 2).
Citochine pro-infiammatorie e chemochine sono associati e significativamente elevati nei esosomi di HIV-1 soggetti sieropositivi. Exosomes depurato e plasma non frazionata da HIV-1 e HIV-infetti 1 individui sieronegativi sono stati analizzati per 21 citochine / chemochine mediante test multiplex. Tutti i 21 citochine / chemiokines sono stati individuati in esosomi isolati da HIV-1 individui positivi. Inoltre, i loro livelli erano significativamente elevati rispetto al plasma e esosomi da HIV-1 sieronegativi controlli (Tabella 1).
CD38 è stata aumentata sulla superficie delle cellule esposte a esosomi da HIV-1 individui sieropositivi. PBMC da non infetti donatori umani sono stati esposti per 48 ore a esosomi pool da HIV-1 sieropositivi o individui sieronegativi e valutati per i livelli di CD38 marcatore di attivazione su CD4 + e T-cellule CD8 + tramite citometria a flusso. Abbiamo osservato che da 48 ore post-esposizione, espressione CD38 sulla superficie della memoria ingenuo e centrale delle cellule CD4 + e CD8 + T sono state significativamente elevati in T-cellule esposte a esosomi da HIV-1 individui positivi, rispetto al trattamento exosome HIV-negativi e non trattati controlli (Figura 3).
Figura 1. Rappresentazione schematica di isolamento exosome da HIV-1 plasma umano positivo. (A) 10 ml di sangue periferico sono stati raccolti da HIV-1 seropositve e gli individui sieronegativi. (B) tubi di raccolta del sangue EDTA sono stati centrifugati a 1000 xg per 20 minuti a RT. (C) il plasma separato è stato trasferito a 50 ml provette coniche e diluito ½ con PBS 1x e (D) centrifugati 10.000 xg per 30 min. (E) Il supernatante è stato trasferito in un'ultracentrifuga tubi e (F) centrifugato a 10.000 xg per 2 ore. (G, H) Il supernatante è stato scartato e il pellet risospeso exosome e lavato in 1 ml di PBS 1X. (I) Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato scartato e il pellet risospeso in 1 ml 1x PBS e sovrapposti su 6-18% gradiente di velocità iodixanolo e (J) centrifugato a 250.000 g per 2 ore. (K) Dopo la centrifugazione, 1 ml frazioni dall'alto al basso del gradiente erano Transferred provette da 1,5 ml e analizzati per i contenuti AChE e analisi immunoblot. (L) Frazioni 2 e 3 erano quelle combinate e diluita con 4 ml di PBS 1X e (M) centrifugata a 400.000 xg per 2 ore. (N) Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato scartato e il pellet risospeso in 1 ml di PBS 1X per l'analisi di citochine e chemochine espressione pro-infiammatoria. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Esosomi vengono efficacemente purificati da plasma umano. Iodixanolo individuale velocità gradiente frazioni provenienti da individui HIV-sieropositivi o sieronegativi sono stati sottoposti a (A) saggio enzimatico per acetilcolinesterasi (AChE), e (B) Western blot per i marcatori exosomal CD9, CD45, e CD63 e proteina p24 virale e sono (C) immunolabeled con anti-CD63 ed esaminati con microscopia elettronica per confermare preparazione di exosomes purificati (C). (Figura da Konadu et al, 2014 21, utilizzato con il permesso). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Assay per potenziale immunomodulante. PBMC da HIV-1 individui sieronegativi sono stati esposti a entrambi i pool esosomi dal plasma del virus HIV-1 sieropositivi (HIV + Exo) o sieronegativi (HIV Exo) gli individui, non trattata, o trattati con 5 mcg / ml di Concanavalina A (Con A) come controllo positivo. Dopo 48 ore di esposizione, Naïve (CD45RA + / CD62L +), centrale (TCM; CD45RA- / CD62L +) e effettrici (TEM; CD45RA- / CD62L-) Memoria CD4 + e T-cellule CD8 + sono stati analizzati per l'espressione di CD38 mediante citometria di flusso. Concentrazione Exosome stata normalizzata proteine totali e ha aggiunto a 1 mg / ml. Barre di errore rappresentano media +/- SEM di sei donatori indipendenti. Differenza tra i gruppi sono stati testati per la significatività statistica dalla Via ANOVA test Uno. * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figura da Konadu et al, 2014 21,, utilizzato con il permesso). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Analisi di esosomi purificati e plasma intero da HIV-1 sieropositivi e individui sieronegativi per citochina proinfiammatoria e di espressione delle chemochine. P <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0,0001. (Figura da Konadu et al, 2014 21, utilizzato con il permesso). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Attivazione cronica del sistema immunitario (CIA) e l'esaurimento delle cellule T CD4 + sono due importanti caratteristiche di HIV-1. Essi sono stati istituiti come predittori di patogenesi, con CIA essere il miglior predittore. Tuttavia, i meccanismi alla base di guida attivazione immunitaria cronica sistemica e il declino delle cellule CD4 + T ancora non sono stati completamente chiariti. Noi e altri laboratori hanno sviluppato prove certe che esosomi secreti da HIV-1 le cellule infettate giocano un ruolo in entrambi i tratti distintivi.
Il continuo interesse sia nella composizione e la funzione di vescicole extracellulari ha portato alla pubblicazione di vari metodi per l'isolamento exosome da entrambi i mezzi di coltura cellulare e fluidi biologici 24-26. Tuttavia, una barriera per indagare il ruolo di esosomi in HIV-1 patogenesi è stata la separazione efficiente di esosomi da HIV-1 particelle pur mantenendo la capacità di indagare sia contenuto exosome e attività funzionale. Abbiamo sviluppato un protoil col di purificazione di esosomi da HIV-1 particelle nel plasma umano, utilizzando gradienti di velocità iodixanolo. I donatori sieropositivi utilizzati in questo studio non avevano ricevuto trattamento antiretrovirale e dei campioni di plasma utilizzate per questi esperimenti contenuti da 1500 a 400.000 particelle di virus / mL con una media di 206.000 particelle virali / ml 21. Così, abbiamo dimostrato che exosomes nel plasma di HIV-1 individui infetti possono essere separati in modo efficiente da particelle HIV-1 virus, anche se i carichi virali sono elevati. Anche se di dimensioni simili e la densità, esosomi segregati nei bassa densità / frazioni superiori dei gradienti iodixanolo rispetto a particelle virali, che segregati in ad alta densità / frazioni inferiori. Gli esosomi preparate con il metodo del gradiente iodixanolo sono altamente purificato e privo di proteine contaminanti extracellulari. La purezza del esosomi popolazione isolata è stata confermata con p24 ELISA e Western blot per l'HIV-1 p24 proteine del capsidecosì come l'analisi occidentale per i marcatori exosomal, dolore, CD9, CD45, CD63 e. L'utilizzo di questi marcatori è coerente con le linee guida recentemente pubblicate per l'identificazione exosome 27.
Fisiologicamente più rilevanti per l'attivazione immunitaria, sono stati trovati i exosomes purificati da HIV-1 individui infetti per contenere citochine / chemochine a concentrazioni significativamente superiori rispetto esosomi da HIV-1 controlli sieronegativi. Inoltre, esosomi da HIV-1 individui infetti erano biologicamente attivo, esibendo la capacità di indurre un aumento dei livelli del marcatore di attivazione, CD38, sulla superficie delle cellule di memoria centrale e naive CD4 + e CD8 + T. Collettivamente, questi dati suggeriscono un meccanismo che potrebbe guidare l'attivazione immunitaria persistente durante l'infezione da HIV.
I risultati che sono stati in grado di ottenere con il nostro processo di purificazione exosome, che combina centrifugazione differenziale e iodixanolo separazione gradiente di velocità mostrano il valoredi utilizzare esosomi altamente purificate per saggi biologici fisiologici e funzionali. La procedura non ha alcuni ostacoli e limitazioni. Una quantità considerevole di esosomi, spesso la maggioranza del materiale di partenza come calcolato dalla misurazione dell'attività AChE, vengono persi durante il processo. Inoltre, la procedura è anche tempo e richiede l'accesso alle apparecchiature costose. Infine, la generazione dei gradienti iodixanolo utilizzando l'apparato fromer gradiente richiede notevole pratica di garantire la riproducibilità. Un metodo alternativo per la generazione gradiente potrebbe essere quello di preparare una serie graduata di soluzioni iodixanolo, seguita da un'attenta stratificazione delle soluzioni in provette da centrifuga e incubando O / N per permettere ai gradienti di formare. Tuttavia, non abbiamo testato questa alternativa.
Il protocollo sperimentale descritto qui per l'isolamento e la separazione di esosomi da HIV-1 particelle nel plasma umano è un metodo efficace per garantire la purezza di exosomes. L'utilizzo di questo metodo ha portato a strade interessanti per il futuro inchiesta sul ruolo di esosomi HIV-1 patogenesi e potrebbe ugualmente essere utilizzate nelle indagini per altri processi biologici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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