Abstract
Eksozomlar hücre tipleri çok çeşitli hem yapısal olarak ve uyarım üzerine salınan olan 30 nm ile 100 nm arasında değişen büyüklükte küçük veziküllerdir. Bunlar, biyolojik sıvılarla bir dizi bulunmuştur ve bu proteinler, lipidler ve nükleik asit molekülleri, çeşitli taşıdığı bilinmektedir. Başlangıçta hücresel enkaz için rezervuarların daha az biyolojik süreçleri düzenleyen eksozom ve hastalıkları rolleri giderek takdir edilmektedir olduğu düşünülen.
Çeşitli yöntemler, hücresel kültür ortamı ve biyolojik sıvılardan izole etmek için eksozomlar tarif edilmiştir. Nedeniyle, küçük boyut ve düşük yoğunluk, ayırıcı ultra-santrifüj ve / veya ultra filtre eksozom izolasyonu için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, HIV-1 bulaşmış kişilerin plazma büyüklüğüne ve yoğunluğuna içindeki hem eksozomlar ve HIV viral partikülleri içerir. Bu nedenle, insan plazmasında HIV viral parçacıklardan eksozom etkin ayrılması olmuşturmeydan okuma.
Bu sınırlama gidermek için, Cantin et tadil edilen bir prosedür geliştirilmiştir. al., insan plazmasında HIV parçacıklardan eksozom saflaştırılması için 2008. Iyodiksanol gradyanları hızı, HIV-1 pozitif bireylerin plazmasındaki HIV-1 parçacıklardan eksozomlar ayırmak için kullanıldı. Virüs partikülleri p24 ELISA ile tespit edilmiştir. Eksozomlar eksozom belirteçleri asetilkolinesteraz temelinde (AChE) ve CD9, CD63, ve CD45 antijenleri üzerinde belirlenmiştir. Bizim degrade prosedürü virüs parçacıklarının serbest eksozom hazırlıklarını vermiştir. Insan plazmasından eksozomlann verimli arıtma plazma türevi eksozom içeriğini incelemek ve bağışıklık düzenleyici potansiyeli ve diğer biyolojik fonksiyonlarını araştırmak sağladı.
Introduction
HIV-1 salgını dünya çapında önemli bir etkiye sahip devam ediyor. 2013 yılı itibariyle, dünya genelinde yaklaşık 35 milyon kişi HIV ile yaşadığı ve bunlardan 2,1 milyon yeni enfekte bireyler 1 idi. Önleme stratejileri ve antiretroviral tedaviye artan erişim HIV genel edinimini azaltmada yararlı olmuştur. Ancak, bireysel popülasyonları halen HIV 1 edinimi yükselir yaşıyoruz. Bu nedenle, bu salgının ele almaya devam çabaları için bir ihtiyaç vardır.
HIV hastalığın ilerlemesi güçlü belirleyicileri biri kronik immün aktivasyon (CIA) 2-10 olduğunu. Saptanabilir sitokinler ve T lenfositlerinin yüzeyinde yükseltilmiş ifade belirteçleri sürekli olarak yüksek seviyelerde tarafından tanımlanan, CIA sanılıyor: Ben 11 IFN Tip i) sürekli dendritik hücre üretimi; HIV proteinleri Tat, Nef ve gp120 12 tarafından tahrik edilen, (ii) direkt immün aktivasyon; (iiiGut ilişkili bağışıklık hücreleri 6 bakteriyel proteinlerin) translokasyonu. Ancak, tam mekanizması (ler) altında yatan kronik HIV enfeksiyonu sistemik bağışıklık aktivasyon tam olarak aydınlatılamamıştır beklemektedir.
Araştırma grubumuz ve diğerleri HIV patogenezinde 15-18 yılında eksozomlann rol göstermiştir. Bizim grup Nef proteini eksozom 15, enfekte hücrelerden salgılanan olduğunu belirlemiştir ve exosomal Nef (exNef) nanogram seviyeleri 18 HIV bulaşmış kişilerin plazmasında mevcut bulunmaktadır. Bu alternatif olarak, monosit / makrofajlar exNef kaynaklı apoptosise karşı kolay işlenemezdir. ExNef maruz CD4 + T-hücreleri, CXCR4 yolunun 19, 20 bağlıdır aktivasyonu ile indüklenen hücre ölümü sonuçlandı oradan geçmekte göstermiştir, fakat değiştirilmiş hücresel fonksiyonları ve sitokin ekspresyonunu sergilemişlerdir. HIV ile infekte olmuş bireylerin plazmasındaki izole Son zamanlarda, bir grup göstermiştir eksozomlar pro-enflamatuar sitokinlerin çeşitli içerir. Further, saf ve merkezi bellek CD4 + ve CD8 + T hücreleri üzerinde CD38 ekspresyonunu indüklediği HIV bulaşmış hastalarda plazma türevi eksozom maruz saf periferal kan tek-çekirdekli hücreleri. Bu büyük olasılıkla sistemik inflamasyon ve seyirci hücre aktivasyonu 21 üzerinden viral yayılma katkıda bulunur ve eksozomlar HIV patogenezinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.
HIV patogenezinde eksozomlann rolünü araştıran, bir meydan HIV parçacıklar verimli ayrı eksozomlar exosomal içeriği korurken yanı sıra işlevsel immün modülatör yeteneği teknikleri geliştiriyor. Çeşitli yöntemler, hücre kültürü ve biyolojik sıvılarda 22,23 den eksozomlar izole etmek için tarif edilmiştir. Çünkü küçük boyutları ve düşük yoğunluklu (eksozomlar 1.15 yoğunluğunda yüzer - 1.19 g / ml), ayırıcı ultrasantrifüjleme ve / veya ultrafiltrasyon eksozom izolasyonu 23 için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir.Bununla birlikte, HIV ile infekte olmuş hücre kültürü süpernatanları, hastaların plazma eksozomlar ve HİV-1 virüs partiküllerini içerir. Eksozomlar ve HİV-1 parçacıkların boyutu ve yoğunluğu açısından oldukça benzerdir. Seçenek olarak ise, örneğin CD63, CD45 ve CD81 gibi benzersiz exosomal markerlerin ekspresyonu yararlanarak, eksozomlar immünoafinite yakalama yöntemleri 23 kullanılarak izole edilmiştir. Bu prosedür eksozom virüsü ayırabilirsiniz. Bununla birlikte, bu tekniğin dezavantajı, kültür eksozomlann bağışıklık potansiyelinin değerlendirilmesi ile etkileşime girebilir saflaştırılmış eksozom, antikorların sıkı ektir.
Bu sınırlamaları için, iyodiksanol gradyanları kullanılarak hızı HIV Cantin modifiye insan plazması içinde parçacıklar ve arkadaşları 22 eksozomlann saflaştırılması için bir yöntem geliştirdi. Virüs parçacıkları yüksek- içinde ayrılmış oysa eksozomlar, düşük yoğunluk iyodiksanol geçişlerini / üst fraksiyonları ayırmak bulunduyoğunluk / düşük kesirler. Virüs partikülleri p24 ELISA ile belirlenmiştir ve eksozomlar eksozom işaretleri AChE, CD9, CD63, ve CD45 ile tespit edilmiştir. Toplanan üst düşük yoğunluklu parçacıkları HİV-1 p24 kirlenme için negatifti eksozomlar ihtiva etmiştir. Insan plazması HIV parçacıklardan eksozom etkin bir biçimde saflaştırılabilir ve ayırma insan plazması gibi bağışıklık modülatör potansiyelinin incelenmesi ve HIV-1 patojenezinde eksozom tanısal ve prognostik değerinden türetilen bir eksozom içeriği doğru inceleme sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Exosome izolasyon ve saflaştırma prosedürü genel bir diyagram Şekil 1'de verilmiştir. Tüm kan sağlıklı gönüllü donörlerden ve Emory Üniversitesi'nden Umut Kliniği ve Grady Sağlık Sistemi Bulaşıcı Hastalık Programı katılıyor antiretroviral theraoy almayan HIV pozitif bireylerin elde edilmiştir Atlanta, Georgia. Bu çalışma Emory Üniversitesi Tıp Morehouse Okulu kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır. Çalışmaya katılan tüm kişilerin yazılı ve bilgilendirilmiş onam formu.
Kan Plazma eksozomlann hazırlanması 1.
- İnsan Kan Toplama ve İşleme
- (18 mg potasyum EDTA ihtiva eden) EDTA kan toplama tüpleri içinde damar delme ile periferal kanın 10 ml toplamak ve hafifçe karıştırın beş kez ters çevirin.
- Kan hücreleri topaklamak üzere oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 x g'de, kan toplama tüpleri santrifüjleyin. Steril pipeti kullanınte 25 ml'lik konik tüp plazma kısmını (4-5 ml) aktarmak için. 1 x 10 ml PBS ile plazma seyreltin. Biohazard atıklar için uygun işaretli kapta (aynı zamanda PBMC'de olarak bilinen kırmızı kan hücreleri, beyaz hücreler) kan hücrelerini atın.
Not: enfekte edilmemiş verici kan örnekleri durumunda, PBMC, daha fazla kullanım (aşağıdaki prosedür IV.2 bakınız) için ayrılmış olabilir. - Kısa vadede (2-3 gün) veya daha uzun süreli saklama için -80 o C'de 4 o C'de plazma örnekleri saklayın.
NOT: Daha fazla işlemeden önce 4 o C herhangi donmuş plazma örnekleri getirin.
- Plazma Exosome Kesir hazırlanması
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin plazma hücre tortularım çıkartmak için. Temiz bir 25 ml'lik ultrasantrifüjdeki tüp temizlenir plazma süpernatant aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Biohazard konteyner pelet atın.
- 2 100,000 xg'de temizlenir plazma santrifüj4 ° C'de saat büyük kesecikler kaldırın. Pipetle dikkatli 100.000 xg Süpernatantı ve biyolojik tehlike atıklar atın. Temiz bir tüp içinde 1X PBS 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yavaşça çıkarmak ve ayrı partiküller dönen, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- PBS 25 ml ilave etmek suretiyle süspansiyon haline 100,000 x g eksozom / virüs pelet yıkayın. Yavaşça, sonra karışımı 4 ° C 'de 2 saat boyunca 100,000 x g hızında tekrar santrifüj tüpü, beş kez ters çevirin. Biyolojik tehlikeli atık kabı PBS yıkama solüsyonu atın.
- 1 x PBS, 1 ml 100,000 x g pelet yeniden süspanse edin ve yerinden ve pelet çözmek için hafifçe dönen 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
NOT: iyodiksanol gradyan aşamasına kadar 1-2 gün süreyle 4 ° C 'de, eksozomlar ve virüs parçacıkları içeren, iyodiksanol gradyan doğrudan ilgili adıma pelet saklamak mümkün değilse.
Eksozom 2. saflaştırılması
- % 6 -18% veloc üretBir iki odacıklı degrade eski cihazı kullanılarak iyodiksanol bir Sığ gradiyentleri.
- PBS içinde seyreltilerek, su içinde% 60 çözelti olarak temin iyodiksanol reaktifi% 6 ve% 18 çözümleri hazırlayın. Pipet 5,5 karıştırıldı odasına 18% çözelti ml ve pipet depolama haznesine% 6 çözeltisi 5.5 mi. , Karıştırıcı açın musluğunu açık ve her gradyan, 14 ml ultra santrifüj tüpüne akmasına izin verir.
NOT: hemen kullanın veya kullanmadan önce 4 ° C'de hazırlanan degradeler O / N saklamak ya. - Dikkatle her 11 ml degrade üst kısmına eksozom / virüs çözümü 1 ml katman. Bir SW40Ti sallanan bir kova rotor kullanılarak 4 ° C 'de 2 saat için 250,000 x g'de santrifüjleyin gradyanlar.
- On iki (12), 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. Degrade üstünden 1.0 ml çıkarın ve tüp 1. transfer. Sırayla tüpleri 2-12 kalan 1ml kesirler aktarın.
NOT: En üstteki kısım böylece 1. alt kısmı, 12. olacaktır. St4 ° C 'de gradyan fraksiyonları yardımcı olmaktadır. 4 ° C'de depolanan gradyan üstündeki fraksiyonları 1-3 olmalıdır saflaştırılmış eksozomlar, 3-4 hafta boyunca stabildir.
- PBS içinde seyreltilerek, su içinde% 60 çözelti olarak temin iyodiksanol reaktifi% 6 ve% 18 çözümleri hazırlayın. Pipet 5,5 karıştırıldı odasına 18% çözelti ml ve pipet depolama haznesine% 6 çözeltisi 5.5 mi. , Karıştırıcı açın musluğunu açık ve her gradyan, 14 ml ultra santrifüj tüpüne akmasına izin verir.
3. Exosome Karakterizasyonu
- Asetilkolinesteraz (AChE) Aktivite Deneyi
- 1X PBS, 1 ml asetiltiyoklolin iyodür 28,9 mg karıştırılarak 100 mM substrat stok hazırlayın. 1 ay -20 ° C de saklayınız substrat stoku.
- 1X PBS, 10 ml benzoik asit 39.6mg ve sodyum bikarbonat 15 mg karıştırılarak 10 mM renk göstergesi stok hazırlayın. Iki hafta 4 ° C'de saklayın renk göstergesi hisse senedi.
- (Örneğin, 10 mi 1X PBS + 200 ul substrat + 500 ul renk indikatörü) 5: 2: 100 bir oranda karıştırma 1X PBS, alt-tabaka ve renk göstergesi ile analiz reaktifi hazırlayın.
- Bir 96-yuvalı microtite kuyularına Transferi (III.3 prosedürü ile ilgili, 1-12 etiketli), her 1.5 ml gradyan fraksiyon tüpten 50 ulr plakası. Her degrade numune için yinelenen kuyu hazırlayın.
- İlk PBS içinde 2000 μU / ml AChE stok yaparak bir dizi standardı hazırlayın. Yap on (11) 2-kat, bu stoklar seri dilüsyonları ve bir mikrotiter plakasının bir tek oyuğuna her seyreltme 50 ul, böylece standart # 1 = 2000 μU / ml, # 2 = 1.000 μU / ml, # 3 = 500 μU / ml, vb # 12 = 0.98 μU / ml kadar. On iki AChE standartları, böylece, 96 oyuklu bir deney plakasının bir tek sıra kaplayacaktır.
- Her bir deney reaktif karışımı 200 ul de ekleyin ve renkli reaksiyon ürününün gelişimi sağlamak için oda sıcaklığında (karanlıkta) 20 dakika inkübe edilir. Bir flüoresan mikro levha okuyucusu kullanarak 450 nm'lik bir dalga boyunda AChE aktivitesi ölçülür.
Not: eksozom saflaştırmadan sonra, başlangıç materyali kaldığını yüzdesi bölünmemiş plazma AChE testi ile değerlendirilir.
- İmmünoblot Analizi
- Proced gradyan fraksiyonları 1-12 Ayrı proteinler (100V x 1 saat sonra% 4-20 Tris-HCI prefabrik jel üzerinde SDS-PAGE ile ure 2.1.3). Üreticinin talimatlarına göre bir elektro-lekeleme aktarım hücresi kullanılarak bir nitroselüloz zara jelde proteinleri aktarın. Transferler 350V de 12-16 saat (O / N) için leke izin verin.
- Lekeleme aparatı membranı çıkarın ve 5 dakika boyunca Tris tamponlu tuz (TBS) içinde yıkayın. Oda sıcaklığında çalkalanarak 1 saat boyunca (% 0,1 Tween 20 ile TBS) TTBS içinde% 5 yağsız süt ile bloke edin.
- 12-16 saat (O / N), 4 ° C de çalkalanarak% 5 yağsız süt içinde eksozomlann (CD9, CD45, CD63) veya HIV-1 kapsid proteini (p24) için spesifik primer antikorlar ile membran inkübe edin. Imüno için birincil antikor seyreltileri olarak 1: 2000 -1: 5000.
- 1 ile enkübasyonu takiben, 20 dakika boyunca TTBS içinde blot yıkayın: yaban turpu peroksidazı (HRP) ve 2000 seyreltme, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız süt içinde, anti-IgG (sekonder antikor) ile konjüge edilmiş. Leke TTBS ile 3 kez, yıkama başına 10 dk yıkayınız.
- Adobe Photoshop izlenebilir TIFF dosyaları olarak görüntüleri kaydedin. ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanarak bantların dansitometri analizi yapın.
- Sitokin Deneyi
- Sitokin deneyi öncesinde, asit ayrışma tarafından, insan plazmasının içinde mevcuttur, deterjan muamelesi ile eksozomlar lize immün kompleksleri bozabilir. Tahlil hem başlangıç plazma örnekleri ve arıtılmış eksozom hazırlıkları.
- Insan plazması, 100 ul için 100 ul 0,33 N HCL ilave edin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Asit ile muamele edilmiş plazma nötralize etmek için 100 ul 0,33 N NaOH ekleyin. Bir fi, Triton X-100 nötralize plazma ve saflaştırılmış eksozom her iki numunenin ekleme% 1 nal konsantrasyonu eksozomlann lizizine neden olmak için.
- Bu deneyde (floresan bir boncuk esaslı prosedür) için, manyetik boncuk üretici tarafından antikorlar ile önceden kaplanmış kullanır. Anti-insan sitokin antikor kaplı boncuk özel tasarlanmış panelini kullanın; Tablo 1 'de listelenmiştir. 30 sn için sitokin deney kiti, antikor kaplı manyetik boncuklar Vortex ve deneyde kullanılmak üzere 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 ul boncuk ekleyin.
- 8 noktalı bir standart eğri oluşturmak için, sitokin deneyi kiti için kullanım kılavuzunda tarif edildiği gibi plazma, standart tampon (sitokin deneyi kitin içerdiği her ikisi) standartların bir seyreltme serisi hazırlanır.
- El kitabında açıklandığı gibi, her bir kuyucuğa (kit) 1X yıkama tamponu 150 ul eklenir ve manyetik boncuk yıkayıcı kullanılarak boncuk yıkayın. Her bir kuyunun (kit) 25 ul plazma tahlil tamponu ekleyin. Deneyde kullanılan tüm oyuklara standartlar ve numuneler 25 ul ekle. Plazma 25 ul eklenegatif kontrol oyuklarına örnek tamponu kaplandı. Kapatın ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 700 rpm'de sallamak plaka ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
- Her bir oyuğa 1X yıkama tamponu 150 ul ilave edin ve (yukarıdaki aşama 3.3.4 gibi) plakayı yıkayın. Her bir oyuğa, conta içine tespit antikorlarının 25 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm'de plaka sallayın. Yıkama işlemi tekrarlayın.
- Her bir oyuğa, conta içine (kit SAPE) streptavidin çözeltisi 50 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 rpm'de plaka sallayın. 3.3.4 gibi tekrarlayın plaka yıkar.
- Flüoresan sinyal geliştirmesine imkan vermek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 rpm'de bir masa laboratuar karıştırıcısı üzerinde her birine (kit) okuma tamponu 120 ul de ekleyin ve sallayın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir levha okuyucu üzerinde plaka okuyun.
- Izolasyon prosedürü sırasında kaybedilen eksozom miktarı için hesap şu denklemi kullanmak için: [(orijinal okuma / plazma hacmi) 66.6 = düzeltilmiş sitokin okuma x].
- Sitokin deneyi öncesinde, asit ayrışma tarafından, insan plazmasının içinde mevcuttur, deterjan muamelesi ile eksozomlar lize immün kompleksleri bozabilir. Tahlil hem başlangıç plazma örnekleri ve arıtılmış eksozom hazırlıkları.
İmmünomodülatuar Potansiyeli 4. Testi
- Eksozom-tükenmiş Fetal Sığır Serumu, kültür ortamının hazırlanması
- Santrifüj 4 ° C 'de 20 saat süre ile 100,000 x g'de fetal sığır serumu (FBS), 500 mi eksozomlar ve microvesicles kirletici: pelet. Dikkatle çıkarın ve eksozom tükenmiş FBS süpernatant kaydedin. Biohazard atık pelet atın.
- Roswell Park Memorial Institute 1640 500 ml (1640 RPMI) ortam ile eksozom tükenmiş FBS süpernatant% 20 birleştirin. 0.45 um'lik bir membran filtresinden orta filtre.
- Süzüldü ortama streptomisin (100 U / ml), penisilin (100 U / ml), L-glutamin (2 mM), HEPES-tamponlu tuzlu su çözeltisi (10 uM) ve IL-2 (20 U / ml) eklenir.
- Hücre Kültürü ve Exosome Pozlama
- Sağlıklı gönüllülerden elde klinik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için eksozomlar Açığa. PBMC'nin Askıyakültür ortamı hazırlanır ve (imalatçının standart bir yönteme göre) hücre / partikül sayacı kullanarak hücreleri sayın.
Not: PBMC (1.2 adım a), yukarıda tarif edilen plazma hazırlanması sırasında elde edilir. - Prosedür 4.1.3 den hazırlanan ortam maddesi kullanılarak, ko-kültür 3,0 x 10 6 toplanan eksozom 1 ug / ml (hücre) üç (3), HIV-1 seropozitif ya da üç (3), HIV-1 seronegatif kişilerin bir toplam (kapak ile) 12-yuvalı kültür plakasının yuvaları içinde 1 ml hacmi. 37 ° C 'de 48 saat süre ile kültür inkübe edin.
- Konkanavalin A ile muamele edilmiş tedavi edilmemiş PBMC kültürleri ve kültürleri hazırlanması (Con A; 5 ug / ml) (4.2.2), yukarıda tarif edildiği gibi, sırasıyla, negatif ve pozitif kontrol hizmet vermektedir. 37 ° C 'de 48 saat boyunca, tüm PBMC kültürleri inkübe edin.
- Alexa Fluor 700-etiketli anti-CD3 (1: 400 seyreltme), allophycocy hemen önce hücrelerin hasat için aşağıdakileri florokrom-eşlenik monoklonal antikorlar dilüsyonları hazırlamak(1: 400), V450-etiketli anti-CD8, Biotin: klorofil protein kompleksi,-etiketli anti-CD4 (400 1) peridinin: anin (APC) / siyanin 7 (Cy7), anti-CD4 (400 1) -etiketli anti-CD45RA (1: 1000) etiketli, fikoeritrin (PE) / anti-CD62L (1: 1000), Cy7-etiketli, PE-Texas Kırmızı-, PE / siyanin 5 (Cy5), anti-CD38 (200 1) -etiketli etiketli anti-streptavidin (1: 2000) ve PE / Cy5 etiketli fare IgG1K izotip kontrol (1: 200).
- 48 saatlik bir bekletme süresinden sonra, PBMC hasat edilir. PBS yıkama PBMC bağımsız florokrom etiketli antikorlar ile 4 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edilerek hücreler eksozomlar çıkarın ve leke. (21 tarif edildiği gibi) kemokin ifadesinin miktarını belirlemek için akış sitometrisi ile boyanmış PBMC analiz edin.
- Sağlıklı gönüllülerden elde klinik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için eksozomlar Açığa. PBMC'nin Askıyakültür ortamı hazırlanır ve (imalatçının standart bir yönteme göre) hücre / partikül sayacı kullanarak hücreleri sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksozomlar verimli, HIV-1 pozitif insan plazmasından saflaştırılır. Asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi tarafından tanımlanan izole edilmiş eksozomlar, HIV-1 antijen, p24 tarafından tanımlanan virüs partiküllerinin, oysa iyodiksanol gradyanları üstündeki daha düşük yoğunluklu fraksiyonları 1-3 ayrılmış (alt kısmına yakın, 10-12), daha yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda ayrılmış. Eksozom varlığı daha eksozom belirteçlerinin AChE, CD9, CD45, CD63 ve ve elektron mikroskobu ile (Şekil 2) immunoblot belirlenmesiyle teyid edilmiştir.
Pro-inflamatuar sitokinler ve kemokinler ile ilişkili olan ve önemli ölçüde, HIV-1 seropozitif bireylerin eksozomlann yükselmiştir. Saflaştırılmış eksozomlar olan ve olmayan plazma HIV-1 ile enfekte edilmiş ve HIV-1 seronegatif kişilerin çoklu deney ile 21 sitokinler / kemokinler için analiz edilmiştir. Tüm 21 sitokinler / kemokines HIV-1 pozitif bireylerden izole eksozom tespit edilmiştir. HIV-1 seronegatif kontrollerden (Tablo 1) plazma ve eksozom kıyasla Ek olarak, seviyeleri önemli ölçüde yükselmiştir.
CD38 ekspresyonu, HIV-1 seropozitif bireylerden eksozomlann maruz kalan hücrelerin yüzeyi üzerinde artmıştır. Enfekte edilmemiş insan donörlerden alınan PBMC'ler ile ilgili aktivasyon markeri CD38 seviyeleri için, HIV-1 seropozitif ve seronegatif bireylerden bir araya getirilmiş eksozom 48 saat süre ile maruz kalan ve değerlendirildi CD4 + ve akış sitometrisi ile CD8 + T-hücreleri. Bu gözlenen 48 saat maruziyet sonrası, CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin önemli ölçüde HIV negatif eksozom tedavisi ve muamele edilmemiş a kıyasla, HIV-1 pozitif bireylerden eksozomlann maruz bırakılan T hücreleri yüksek bulundu saf ve merkezi bellek yüzeyi üzerinde CD38 ekspresyonu ile kontroller (Şekil 3).
HIV-1 pozitif insan plazmasından eksozom izolasyonu 1. şematik gösterimi Şekil. (A), periferal kanın 10 ml 'HIV-1 seronegatif kişilerin seropositve ve toplanmıştır. (B) EDTA kan toplama tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjlenmiştir. (C), plazma ayrılmış 1x PBS ve (D), yarım 50 ml konik bir tüp transfer seyreltildi, 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj edilir. (E) süpernatan tüpleri ultrasantrifüj aktarılır ve (F) 2 saat süre ile 10,000 x g'de santrifüjlendi. (G, H) Yüzey maddesi atıldı ve eksozom pelet yeniden süspansiyon haline getirildi ve 1X 1 ml PBS içinde yıkanır. Santrifüj sonrasında (I) 'in yüzey maddesi atıldı ve pelet, PBS 1x 1 ml yeniden süspansiyon haline getirildi ve 2 saat boyunca 250,000 x g'de santrifüje tabi 6-18% iyodiksanol hızı gradyanı ve (J) üzerine yerleştirilmiş. Santrifüj sonrasında (K), gradyanın üstten alta 1 ml'lik kısımlar tra edildi1.5 ml tüplere nsferred AChE içeriği ve immunoblot analizi için analiz edilmiştir. (L) fraksiyonlar 2 ve 3 den edildi birleştirildi ve 1X PBS ve 2 saat 400,000 x g hızında santrifüjlendi (M), 4 ml ile sulandırıldı. (N) Santrifüj sonrasında, süpernatan atıldı ve pelet, pro-enflamatuar, sitokin ve kemokin ifadesi analizi için 1X PBS içinde 1 ml yeniden süspansiyona alınmıştır. Bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın.
Şekil 2. Eksozomlar şekilde insan plazmasından saflaştırılır. HlV-seropozitif ve seronegatif kişilerin Bireysel iyodiksanol hız gradyanı fraksiyonlar (A) 'asetilkolinesteraz için enzimatik analiz (AChE) ve exosomal belirteçleri CD9, CD (B) Western blot analizine tabi tutulmuştur45, CD63, virüs protein p24 ve idi (C) anti-CD63 ile birlikte imüno-ve saflaştırılabilir eksozom (C) 'nin hazırlanmasını teyit etmek için elektron mikroskopi ile incelenir ve. (Izinle kullanılan Konadu ve ark, 2014 21, gelen Şekil). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bağışıklık Değişim Potansiyel Şekil 3. tahlilinden. PBMC, HIV-1 seronegatif kişilerin, HIV-1 seropozitif plazmasında (HIV + Exo) ya da seronegatif toplanan eksozom birine muamele edilmemiş (HIV EKZO) bireyler, sol maruz kaldıklarında ya da tedavi edilen 5 ug / Bir pozitif kontrol olarak, Concanavalin A ml (Con A). 48 saat maruz kaldıktan sonra, Naif (CD45RA + / CD62L +), Orta (TCM; CD45RA- / CD62L +) ve Efektör (TEM; CD45RA- / CD62L-) Hafıza CD4 + ve CD8 + T hücreleri akış sitometrisi ile CD38 ifadesi için analiz edildi. Eksozom konsantrasyonu, toplam protein normalize edildi ve 1 ug / ml'de ilave edildi. Hata çubukları +/- ortalama temsil eden altı bağımsız donörlerin SEM. Gruplar arasındaki fark One Way ANOVA Testi istatistiksel olarak anlamlı açısından test edilmiştir. * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001. (Izinle kullanılan Konadu ark gelen Şekil, 2014 21). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Pro-enflamatuar sitokin ve kemokin ifadesi için saflaştınldı eksozom ve HİV-1 seropozitif gelen bütün plazma ve seronegatif kişilerin Tablo 1. Analiz. * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, **** p <0.0001. (Izinle kullanılan Konadu ve ark, 2014 21, gelen Şekil). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronik immün aktivasyon (CIA) ve CD4 + T hücresi kaybı, HIV-1 enfeksiyonunun iki önemli özellikleridir. Onlar CIA iyi belirleyicisi olmak, patogenezi için belirleyicileri olarak kurulmuştur. Ancak, kronik sistemik immün aktivasyon ve CD4 + T hücre düşüş sürüş altında yatan mekanizmaları hala tam olarak ortaya konamamıştır. Bu ve diğer laboratuar HIV-1 ile enfekte hücrelerden salgılanan eksozomlar iki özelliklerinden önemli bir rol oynadığını sağlam kanıtlar geliştirdik.
Hem terkip hem de hücre dışı veziküllerin fonksiyonunda devamlı bir ilgi hücre kültür ortamı ve biyolojik sıvıların 24-26 hem eksozom izolasyonu için çeşitli yöntemlerin yayın yol açmıştır. Eksozom içeriği ve fonksiyonel aktivitesini araştırmak için yeteneğini korurken Bununla birlikte, HIV-1 patojenezinde eksozomlann rolünü araştırmak için bir engel, HIV-1 parçacıklardan eksozom etkili bir ayrıştırma olmuştur. Bir proto geliştirdikiyodiksanol gradyanları kullanılarak hızı insan plazmasında, HIV-1 parçacıklardan üretilebilir, eksozom saflaştırılması için col. Bu çalışmada kullanılan HIV pozitif donörlerin antiretroviral tedavi ve 206,000 virüs parçacığı / ml 21 arasında ortalama 1500 ile 400,000 virüs parçacığı / mL'ye kadar ihtiva Bu deneyler için kullanılan plazma numuneleri almadı. Böylece, virüs yükü yüksek olduğunda bile, HIV-1 ile enfekte olmuş bireylerin plazmasındaki eksozomlar etkili bir HIV-1 virüs parçacıklarının ayrılabilir olduğunu göstermektedir. Büyüklüğüne ve yoğunluğuna içindeki rağmen, eksozomlar yüksek yoğunluklu / indirme fraksiyonlar içinde ayrılmış, viral partiküller, karşılaştırıldığında iyodiksanol gradyanları düşük yoğunluklu üst / fraksiyonlarda ayrılmış. Iyodiksanol gradyan yöntemi ile hazırlanan eksozomlar yüksek düzeyde saflaştırılmış ve hücre dışı proteinleri kirletici ücretsizdir. İzole eksozomlar nüfusun saflığı p24 ELISA ve HIV-1 p24 kapsid proteininin için Western Blot analizi kullanılarak teyit edilmiştiryanı sıra exosomal belirteçleri, AChE, CD9, CD45, CD63 ve Batı analizi gibi. Bu belirteçlerin kullanılması exosome tanımlanması 27 son yayınlanan kılavuzlar ile tutarlıdır.
Daha fizyolojik olarak uygun immün aktivasyonu, HIV-1 bulaşmış bireylerden alınan saflaştırılmış eksozomlar, HIV-1 seronegatif kontrollerden eksozomlann önemli ölçüde daha yüksek konsantrasyonlarda sitokinler / kemokinler ihtiva ettiği bulundu. Ayrıca, HTV-1 ile enfekte edilmiş bireylerden alınan eksozomlar saf ve merkezi bellek CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin yüzeyi üzerinde, aktivasyon markeri, CD38 artmış seviyelerini indüklemek için, bir yetenek sergiledikleri bildirilmiştir, biyolojik olarak aktif idi. Topluca, bu veriler HIV enfeksiyonu sırasında sürekli bağışıklık aktivasyonu sürücü olabilir bir mekanizma öneririz.
Sonuçlar biz diferansiyel santrifüj ve iyodiksanol hız gradyanı ayırma değerini gösterir birleştiren bizim exosome arınma süreci kullanarak elde başardıkfiziksel ve fonksiyonel biyo analizler için yüksek ölçüde saflaştınlmış bir eksozom kullanma. Prosedür belli tuzaklar ve sınırlamalar var. Eksozom önemli miktarda AChE aktivite ölçümleri ile hesaplanan başlangıç malzemesinin çoğu zaman, bir çoğu işlemi sırasında kaybolur. Buna ek olarak, prosedür de zaman tüketen ve pahalı ekipmana erişimi gerektirir. Son olarak, gradyan fromer cihazı kullanılarak iyodiksanol geçişlerini nesil tekrarlanabilirliği sağlamak için önemli pratik gerektirir. Gradyan üretimi için alternatif bir yöntem gradyanlar meydana izin vermek için santrifüj tüplerine çözeltilerin dikkatli katmanı ve kuluçka O / N, ardından iyodiksanol çözeltiler kademeli bir dizi hazırlamak için olabilir. Ancak, bu alternatif test değil.
Insan plazması, HIV-1 partiküllerden izolasyonu ve eksozom ayrılması için burada açıklanan deneysel protokol ex saflığını sağlamak için etkili bir yöntemdirosomes. Bu yöntemin kullanılması, HIV-1 patogenezinde eksozomlann rolü ile ilgili gelecekte soruşturma için verici yollar yol açmış ve aynı diğer biyolojik prosesler için sorular olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
- Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
- Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
- O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
- Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
- Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
- Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
- Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
- Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
- Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
- Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
- Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. , (2014).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
- McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
- Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
