Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53498
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,3
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

Abstract

Rygmarvsskade (SCI) forårsager typisk ødelæggende neurologiske underskud, navnlig gennem skader på fibre faldende fra hjernen til rygmarven. En stor aktuel forskningsområde er fokuseret på de mekanismer, adaptive plasticitet, der ligger til grund for spontan eller induceret funktionel restitution efter SCI. Spontan funktionelle opsving er rapporteret at være større tidligt i livet, rejse interessante spørgsmål om, hvordan adaptive plasticitet ændringer rygmarven udvikler sig. For at lette undersøgelse af denne dynamiske, har vi udviklet et SCI-model i den neonatale mus. Modellen har relevans for pædiatrisk SCI, som er for lidt undersøgt. Fordi neurale plasticitet i den voksne involverer nogle af de samme mekanismer som neurale plasticitet tidligt i livet 1 kan denne model potentielt have en vis relevans også for voksne SCI. Her beskriver vi hele proceduren for at generere en reproducerbar rygmarvskompression (SCC) skade i neonatale musså tidligt som postnatal (P) dag 1. SCC opnås ved at udføre en laminektomi ved en given spinal niveau (her beskrevet på thorax niveauer 9-11) og derefter anvendelse af en modificeret Yasargil aneurisme mini-clip til hurtigt at komprimere og dekomprimere rygmarven . Som tidligere beskrevet kan den tilskadekomne neonatale mus testes for adfærdsmæssige mangler eller aflivet til ex vivo fysiologisk analyse af synaptisk forbindelse under anvendelse elektrofysiologiske og højt gennemløb optisk indspilningsteknikker 1. Tidligere og igangværende studier bruger adfærdsmæssige og fysiologiske vurdering har vist en dramatisk, akut svækkelse af bagben motilitet efterfulgt af en komplet funktionel genopretning inden for 2 uger, og det første tegn på ændringer i funktionel kredsløb på niveau med identificerede faldende synaptiske forbindelser 1.

Protocol

Denne eksperimentelle protokol er blevet godkendt af National Animal Research Authority i Norge (Forsøksdyrutvalget, lokal eksperimentel godkendelsesnummer 12,4591) i overensstemmelse med EU-dyr pleje forskrifter (Federation europæiske Laboratory Animal Science Association). blev gjort en indsats for at minimere antallet af anvendte dyr og deres lidelser. I denne artikel den procedure bruges på postnatal (P) dag 1 vildtype ICR (Prægning Kontrol Region) mus (Jackson, USA) er beskrevet, men den samme fremgangsmåde kan også bruges på et senere tidspunkt.

1. Konstruktion af en Gas Anæstesi System for Neonatal Mus (figur 1)

  1. Byg en næse-maske fra spidsen af ​​en sprøjte. Tilslut dette til den 3-vejs stophane med plastslange (figur 1 - rød slange og figur 2A1).
  2. Bore et lille hul i siden af ​​næsen maske og forbinde denne til plastrør at fjerne overløb af gas framaske. Afslut slangen enten på en vakuumpumpe sæt til et svagt undertryk, eller i et stinkskab (figur 1 - lys grøn slange).
  3. Lav en anæstesi kammer fra en 150 mm x 25 mm plast petriskål (figur 2A2).
    1. På den ene side, lave et hul stort nok til at rumme hovedet af musen og næse maske.
    2. På den modsatte side, skal to mindre huller, hvorigennem kan indsættes plastrørene til og fra næsen maske (figur 1 - rød og lysegrønt slanger, henholdsvis).
    3. Lav et tredje hul i toppen af låget og tillægger dette en tredje plastrør, der ender på vakuumpumpen (figur 1 - mørkegrønt slanger). Formålet med dette tredje rør er at sikre, at overskydende gas, som ikke er blevet fanget af udløbet fra næsen masken fjernes.
  4. Byg en søvn kammer ved at lave et hul i bunden af ​​enhver form for lab parabol, der er stor nok til contain musen og har en glat og ensartet kant (åbning af skålen skal ligge i plan med bordet for at forhindre lækage af gas). Tilslut hullet i kammeret til 3-vejs stophane med plastslange (figur 1 - brun slange). Placer søvn kammer under en emhætte.
  5. Tilslut en 3-vejs stophane til afgangsrøret fra fordamperen (Figur 1 - gul slange og figur 2A3).
  6. Tilslut indløbet af fordamperen til iltforsyningen (figur 1 - blå slanger).

2. Ændring af en Yasargil Midlertidig aneurisme Mini-klip til Opret Compression Tool (figur 2 og tabel 1)

  1. Fastgør klemmen fast til et stativ med en klemme. Ved hjælp af en kikkert lup til visuel kontrol, fil ned den ydre overflade af spidsen af hvert klip vinge til en endelig tykkelse på ca. 150 um ved anvendelse af en slibesten monteret på en boremaskine (Figur 2B og C). Foretag en prop til klippet ved at skære en kort strækning af polyethylen kapillarrør (tabel 1) under et stereomikroskop ved anvendelse af en mikro-kniv (tabel 1), og placere denne på et af bladene (figur 2A4 og figur 2B og C). Dette forhindrer fuldstændig lukning af klippet og skaber standardiserede kompression dimensioner. Når klippet er lukket interblade afstanden er omkring 230 um. Lav en ny prop for hvert forsøg som polyethylenmaterialet kan komprimere under brugen, som ville ændre den interblade plads.
    Bemærk: fjederspændingen af ​​klippet mindskes over tid, således at efter ca. 80 kompressioner klippet ikke længere lukker helt til proppen og skal udskiftes.

3. Forberedelse før operation

  1. Placer musen i søvn kammer (figur 1) og initiere anæstesi med 4% isofluran (figur 2A5 (figur 2A3 og tabel 1).
  2. Test tilbagetrækning refleks af musen ved forsigtigt at klemme banen af ​​huden mellem tæerne med en tynd plast pincet. Gør dette omhyggeligt som nyfødte mus nemt kommer til skade. Klemme for hårdt fører til øjeblikkelig blå mærker. Udførelse denne test i begyndelsen af ​​sedation udløser refleks og giver en god indikation af mængden af ​​kraft nødvendig.
  3. Når refleks afskaffes, fjerne musen fra søvn kammer og læg den i en udsat position på operationsbordet med snuden indsat i næsen maske, der giver en konstant forsyning af 4% isofluran blandet i rene oxygen (figur 1). Sørg for, at opvarmning pad er tændt og indstillet til 37-38 ° C som hypotermi under operationen kan være dødelig.
  4. For at opnå fuldstændig analgesi, injiceres subkutant 50 pi af lokalbedøvelse bupivacain (2,5 mg / ml, figur 2A7 og tabel 1) for at udføre injektionen.
  5. Reducer isofluran koncentration leveret til næse maske til 1-2%.

4. Dorsal laminektomi

  1. Udføre kirurgi ved mikroskopisk kontrol.
  2. Efter rengøring operationsområdet med chlorhexidingluconat (tabel 1 # 19) i mindst 30 sek, lave en 1-2 mm tværgående hud indsnit ved T9-T11 ved anvendelse af en microknife (figur 2A8).
    Bemærk: I ICR neonatale mus rostralt del af maven, synligt, når det indeholder mælk, står de vertebrale niveauer T12-T13 (figur 3). En anden milepæl er den rostralt del af thorax subkutane fedtvæv aggregat, der slutter ca. T8-9. Denne skelsættende er kun synlig, når huden indsnit.
    3. (figur 2A9 og A10) for at udvide åbningen huden i en tværgående retning til 8-9 mm ved at trække huden blidt rostrally og kaudalt (huden tårer let, hvilket skaber en glat og lige sår). Dette tilvejebringer tilstrækkelig lateral adgang til hvirvelsøjlen.
  3. Tilbagetrække kanterne af hudincision fra underliggende strukturer ved at indsætte sterile stykker af hæmostatisk gelatinesvamp (Figur 2A11 og tabel 1) subkutant rostralt og kaudalt for snittet. Dette forstørrer åbningen og forhindrer huden i at tilbagetrækning og tilsløre området under kirurgi. Den hæmostatiske gelatinesvamp behøver ikke at blive dyppet i saltvand før brug.
  4. At udsætte rygsøjlen, dissekere de paravertebrale muskler ved hjælp af tynde saks (Figur 2A12, og tabel 1). Skær de vedhæftede filer i musklerne til rygsøjlen og udsætte lamina (figur 4A). Ikkee også, at på dette tidspunkt spinal proces er underudviklet.
  5. Identificer midterlinjen og skæres på tværs mellem de to lag (som på dette tidspunkt er brusk) med tynde saks (figur 4B). Anbring forsigtigt en klinge af en tynd pincet mellem lamina og dura (figur 4C), fat i hinden med pincet og løft den forsigtigt op, indtil et stykke bryder væk, forlader dura intakt (figur 4D). Gentag dette 2-3 gange for at få en 1-2 segment lang laminektomi.
  6. Brug af tynde pincet som Rongeurs, fjerne dele af facetled bilateralt at få plads nok til at placere klippet inden rygmarvskanalen. Rens det kirurgiske område og styre blødning med små stykker af hæmostatisk gelatinesvamp.

5. rygmarvskompression Skade

  1. Åbn det modificerede aneurisme mini-klip i holderen klippet (Figur 2A13 og figur 2B) og sted the knive på hver sin side af rygmarven i mellemrummene mellem facet sammenføjninger og ledningen. Kontroller, at knivene er indsat dybt nok til at påvirke den ventrale del af rygmarven. Hvis dette ikke er muligt, fjerne mere af facetleddene.
  2. Slip mini-klippet hurtigt, holde den på plads med indehaveren klippet for at forhindre det i at glide. Fastholde komprimering for 15 sek.
  3. Åbn mini-klippet hurtigt og fjerne det. For at opnå et symmetrisk kompression, vende orienteringen af ​​mini-klip, og ved hjælp af den let kan ses mark foretaget af hæmoragisk ødem fra den første kompression som en guide, flytte klippet i den modsatte retning for en anden 15-sec kompression (før forsøget viste, at dette skaber symmetriske histologiske og fysiologiske underskud, mens enlige kompressioner ikke 1). Dura bør ikke blive beskadiget af kompressionen.
  4. Rens området og opretholde hæmostase med stykker af hæmostatisk gelatine svamp.
  5. Fjern de stykker af hæmostatisk gelatinesvamp, der blev placeret under kanterne af huden indsnit ved begyndelsen af operationen og lukke huden indsnit med steril 6,0 sutur og en nåleholder (fig 2A14 og 15).
  6. Injicer subkutant 0,75 mg / kg legemsvægt Buprenorphin (fig 2A16) fortyndet i sterilt PBS under anvendelse af en insulinsprøjte (300 pi, 30 G).

6. Postoperativ pleje

  1. Fjern musen fra næse maske og læg den i en temperatur-kontrolleret kammer sæt ved 30 ° C, indtil bedøvelsen aftager og musen bliver alert (1-3 timer er typisk tilstrækkeligt).
  2. Injicer Diazepam (fig 2B17) intraperitonealt i moderen (8 g / kg legemsvægt). Dette skaber en døs, der mindsker risikoen for kannibalisme under den første nat, da denne risiko er størst.
  3. Returnere den opererede mus til kuldet.
  4. Hvis kuldet er large (> 12 unger), fjerne nogle af de ikke-opererede unger, helst de større dyr, hvis de har forskellig størrelse, for at reducere konkurrencen om mælken. Maternal pleje af betjente hvalpe er bedst i ICR linje, hvis kuldstørrelsen er omkring 9 hvalpe.
  5. For smertebehandling, administrere Buprenorphin (0,75 mg / kg legemsvægt) subkutant en gang om dagen i de første postoperative dage, ved anvendelse af en insulinsprøjte (300 pi, 30 G). En passende mængde til subkutan injektion er 30-50 pi. I neonatale mus vokalisering og agitation er gode indikatorer for smerte.
  6. Udføre en daglig gennemgang af de tilskadekomne mus ved anvendelse af en score ark til at evaluere ernæring, kropsvægt, dehydrering, smerter, sårheling, urinretention og infektion status. Ifølge score opnåede, giver særlig pleje, såsom injektioner af en steril pædiatrisk ernæring løsning (tabel 1 # 18) i tilfælde af unormal ernæring. Scoren ark også0; definerer humane endpoint kriterier. En mor, der ikke afviser de sårede hvalpe er den bedste omsorgsperson.
  7. I det usædvanlige tilfælde af blære dysfunktion, udføre blære massage to gange om dagen, indtil funktionen er genoprettet. Dette gøres ved at placere musen i rygleje i den ene hånd og masserer underlivet forsigtigt i en Rostro-kaudal retning med en fingerspids.

Representative Results

Rygmarvskompression skade og tab af funktion

Som tidligere beskrevet, ved at optimere den præoperative, kirurgiske og postoperative procedurer, kan der opnås en reproducerbar kompression SCI model i den neonatale mus 1. Den polyethylen prop placeres på en klinge af klemmen (figur 2B og C) forhindrer fuldstændig lukning af klippet og holder den inter-bladet afstand konsekvent på omkring 230 um. Vende orienteringen af klemmen i de to kompressioner resulterer i en symmetrisk skade, som bedømt ved histologiske sequelae (figur 5A og 1). Umiddelbart efter mini-clip fjernelse, det komprimerede rygmarvsvæv bliver mørkere som følge af hæmorrhagisk blodudtrædning og ødem. Observation af serielle sektioner af de sårede rygmarv farvet for eosin og Hematoxylin allerede en dagfter skade afslører gradvis forringelse af vævet, når man nærmer læsionen epicentret (figur 5A). Tilstedeværelsen af ​​intraspinale hulrum eller blod i læsionen er ikke usædvanligt.

Behavioral vurderingen, f.eks ved at spore bagbenenes baner under ikke-vægtbærende tilstande få timer efter operationen, viser en dramatisk forringelse af bagbens motilitet i SCC skadet mus sammenlignet med sham kontrolmus, hvor kun en laminektomi udføres (figur 5B og 1) . Denne test kan gentages, indtil musen er i stand til at udføre andre adfærdsmæssige forsøg, der kræver bærer sin egen vægt 1.

Dødelighed og bedring efter operation

Intraoperativ dødelighed skyldes hovedsagelig apnø og hjertestop forårsaget af den høje koncentration af isofluran nødvendig for at opnå tilstrækkelig anesthesien. Introduktion til lokalbedøvelse Bupivacain i den kirurgiske protokol tillader reduktion af isofluran koncentration og derved formindsker signifikant dødeligheden. I en nylig eksperimentel serier, herunder mere end 20 dyr, den intraoperativ dødeligheden var nul. I modsætning hertil er postoperativ overlevelse primært påvirket af accept af de opererede mus ved deres mor. En betydelig forbedring opstod, da angst og aggressivitet blev reduceret ved at levere en enkelt injektion af diazepam (ip 8 g / kg legemsvægt) til moderen før returnering de opererede mus til kuldet 1. Accept og postoperative genopretning af de opererede mus kan overvåges ved tilstedeværelsen af ​​mælk i maven. Maven på en P1-P7 mus, der har fordrukken mælk er klart hvidt og synlig gennem den abdominale hud (figur 3). Sammenligning af fodring i drevet, fingeret kontrol og ikke-opererede mus er nyttig til at vurdere ernæringstilstand skaded mus. Vurdere væksten af drevet versus ikke-opererede mus viser, at trods en lille vægttab under den første postoperative dag, vækstkurven af betjente mus normaliserer hurtigt derefter (figur 6). Dødelighed relateret til blære dysfunktion eller infektion blev aldrig observeret selv i mus studeret så længe som 7 uger.

<td> 10
Antal i fig. 2 Navn Producent / leverandør henvisning # Forbindelse Kommentar
1 Plastsprøjte (30 eller 50 ml)
2 Plastic petriskål (150 x 25 mm)
3 Fortec isofluran fordamper Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Vi bruger og gamle enhed ud af produktion, så tjek linket for nyere enhed
4a Yasargil midlertidig aneurisme mini-klip Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b Fin boring polyethylen kapillarrør ID 0,58 mm, OD 0,96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 Isofluran (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (bupivacain) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Insulin sprøjte 0,3 ml 30 G x 8mm VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 Ultra Fin Micro Knife 5 mm forkant Fin Science Tools 10.315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 Ekstra Fin Graefe tang - 0,5 mm Tip Fin Science Tools 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 		Ikke virkelig nødvendigt, ofte tænderne er for store
Tang SuperGrip Straight Fin Science Tools 00.632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 		To pincet er nødvendig
11 Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
12 Vännäs Spring saks - 2 mm knive Straight Fin Science Tools 15.000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 Vario Clip Anvendelse tang Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson og Johnson J105G
15 Diethrich micro nåleholder 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 TEMGESIC (buprenorphin) Schering-Plough
17 Stesolid (diazepam) Actavis Også kendt som Valium
18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (chlorhexidingluconat) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Tabel 1. Liste over værktøj og udstyr til at generere en clip-drevet rygmarvskompression skade i en neonatal mus.

figur 1
Figur 1. Skematisk af anæstesi setup. Denne skematiske viser anæstesi setup designet til den neonatale mus, med en søvn kammer til indledende anæstesi og en næse maske indretning til fortsat anæstesi under kirurgi.

Figur 2
Figur 2. De vigtigste værktøjer og komprimering klip. (A) Værktøjer, der anvendes under proceduren. Tallene svarer til den annotation anvendt i tabel 1. (B og C) En Yasargil midlertidig aneurisme mini-klip med spidsen af hvert blad manuelt trimmet ned til ca. 150 um tykkelse. En prop fremstillet af et udsnit af polyethylenrør (tabel 1) er placeret på et af bladene til at forhindre fuldstændig lukning af klemmen. Målestok: 2 mm. App: klip applikator (# 12 i A); St:. Prop Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Landmark til præoperativ vurdering af spinal niveau i neonatal ICR mus. (A) fra siden af en P1 ICR mus med hvid mælk i s tomach. Rostralt del af maven svarer til T12-T13 spinal niveau. (B) P1 ICR mus under anæstesi i bugleje. Skønt vanskeligere at visualisere end i (A), maven fyldt med mælk er genkendelig. Rostralt del af maven angiver T12-T13 spinal niveau. Scale barer: 0,5 cm.

Figur 4
Figur 4. Dorsal laminektomi. (A) Dissektion af paravertebrale muskler. Bemærk, at spinal proces i denne alder er underudviklet. (B) Tværgående sektionering af hinden med tynde saks. (C) Indførelse af et blad af en tynd pincet mellem lamina og dura. Den indgang er vist med pilespids. (D) Fjernelse af hinden. Målestok: 2 mm.

filer / ftp_upload / 53498 / 53498fig5.jpg "/>
Figur 5. Histologisk og adfærdsmæssige resultater efter rygmarvskompression skade på P1. (A) eosin og Hematoxylin farvning i rygmarv sektioner fra en skadet mus (1 dag efter skade) på forskellig afstand fra skaden epicentret. (B) Repræsentative spor af forben og bagbenenes baner observeret 6 timer efter skade eller efter en fingeret kontrol laminektomi. Spor på toppen repræsenterer baner set fra et sidebillede af dyret. Spor i bunden repræsenterer baner set fra den ventrale aspekt af dyret. Se også 1. Målestok: 250 um. DH: dorsale horn; L, venstre; R: højre; SCC: rygmarvskompression; VH:. Ventrale horn Klik her for at se en større version af dette tal.

"Figur Figur 6. Komparative vækstkurver. Histogram, der viser vægtforøgelse på ikke-opererede og SCC skadet mus fra postnatal dag 1 til postnatal dag 9.

Discussion

I denne artikel procedurerne for et klip-genereret SCC skade P1 mus er beskrevet. De samme fremgangsmåder kan også udføres på et senere tidspunkt. Compression skader blev udført med succes på P5, P7, P9 og P12 (Züchner, et al., Manuskript under udarbejdelse). På alle postnatale faser, er generel anæstesi opnås med isofluran fordampet i ren ilt, men det bedøvende resultat afhænger i høj grad af alder. I indledende forsøg på P1-P4, før lokalbedøvelse blev indført i protokollen, var det vanskeligt at opnå en dyb og langvarig sedation på grund af en smal dosis-effekt vindue mellem utilstrækkelig sedation og overdosis. Desuden har betænkeligheder med hensyn til en neurotoksisk effekt af isofluran hos nyfødte dyr blevet rejst 27-30. En kombination af isofluran og de lokale bedøvelsesmiddel Bupivacain giver en dybere og mere stabil anæstesi, mens tillader en isofluran dosisreduktion med en faktor 2-3. Forskellige typer af anesthesia er blevet beskrevet til neonatale gnavere, herunder cryoanesthesia 31,32, men en potentiel ulempe ved cryoanesthesia er dets neurobeskyttende virkning (gennemgået af 33,34), som kunne komplicere dannelsen af en effektiv og reproducerbar skade. Barbiturat-baseret anæstesi anses for at have lavere effektivitet i neonatale mus som følge af lavere niveauer af serum-albumin og kropsfedt end hos voksne 35,36.

Selvom helt invasive og traumatisk, når proceduren er etableret dødeligheden under operationen er lav. Men der er kritiske trin under proceduren, der kræver særlig opmærksomhed for at forbedre inddrivelsen og overlevelse af de opererede mus. Et vigtigt spørgsmål er at vælge hvalpe, der vil have den bedste chance for at overleve operationen. Når kuldet er stort den ernæringsmæssige tilstand af de enkelte hvalpe varierer. Ud over den uundgåelige blødning, der forekommer under kirurgi, der drives hvalpe tilbringer times væk fra moderen, og de ofte ikke drikke mælk før næste morgen. Det er således en fordel at vælge hvalpe, der allerede har en vis mængde mælk i maven. Dette er umiddelbart synlige gennem den abdominale hud fra P0 til P7.

Under den første nat det opererede hvalp er stor risiko for at blive cannibalized af moderen. Under den første udvikling af denne model mere end halvdelen af ​​de opererede mus manglede den følgende morgen, med klare tegn på blod i buret. Necrophagy, kannibalisme og barnemord i gnavere er blevet studeret i årtier 37-40. I denne undersøgelse blev kannibalisme kun vidne én gang, men blev betragtet som en mere sandsynlig forklaring end necrophagy fordi hvalpene, der blev returneret til buret var typisk i så god form, at døden ved naturlige årsager i løbet af natten virkede usandsynlig. Det fik tanken om at bruge en reversibel farmakologisk middel, såsom Diazepam til at reducere angst og aggressivitet in moderen (gennemgået af 41). Intraperitoneal injektion af Diazepam væsentligt forbedret situationen, droppe dødelighed under første nat fra mere end 60% til mindre end 20%.

Reduktion kuldstørrelse ved nedslagning og forstyrre kuldet så lidt som muligt efter postoperativ afkast er yderligere elementer, der kan gavne de opererede dyr. Men så kun drives hvalpe med moderen er ikke gavnligt. Den bedste balance af betjente / ikke-opererede hvalpe kan variere afhængigt af den linje, men for ICR og SCID-ICR-mus forlader 4-5 betjente unger (skade eller fingeret) sammen med 3-4 ikke-opererede unger gav de bedste resultater.

I en generel forstand, den vigtigste begrænsning ved denne neonatal SCI model er, at den neonatale rygmarv afviger i mange henseender fra den voksne rygmarven, og kan således ikke give eksperimentelle resultater, som er sammenlignelige med dem opnået fra voksne SCI modeller. Sådanne forskelle omfatter samlede størrelse ogvolumen af ​​rygmarven, celleantal, underrepræsentation af specifikke celletyper såsom oligodendrocytter, umodne immunreaktioner og umodne neuronale kredsløb. Konklusionerne fra forsøg i denne model skal derfor overvejes nøje. På den anden side, modellen er relevant for den relativt mindre undersøgte scenario pædiatrisk SCI. Desuden er tilsyneladende svaghed i forhold til voksne SCI-modeller er også en potentiel styrke, da det kan give belysning af plasticitet mekanismer, der, selv om minimalt eksisterede i den voksne rygmarven, kunne udgør en terapeutisk substrat hvis genindsat. Det er tænkeligt, at genindsættelse af neonatale eller endda embryonale forhold kan gennemføres ved implantation af mindre udviklede celler eller væv eller ved behandling med reagenser, der afføde den voksne væv med tidligere udviklingsmæssige karakteristika. Anvendelse af enzymer til at fjerne perineuronal redskaber er et eksempel på den sidstnævnte fremgangsmåde 42,43.

f.eks transsektion, hemisektion, Slaglegemerne, ballon kompression, pincet knuse, statisk vægt kompression, etc. Med hensyn til at påvirke enheder, bestræbelser i denne retning har resulteret i SCI-modeller i voksne gnavere, hvor der kan manipuleres flere parametre af virkningen såsom hastighed, kraft og varighed (gennemgået af 44). En anden tilgang, der involverer mindre udstyr, beskæftiger en modifikation af Kerr-Lougheed aneurisme clips 45,46. Disse 2 tilgange supplerer hinanden som slaglegemet efterligner en kontusion skade mens klip efterligner en kompression skade med en vis grad af samtidig iskæmi. På grund af de betydelige størrelse begrænsninger og større sårbarhed neonatale mus, den højere dødelighed forbundet med længere operationer samt omkostningerne ved develvikle mindre udstyr skala, blev det valgt at udvikle et klip-genereret kompression i stedet for en attrappen-genereret kontusion tilgang. Dette blev opnået ved at tilpasse en kommercielt tilgængelig aneurisme mini-klip til at rumme størrelsen af rygsøjlen for neonatal mus 1. Tilføjelse af en prop sikrer en standardiseret kompression bredde, og så længe spændingen af ​​klemmen komprimerer til grænsen af ​​proppen, bør kraften af ​​kompression under den statiske fase ved minimal bredde variere lidt. Hvad er ikke standardiseret, er hastigheden af ​​komprimering under dens dynamiske fase, da dette vil variere, da clip spænding ændrer sig over dens levetid. Som den statiske fase af komprimering varer meget længere end den dynamiske fase, og der er lidt, der tyder på, at rygmarven væv udøver meget af en modkraft mod de mini-clips knive, er det sandsynligt, at sværhedsgraden af ​​skade er mest afhængig af den statiske fase. Dette er dog endnu ikke afprøvet. Skadesværhedsgraden vil sandsynligvis afhænge af flere faktorer, herunder den statiske kompressionskraft og varighed, hastigheden af ​​kompression og dekompression, positionen af ​​den mini-klip, og antallet af kompressioner udføres på samme sted. Således kunne kombinatorisk variation i disse parametre resulterer i frembringelsen af ​​et spektrum af skade sværhedsgrader fra svag til alvorlig. Trods potentialet for variabilitet i vores tidligere offentliggjorte undersøgelse 1 vi opnået ensartede resultater ved histologiske, fysiologiske og adfærdsmæssige niveau, så der er lidt, der tyder på, at acceptabel standardisering er svært at opnå. Vi bemærker, at vi i denne undersøgelse bruges flere metoder til validering på hvert niveau, herunder adfærdsmæssige tests såsom air-stepping, som vist i figur 5.

I denne neonatal SCI model skåner skaden en vis del af axoner og derved giver en situation gunstig for at fremkalde adaptiv plasticitet gennem re-modeling skånet forbindelser og dannelsen af ​​nye kredsløb. Eftersom den neonatale mus er velegnet til undersøgelse af mange eksperimentelle metoder, er det muligt at bruge denne model til at studere funktionel genopretning og adaptiv plasticitet med en integrativ tilgang, herunder adfærdsmæssige tests, retrograd og anterograd axonal sporing, immunhistokemi, elektrofysiologi og høj -throughput optisk optagelse 1. Som et eksempel, tog vi fordel af denne integrativ tilgang til at demonstrere netværk re-modellering på niveau med specifikke faldende input ved hjælp af høj-throughput calcium imaging i ex vivo wholemount præparater af hjernestammen og sårede rygmarv 1. Dette kan skubbes yderligere ved hjælp af neuro-optogenetic og optogenetic farmakologi værktøjer til at vurdere ombygningen af ​​synaptiske forbindelser blandt specifikke subpopulationer af spinal neuroner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic syringe (30 or 50 ml)
Plastic Petri dish (150 x 25 mm)
Fortec isoflurane vaporizer Cyprane We use and old device out of production, check the link for newer device
Yasargil temporary aneurysm mini-clip Æsculap FE681K
Fine-Bore Polyethylene tubing ID 0.58 mm, OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200
Isoflurane (Forene) Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain) AstraZeneca
Insuline seyringe 0.3 ml 30 G x 8 mm VWR 80086-442
Ultra Fine Micro Knife 5 mm cutting edge Fine Science Tools 10315-12
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5 mm Tip Fine Science Tools 1153-10 Not really necessary, often the teeth are too large
Forceps SuperGrip Straight Fine Science Tools 00632-11 Two forceps are necessary
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan
Vannas Spring Scissors – 2 mm Blades Straight Fine Science Tools 15000-03
Vario Clip Applying Forceps Aesculap FE502T
Vicryl 6–0 (Ethicon) Johnson and Johnson J105G
Diethrich micro needle holder 11-510-20
Temgesic (buprenorphine) Schering-Plough
Stesolid (diazepam) Actavis Also known as Valium
Pedamix Fresenius Kabi
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) Fresenius Kabi D08A C02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8 (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2 (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7 (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361 (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12 (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519 (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29 (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46 (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), e104250 (2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588 (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590 (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586 (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31 (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180 (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55 (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51 (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96 (2012).
  22. Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7 (6), e39264 (2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361 (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204 (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152 (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18 (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37 (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8 (8), e71317 (2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8 (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. , 3rd ed, (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47 (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61 (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11 (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15 (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55 (1), 83 (2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9 (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26 (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10 (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19 (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19 (2), 191-203 (2002).

Tags

Medicin neurovidenskab rygmarvsskade neonatal mus kirurgi klip kompression plasticitet
En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Züchner, M., Glover, J. C.,… More

Züchner, M., Glover, J. C., Boulland, J. L. A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model. J. Vis. Exp. (109), e53498, doi:10.3791/53498 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter