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Biology

SPRI, नैनो SPRI और एलिसा assays का उपयोग सीरम में मानव विकास हार्मोन का तुलनात्मक विश्लेषण

Published: January 7, 2016 doi: 10.3791/53508
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3
1Department of Nanoscience, University of North Carolina at Greensboro, 2Center for Biotechnology, Genomics, and Health Research, University of North Carolina at Greensboro, 3HORIBA Scientific
* These authors contributed equally

Summary

प्रस्तावित कार्य (SPRI) assays, विशेष रूप से नुकीला मानव सीरम में पुनः संयोजक मानव विकास हार्मोन का पता लगाने के लिए, spri व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख के साथ सीधे परिणामों की तुलना द्वारा प्रत्यक्ष और परिलक्षित सतह plasmon अनुनाद इमेजिंग के नैदानिक ​​संभावित आकलन है (एलिसा) किट।

Abstract

सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर मानव विकास हार्मोन (एचजीएच) का पता लगाने के लिए संवेदनशील और चयनात्मक तरीके (के उच्च स्तर 50-100 एनजी मिलीलीटर - 1 और 0.03 एनजी मिलीलीटर के न्यूनतम स्तर - 1) रक्त संचार में चर स्तर के रूप में आवश्यक हो सकता है बदल शरीर क्रिया विज्ञान से संकेत मिलता है। उदाहरण के लिए, बचपन में होने वाली विकास संबंधी विकार, रक्त में HGH के स्तर को मापने से निदान किया जा सकता है। इसके अलावा, खेल में पुनः संयोजक एचजीएच के दुरुपयोग को न केवल यह भी प्रताड़ित करने के लिए गंभीर स्वास्थ्य खतरों को प्रस्तुत करता है एक नैतिक मुद्दा बन गया है। गैर-22 केडीए अंतर्जात स्तर बहिर्जात पुनः संयोजक एचजीएच (rhGH) प्रशासन के बाद ड्रॉप के रूप में एचजीएच दुरुपयोग को मापने के लिए एक लोकप्रिय रणनीति, कुल एचजीएच के लिए 22 केडीए एचजीएच के अनुपात का पता लगाने पर निर्भर करता है। सतह plasmon अनुनाद इमेजिंग (SPRI) अपवर्तक इंडस्ट्रीज़ के परिवर्तन की रिकॉर्डिंग के द्वारा प्रत्यक्ष (लेबल मुक्त) की निगरानी और biomolecular बातचीत के दृश्य की अनुमति देता है कि एक विश्लेषणात्मक उपकरण हैवास्तविक समय में सेंसर सतह से सटे पूर्व। इसके विपरीत, सबसे अक्सर इस्तेमाल किया वर्णमिति विधि, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) परोक्ष रूप से एक रंग परिवर्तन लाती है कि एक सब्सट्रेट के बाद इसके अलावा विश्लेष्य एकाग्रता को मापने के लिए एंजाइम लेबल का पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग करता है। संवेदनशीलता का पता लगाने में वृद्धि करने के लिए, प्रवर्धित SPRI सिग्नल की शक्ति को बढ़ाने के लिए एक सैंडविच परख प्रारूप और निकट अवरक्त क्वांटम डॉट्स (QDs) का उपयोग करता है। नुकीला मानव सीरम में पुनः संयोजक rhGH के प्रत्यक्ष SPRI का पता लगाने के बाद, spri संकेत लगभग अवरक्त QDs (नैनो SPRI) के साथ लेपित का पता लगाने के एंटीबॉडी के अनुक्रमिक इंजेक्शन से परिलक्षित होता है। इस अध्ययन में, प्रत्यक्ष और परिलक्षित SPRI के नैदानिक ​​संभावित rhGH मानव सीरम में नुकीला और सीधे एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट की क्षमताओं के साथ तुलना को मापने के लिए मूल्यांकन किया गया था।

Introduction

मानव विकास हार्मोन (एचजीएच) पिट्यूटरी ग्रंथि द्वारा उत्पादित और सीधे खून में जारी एक 191 अमीनो एसिड पेप्टाइड (22 केडीए) है। हाईपोथेलेमिक पेप्टाइड वृद्धि हार्मोन हार्मोन जारी (GHRH) और सोमातोत्रोपिन के बीच सहभागिता एचजीएच के गुणवाला स्राव प्रेरित। नतीजतन, एचजीएच का स्तर 0.03 एनजी / एमएल सीमा 1 में lows करने के लिए 50-100 एनजी / एमएल में ऊंचे स्तर से बदलती हैं। शरीर में कमी या एचजीएच से अधिक असामान्य शारीरिक लक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला उत्तेजित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एचजीएच से अधिक स्तरों gigantism 2 और मधुमेह 3 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एचजीएच के समाप्त स्तरों वयस्कों 4 में नवजात शिशुओं में कम रक्त शर्करा, और कमजोर हड्डियों के घनत्व और अवसाद का कारण।

शरीर में वसा को कम करते हुए एचजीएच (rhGH) की पुनः संयोजक फार्म के प्रशासन दुबला मांसपेशियों में सुधार। यह एक एडीवी प्रदान कि शारीरिक शक्ति में सुधार के रूप में इस तरह के रूप में, इस पदार्थ पेशेवर और शौकिया खिलाड़ियों के लिए पसंद की दवा बन गयाप्रतिस्पर्धात्मक खेल में antage। rhGH अपनी उपस्थिति या anabolic प्रभाव का पता लगा सकते हैं कि परीक्षण के विकास पर ध्यान केंद्रित किया गया अंतरराष्ट्रीय शोधकर्ताओं द्वारा विश्व डोपिंग रोधी एजेंसी (वाडा) 5,6 और ज्यादा प्रयास से प्रतिबंध लगा दिया है।

एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) पूरे रक्त 7 में एचजीएच के निर्धारण के लिए पसंदीदा तरीका हो गया है। , एलिसा अच्छा संवेदनशीलता और चयनात्मकता पेशकश एक विश्वसनीय तकनीक है, यह अपेक्षाकृत समय और श्रम प्रधान है। इसके अलावा, एलिसा एंजाइमी टैग को रोजगार से एचजीएच के अप्रत्यक्ष पता लगाने पर निर्भर करता है। इसके विपरीत, सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) सीधे वास्तविक समय में लेबल के उपयोग के बिना एचजीएच का पता लगाने के लिए परमिट। एसपीआर के पीछे का पता लगाने के सिद्धांत एक पतली धातु की परत (सोने या चांदी) के साथ लेपित है कि एक चश्मे से मिलकर एक संवेदन सतह शामिल है; एक एक रंग ध्रुवीकृत प्रकाश धातु की सतह के साथ सूचना का आदान प्रदान करते हैं, "सतह plasmons" उत्पन्न कर रहे हैं। एक विश्लेष्य के बंधनधातु की सतह पर स्थिर एक सतह रिसेप्टर को तो विश्लेष्य एकाग्रता के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है, जो एक स्थानांतरित गूंज डुबकी, जिसके परिणामस्वरूप में गूंज शर्तों perturbs। एसपीआर आधारित biosensors अब biomolecular बाध्यकारी घटनाओं और जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं 8-10 नजर रखने के लिए एक वास्तविक समय, लेबल मुक्त तकनीक का प्रस्ताव है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हाल ही में, spri बहुसंकेतन के लिए जरूरत के जवाब में विकसित किया गया था (यानी, एक साथ कई बाध्यकारी घटनाओं की निगरानी) शास्त्रीय एसपीआर biosensors में संभव नहीं था, जो। इस प्रकार, spri एक साथ कई बाध्यकारी घटनाओं पर नजर रखने के लिए एक उपकरण के रूप में उभरा है। वर्तमान SPRI सिस्टम एक विशेष कोण और तरंग दैर्ध्य 10 पर प्रकाश के साथ उत्साहित है जो एक सतह के सूक्ष्म इमेजिंग के आधार पर कर रहे हैं। छवि तो एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) सरणी पर कब्जा कर लिया है।

तिथि करने के लिए, एचजीएच 11-14 पता लगाने के लिए विकसित की कुछ एसपीआर आधारित assays किया गया है। एक खास रणनीतिगैर-22-केडीए अंतर्जात स्तर बहिर्जात rhGH प्रशासन के बाद ड्रॉप के रूप में, isoform विधि 15 के रूप में जाना, कुल एचजीएच के लिए 22 केडीए एचजीएच के अनुपात का पता लगाने पर निर्भर करता है। हाल ही में, जुआन-फ्रेंको एट अल। 11 22 केडीए और मानव सीरम नमूनों में 20 केडीए एचजीएच isoforms की चयनात्मक का पता लगाने के लिए एक एसपीआर आधारित immunosensor के विकास पर सूचना दी डे। प्रत्येक isoform के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 0.9 एनजी मिलीलीटर -1 में पता लगाने की एक सीमा के साथ एक इंजेक्शन में एक साथ दोनों isoforms की माप की अनुमति के सोने संवेदक पर सीधे स्थिर थे। वैकल्पिक रूप से, एसपीआर एचजीएच से 13 उच्च विशिष्टता के साथ एंटीबॉडी स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लक्ष्य विश्लेष्य की एकाग्रता का पता लगाने के SPRI सिस्टम की सीमा (<एनएम) से नीचे गिर जाता है, तो एक नैनोकणों के उपयोग (नैनो SPRI) के माध्यम से SPRI संकेत amplifying के लिए उपाय करने की है। इस तरह के एसपीआर आधारित प्रवर्धन अच्छी तरह से वी के लिए साहित्य 16-19 में प्रलेखित किया गया हैविश्लेष्य और सतहों के arious प्रकार।

इस काम में, spri और नैनो SPRI आधारित biosensors के विश्लेषणात्मक क्षमता का विशेष रूप से नुकीला मानव सीरम में rhGH का पता लगाने के लिए जांच की गई थी, और एलिसा के लिए सीधे अपनी पता लगाने की क्षमता की तुलना। निम्नलिखित मानकों की समीक्षा की और विचार किया जाएगा: पता लगाने के समय, संवेदनशीलता, गतिज प्रोफाइल, reproducibility और विशिष्टता।

Protocol

Spri के लिए समाधान और प्रोटीन के नमूने की 1. तैयारी

  1. 10 मिमी फॉस्फेट, 150 मिमी सोडियम क्लोराइड, और पीएच 7.4 से युक्त कम नमक बफर फॉस्फेट (पीबीएस) खारा समाधान के 100 मिलीलीटर की तैयारी।
  2. 10 मिमी फॉस्फेट, 750 मिमी सोडियम क्लोराइड, और पीएच 7.4 से युक्त उच्च नमक पीबीएस समाधान के 50 मिलीलीटर की तैयारी।
  3. 10 मिमी सोडियम एसीटेट के 5 मिलीलीटर तैयार करें।
  4. कम नमक पीबीएस समाधान में पतला 5 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के एक शेयर की तैयारी।
  5. कम नमक पीबीएस समाधान में एक माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में पुनः संयोजक मानव विकास हार्मोन (rhGH) के एक शेयर समाधान तैयार है।
  6. 100 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में विरोधी rhGH और नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी के शेयर समाधान तैयार करें।

2. SPRI चिप एंटीबॉडी ऐरे के लिए तैयार

  1. 50 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए: (1 केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड से 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड 3) और rinsing द्वारा पालन स्थिर पिरान्हा समाधान की 120 मिलीलीटर में sonication द्वारा चिप साफ5 मिनट के लिए पानी के साथ और sonication। फिर, नाइट्रोजन धारा के साथ इथेनॉल और सूखे के साथ चिप कुल्ला।
  2. किसी को दूर करने के लिए 30 मिनट के लिए एक यूवी / ओजोन कक्ष में सोने चिप रखें।
  3. एक हलचल बार और एक ट्यूब टोपी शामिल है कि एक टेस्ट ट्यूब में 20 मिलीलीटर इथेनॉल के लिए 11-mercaptoundecanoic एसिड की 150 मिलीग्राम जोड़ें।
  4. 50 डब्ल्यू पर टेस्ट ट्यूब और माइक्रोवेव ट्यूब / चिप में चिप रखें और 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस।
  5. इथेनॉल के साथ चिप कुल्ला और 5 मिनट के लिए इथेनॉल में भिगो दें।
  6. पानी के साथ एक कुल्ला द्वारा पालन करें और 5 मिनट के लिए पानी में भिगो दें।
  7. एक हलचल बार और एक ट्यूब टोपी शामिल है कि एक टेस्ट ट्यूब में 1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide पानी मिलीलीटर से 20 की 150 मिलीग्राम जोड़ें। 2.4 चरण में के रूप में माइक्रोवेव चिप।
  8. पानी के साथ चिप कुल्ला और 5 मिनट के लिए पानी में भिगो दें।
  9. एक हलचल बार और एक ट्यूब टोपी शामिल है कि एक टेस्ट ट्यूब में 20 मिलीलीटर पानी में एन hydroxysuccinimide की 150 मिलीग्राम जोड़ें। 2.4 चरण में के रूप में माइक्रोवेव चिप।
  10. पानी के साथ चिप कुल्ला और 5 मिनट के लिए पानी में भिगो दें।
  11. Prepaएक हलचल बार और एक ट्यूब टोपी शामिल है कि एक टेस्ट ट्यूब में 20 मिलीलीटर पानी में 250 माइक्रोन पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी, 800 दा) फिर से। 2.4 चरण में के रूप में माइक्रोवेव चिप।
    नोट: microwaving PEG800 सेंसर की सतह पर सीरम प्रोटीन और क्वांटम डॉट परिसरों के बंधन गैर विशिष्ट बाद में प्रयोग में इस्तेमाल को रोकने के लिए एक अवरुद्ध कदम के रूप में किया जाता है। इस PEG800 चिप पर गैर-अधिकृत नंगे सोने साइटों के साथ प्रतिक्रिया द्वारा हासिल की है।
  12. पानी के साथ चिप कुल्ला और 5 मिनट के लिए पानी में भिगो दें।
  13. विरोधी rhGH एंटीबॉडी समाधान और विरोधी इम्यूनोग्लोबिन जी (विरोधी आईजीजी) के नकारात्मक नियंत्रण समाधान के 15 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर की तैयारी और 384 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी समाधान के 10 μl जोड़ें।
  14. एक 500 माइक्रोन Teflon का उपयोग कर एंटीबॉडी के साथ microarrayer (प्रत्येक नमूने के लिए 4 एक्स 7 quadrants) और मौके चिप में खोलना पैटर्न डिजाइन पिन इत्तला दे दी।
  15. आरटी पर और 75% या उससे अधिक की एक नम वातावरण के तहत 2 घंटे के लिए देखा चिप सेते हैं।
  16. कुल्ला और के लिए पानी में चिप सोख5 मिनट। फिर, नाइट्रोजन धारा के साथ सूखी चिप।

3. SPRI प्रयोग सेटअप और अवरुद्ध

  1. साधन और चयन निर्देशिका को प्रारंभ। वास्तविक समय कैमरा का चयन करें और degassed पानी की 10 मिलीलीटर के लिए 1 मिलीलीटर में सिरिंज पंप / मिनट लगते हैं। साधन में चिप डालें और सभी बुलबुले को हटा रहे हैं जब तक पानी इंजेक्शन लगाने रखने के लिए।
  2. पानी की 10 मिलीलीटर के साथ चिप rinsing के बाद, छवि अधिग्रहण शुरू, और कम नमक पीबीएस के लिए बफर स्विचन द्वारा पालन करें और यह 20 मिनट के लिए / 20 μl के लिए नीचे 5 मिलीलीटर और फिर धीमी गति से प्रवाह की दर के लिए / 1 मिलीलीटर मिनट मिनट चलाने के लिए अनुमति ।
  3. चिप पर देखा स्थिर एंटीबॉडी पता चलता है जो अत्यधिक विपरीत छवि का चयन करें।
  4. का चयन करें और स्थिर एंटीबॉडी के लिए इसी 400 माइक्रोन व्यक्ति परिपत्र स्पॉट परिभाषित करते हैं।
  5. साधन plasmon घटता निशान के बाद, परावर्तन घटता में उच्चतम ढलान है कि काम कर रहे एक कोण चुनें।
  6. कम रों के 20 μl में चल रहे एक बफर प्रवाह / मिनटचयनित स्थलों में से सब से संकेत स्थिर जब तक सिस्टम के माध्यम से पीबीएस Alt।
  7. लोड की स्थिति में इंजेक्शन वाल्व के साथ नमूना पाश (150 μl) में चल बफर में बीएसए (100 माइक्रोग्राम / एमएल) कर लेता है। तब प्रवाह सेल का हल इंजेक्षन करने के लिए इंजेक्शन स्थिति के लिए वाल्व स्विच।
    नोट: बीएसए covalently अमाइन प्रतिक्रियाशील सतह के लिए बाध्य करने के लिए इंजेक्शन है, शेष अपार बीएसए बफर कुल्ला के माध्यम से सतह से धो देगा।
  8. सतह पर 10 मिमी सोडियम एसीटेट की एक समाधान के 150 μl इंजेक्षन और उच्च नमक पीबीएस के 150 μl इंजेक्शन से पालन करें।
  9. अमाइन प्रतिक्रियाशील सतह निष्क्रिय करने के लिए ethanolamine (1 मिमी) के 150 μl इंजेक्षन।
  10. सतह धोने के लिए 10 मिमी सोडियम एसीटेट के 150 μl इंजेक्षन।
  11. फिर, 5 मिलीलीटर की कुल के लिए 250 μl / मिनट के प्रवाह की दर पर 50 माइक्रोग्राम / एमएल बीएसए के साथ पीबीएस के लिए चल रहे बफर स्विच।
    नोट: 50 माइक्रोग्राम / एमएल बीएसए सुर के अतिरिक्त रोकने के लिए चल रहा है बफर के लिए जोड़ा हैगैर-सहसंयोजक गैर विशिष्ट साइटों पर कब्जा और यह आगे की सतह के लिए गैर विशिष्ट सीरम प्रोटीन के बंधन को कम करने के लिए किया जाता है से चेहरा।
  12. बदलें प्रवाह 5 μl / मिनट के लिए दर और इसे 20 मिनट के लिए स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं।

मानव विकास हार्मोन की 4. SPRI जांच

  1. RhGH का एक सेट एकाग्रता का एक समाधान तैयार (30,000 स्नातकोत्तर / एमएल, 250 स्नातकोत्तर / एमएल, 25 स्नातकोत्तर / एमएल, 2.5 स्नातकोत्तर / एमएल और 0.25 स्नातकोत्तर / एमएल) 10% सीरम में और पीबीएस 1 मिलीग्राम / एमएल बीएसए युक्त में पतला।
  2. एक 2 तैयार: बायोटिन की 1 μl जोड़कर एक समाधान लेबल विरोधी rhGH का पता लगाने के एंटीबॉडी (6 माइक्रोन) के एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में अवरक्त क्वांटम डॉट्स (1 माइक्रोन) के पास लेपित और streptavidin के 3 μl करने के लिए प्रभावी युग्मन के लिए 30 मिनट के लिए सेते ।
  3. एचजीएच का इंजेक्षन 150 μl इंजेक्शन पाश में मानव सीरम समाधान नुकीला। यह सतह से rinsing गैर-विशेष रूप से बाध्य सीरम से एक धीमी गति से ड्रॉप द्वारा पीछा संकेत में एक मजबूत वृद्धि में परिणाम है।
  4. अप एक बारअल चल बफर करने के लिए जोड़ा 450 मिमी सोडियम क्लोराइड का एक समाधान के साथ सतह धोने, स्थिर।
  5. 10 एनएम (2: 1) की एकाग्रता के लिए विरोधी rhGH का पता लगाने के एंटीबॉडी और क्वांटम डॉट्स के समाधान पतला बफर चलाने के साथ (पीबीएस 50 माइक्रोग्राम / एमएल बीएसए के साथ) और प्रवाह सेल में इंजेक्षन।

5. SPRI डेटा विश्लेषण

नोट: rhGH के इंजेक्शन के बाद मानव सीरम और क्वांटम डॉट बढ़ाने नुकीला, reflectance परिवर्तन में वृद्धि plasmon घटता की प्रवर्धित बदलाव के कारण होता है। इस चिप पर से संकेत करने के लिए सम्बंधित एक ग्रे स्केल छवि दिखाने के लिए एक अंतर छवि में यह परिणाम है।

  1. एक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम में डेटा आयात। समय (एस) बनाम SPRI संकेत (% परावर्तन) साजिश और उच्च नमक धोने के बाद विरोधी rhGH और नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी धब्बे के बीच अंतर को निर्धारित।

6. एलिसा प्रोटोकॉल (दिवस 1)

  1. सभी परख घटकों मैं शामिल स्टोरएन 2-8 डिग्री सेल्सियस पर rhGH एलिसा किट। यह विरोधी rhGH एंटीबॉडी भेड़ सीरम, मानव सीरम में नियंत्रण (1 और 2), संयुग्म बफर (200x) धो बफर, वर्णकोत्पादक TMB (tetramethylbenzidine) और अभिकर्मक रोक में लेपित अच्छी तरह प्लेटें, मानकों (0-5) भी शामिल है।
  2. वाणिज्यिक एलिसा किट प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में सेटअप अभिकर्मकों और तरीकों का पालन करें।
  3. सबसे पहले, विरोधी rhGH एंटीबॉडी से पहले पन्नी पैकेज खोलने के लिए आरटी के लिए गर्म करने के लिए 96 कुओं में लिपटे अनुमति देते हैं।
  4. तब परख के लिए 8 अच्छी तरह स्ट्रिप्स की वांछित संख्या को हटा दें और 2-8 डिग्री सेल्सियस पर शेष कुओं और दुकान युक्त पन्नी पैकेज reseal।
  5. मानकों के लिए आसुत जल के 1 मिलीलीटर (1-5) में, मानक # 0 के लिए आसुत जल के 2 मिलीलीटर में पुनर्गठन द्वारा मानकों को तैयार है, और नियंत्रण (1 और 2) के लिए आसुत जल के 1 मिलीलीटर में। नीचे दिए गए मानकों और नियंत्रण (तालिका 1) की इसी सांद्रता की एक मेज है:
मानक एकाग्रता (एनजी / एमएल)
0 0
1 0.17
2 0.94
3 2.63
4 10.4
5 26.9
नियंत्रण # 1 1.22 ± 0.33 एनजी / एमएल
नियंत्रण # 2 4.97 ± 1.25 एनजी / एमएल

टेबल मानकों और नियंत्रण के 1. सांद्रता वाणिज्यिक एलिसा किट में शामिल थे।

  1. निम्नलिखित सांद्रता (तालिका 2) पर 10% मानव सीरम में rhGH हार्मोन से मिलकर जो नमूने तैयार:
<मजबूत> नमूना एकाग्रता (एनजी / एमएल)
1 0.025
2 0.2
3 0.5
4 2.5
5 10
6 30

टेबल 10% सीरम में तैयार rhGH नमूनों की 2. सांद्रता।

  1. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से (triplicates में) प्रत्येक मानक, नियंत्रण और नमूना के 50 μl जोड़ें। कुओं को सील करने और कोमल झटकों के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर मानकों, नियंत्रण, और rhGH नमूने हे / एन के साथ सेते हैं।

7. एलिसा प्रोटोकॉल (2 दिन)

  1. एक प्रकार के बरतन से थाली निकालें और यह पहले परख के साथ आगे बढ़ने के लिए आर टी (15-20 मिनट) को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. हटाये विरोधी rhGH एचआरपी, संयुग्म बफर, धोने बफर (200x), वर्णकोत्पादक TMB (tetramethylbenzidine), एकरेफ्रिजरेटर से घ रोक अभिकर्मक और आरटी वार्मिंग अनुमति देते हैं।
  3. अभिकर्मक तैयार: (निर्माता विनिर्देशों के अनुसार)
    1. संयुग्म बफर के साथ विरोधी rhGH एचआरपी 40x पतला। आसुत जल से 200x गिराए द्वारा धो बफर तैयार करें।
  4. , प्रत्येक कुएं में एंटी rhGH एचआरपी रूप साधना के 50 μl जोड़ें कुओं सील और धीरे से मिलाते हुए, जबकि 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. कुओं से समाधान छानना और प्लेट पलटना और एक शोषक ऊतक पर सूखे नल। तब प्रत्येक कुएं में धो बफर के 200 μl जोड़ें।
  6. एक शोषक ऊतक पर धोने के समाधान और नल सूखे छानना। इस चरण 3 बार दोहराएँ।
  7. धोने कदम के बाद 15 मिनट के भीतर प्रत्येक कुएं में Chromogen के 100 μl जोड़ें। धीरे मिलाते हुए, जबकि अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। समाधान बेरंग से नीले रंग की बारी है।
  8. प्रत्येक कुएं में रोक अभिकर्मक के 100 μl जोड़ें। समाधान नीले रंग से पीले रंग की बारी है। इसके तत्काल बाद, वें पढ़एक microplate रीडर का उपयोग अच्छी तरह से प्रत्येक पर 450 एनएम का ई absorbance।
  9. प्रदान की मानकों (0-5) के लिए मानक वक्र प्लॉट। तब प्रत्येक नमूने की एकाग्रता बनाम 10% सीरम नमूनों में rhGH के ऑप्टिकल घनत्व साजिश है।

Representative Results

SPRI और नैनो SPRI (NanoEnhancers रोजगार SPRI) के प्रदर्शन के एक जटिल माहौल में rhGH का पता लगाने के लिए एलिसा के साथ तुलना में किया गया था। इन तरीकों के सेटअप में मतभेद संक्षेप में यहां बताया गया है। SPRI (प्रत्यक्ष पता लगाने, चित्रा 1) के लिए, कब्जा एंटीबॉडी सतह पर स्थिर है और उसके बाद नमूना इंजेक्ट किया जाता है और सेंसर की सतह के लिए विश्लेष्य के बंधन वास्तविक समय और लेबल मुक्त ढंग से सीधे मापा जाता है। विश्लेष्य सेंसर सतह को बांधता के बाद हालांकि, नैनो SPRI (चित्रा 1) के साथ, एक लगातार इंजेक्शन SPRI संकेत बढ़ाना पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ लेपित क्वांटम डॉट्स के साथ पीछा किया जाता है।

आकृति 1
चित्रा 1. ग में rhGH का पता लगाने के प्रत्यक्ष-मोड (SPRI) और प्रवर्धित-मोड (नैनो SPRI) की तुलना एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व अशिष्ट नमूने हैं। ligands (rhGH या आईजीजी विशिष्ट एंटीबॉडी) SPRI biochip पर एक सरणी प्रारूप में स्थिर रहे थे। लक्ष्य प्रोटीन (rhGH) सेंसर की सतह के लिए शुरू की गई मानव सीरम में नुकीला सीधे (SPRI) का पता चला रहे हैं और क्रमिक रूप से NanoEnhancers (नैनो SPRI) के साथ प्रकाश डाला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एलिसा के लिए के रूप में, multiwell प्लेटों पहले से ही कब्जा एंटीबॉडी के साथ पहले से क्रियाशील आने और उसके बाद नमूना पेश किया है, ब्याज की विश्लेष्य बाध्य होगा। एक का पता लगाने के एंटीबॉडी सब्सट्रेट अलावा द्वारा पीछा शुरू की है। ऑप्टिकल घनत्व तो 450 एनएम पर मापा जाता है। इस अध्ययन में, एक वाणिज्यिक एलिसा किट (चित्रा 2) rhGH 10% मानव सीरम में नुकीला को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

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चित्रा 2. एलिसा परख प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। rhGH प्रोटीन (नीले अंडाकार) rhGH के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (पीला) के साथ पहले से क्रियाशील कर दिया है कि कुओं के लिए शुरू की है। गैर विशिष्ट बातचीत हॉर्सरैडिश peroxidase (बैंगनी एचआरपी) के साथ prefunctionalized एक का पता लगाने के एंटीबॉडी की शुरूआत के बाद धोने बफर के साथ कुओं rinsing द्वारा समाप्त हो जाते हैं। समाधान सब्सट्रेट tetramethylbenzidine (TMB, सोना) जोड़ने के बाद रंग में बदल जाएगा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3 rhGH का अनुमापन वक्र 10% मानव सीरम में नुकीला और 450 एनएम पर प्राप्त आयुध डिपो के खिलाफ साजिश रची है प्रतिनिधित्व करता है। एक अच्छा रेखीय प्रतिक्रिया मनाया गया और पता लगाने की सीमा 1 एनजी / एमएल होने के लिए निर्धारित किया गया था। वर का गुणांकiation (सीवी) अच्छा reproducibility सुझाव 6.5% थी।

चित्र तीन
RhGH की चित्रा 3. एलिसा डेटा विश्लेषण। एकाग्रता 450 एनएम प्राप्त आयुध डिपो के खिलाफ साजिश रची है सीरम में नुकीला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसके बाद, मानव सीरम में नुकीला rhGH का पता लगाने के SPRI के साथ मूल्यांकन किया गया था। RhGH का प्रत्यक्ष पता लगाने इसी एकाग्रता ढाल वक्र (चित्रा 4) के साथ हुई, प्रत्येक बिंदु प्रत्येक एकाग्रता के लिए तीन SPRI गतिज घटता से गणना की भावना अंतर का औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। पता लगाने की सीमा (लोद) 3.61 एनजी / एमएल होने के लिए निर्धारित किया गया था। SPRI प्रत्यक्ष पता लगाने परख परख के CV के रूप में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थाकेवल 4.1% थी।

चित्रा 4
एचजीएच चित्रा 4. प्रत्यक्ष SPRI का पता लगाने के लिए 10% मानव सीरम में नुकीला। एचजीएच के विभिन्न मात्रा के इंजेक्शन के बाद परिणामी सामान्यीकृत SPRI गतिज साजिश एक उच्च नमक बफर के इंजेक्शन (धराशायी खड़ी रेखा) गैर को दूर करने के द्वारा पीछा मानव सीरम में नुकीला विशिष्ट बातचीत। एचजीएच के विभिन्न मात्रा के बंधन का प्रतिनिधित्व एक एकाग्रता ढाल वक्र biotinylated एचजीएच-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ prefunctionalized किया गया है कि सेंसर की सतह के लिए मानव सीरम में नुकीला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

SPRI biosensor की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए, NanoEnhancers में क्रमिक रूप से कर रहे हैं (QDs का पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ-क्रियाशील पूर्व)rhGH की उपस्थिति उजागर करने के क्रम में संवेदक की सतह के लिए पेश मानव सीरम में नुकीला। । के हित इमेजिंग के नियंत्रित क्षेत्रों पर चित्रा 5; पृष्ठभूमि घटाव के बाद, NanoEnhancers न्यूनतम संकेत परिवर्तन (इम्यूनोग्लोबिन जी (आईजीजी) विशिष्ट एंटीबॉडी, भावना में 0.38% परिवर्तन के साथ, तथापि, 7.9% तक biosensor प्रतिक्रिया बढ़ाना करने में सक्षम थे सेंसर सतह rhGH विशिष्ट एंटीबॉडी है कि ब्याज की ही क्षेत्रों अनुभव गतिज sensorgram प्रतिक्रिया के साथ सीधे corroborating सबसे बड़ा विपरीत परिवर्तन स्थिर कि पता चला।

चित्रा 5
चित्रा 5. एक पूर्व पर एक सैंडविच परख 10% मानव सीरम में नुकीला। SPRI गतिज साजिश बफर में rhGH (30 एनजी / एमएल) के इंजेक्शन के बाद (10 मिमी पीबीएस, 150 मिमी सोडियम क्लोराइड, पीएच = 7.4) का उपयोग कर rhGH की जांच 11-mercaptoundecanoic एसिड / rhGH- साथ -functionalized चिपतब पता लगाने के एंटीबॉडी लेपित क्वांटम डॉट्स (NanoEnhancers) के अलावा द्वारा पीछा बीएसए के साथ अवरुद्ध विशिष्ट एंटीबॉडी और नियंत्रित आईजीजी एंटीबॉडी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नैनो SPRI biosensor का साध्यता प्रदर्शित करने के लिए, कच्चे तेल के नमूने में rhGH की सीमा को मापने मूल्यांकन किया गया था। 0.25 स्नातकोत्तर / एमएल / एमएल 30,000 पीजी से एक विस्तारित काम कर रहे सीमा NanoEnhancers (चित्रा 6) के अलावा के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में हुई। यह अनुमापन वक्र पर प्रत्येक बिंदु तीन स्वतंत्र प्रयोगों से औसत निकाला जाता है कि ध्यान देने योग्य है। नतीजतन, पता लगाने की निचली सीमा 9.20 स्नातकोत्तर / एमएल होने की गणना की और विभिन्नता का गुणांक 20% था।

चित्रा 6
चित्रा 6।एचजीएच की नैनो SPRI का पता लगाने के लिए मानव सीरम में नुकीला। मानव सीरम नमूनों के लिए hGH_specific_Anti-QDs प्रवर्धित संकेत की सामान्यीकृत SPRI गतिज साजिश प्रतिनिधित्व एचजीएच के विभिन्न सांद्रता के साथ नुकीला। (ग्रे) एक ऊर्ध्वाधर धराशायी लाइन चल रहा है बफर के इंजेक्शन बिंदु प्रतिनिधित्व करता है। (ख) एचजीएच के विभिन्न मात्रा के इंजेक्शन के बाद NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDs) के बंधन का प्रतिनिधित्व एक एकाग्रता ढाल वक्र 11-mercaptoundecanoic एसिड / एचजीएच विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ prefunctionalized किया गया है कि सेंसर की सतह के लिए मानव सीरम में नुकीला। क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

इसके बाद, एकाग्रता के एक समारोह के रूप में एसपीआर परावर्तन की अवस्था में होता है कि परिवर्तन प्रत्यक्ष और NanoEnhancer bioassay विधि (चित्रा 7) के बीच तुलना में था। प्रत्यक्ष डे के लिए25 और 0.25 स्नातकोत्तर / एमएल के बीच tection तकनीक, संकेत पठार के लिए शुरू कर दिया है और इन सांद्रता 3 एनजी / एमएल (चित्रा 7) के लोद नीचे गिरने के रूप में यह आश्चर्य की बात नहीं है। इसी तरह, प्रवर्धित तकनीक के लिए, 9.2 स्नातकोत्तर / एमएल संकेत के लोद नीचे सांद्रता पठार के लिए शुरू कर दिया है और वास्तव में कोई भिन्नता देखी गई।

चित्रा 7
चित्रा नैनो SPRI साथ SPRI का एक तुलनात्मक विश्लेषण 7.। इस बार ग्राफ 30,000 NanoEnhancers (प्रवर्धित का पता लगाने) का इंजेक्शन द्वारा पीछा मानव सीरम में नुकीला rhGH की शुरूआत के बाद परावर्तन (% आर) में परिवर्तन प्रतिशत (प्रत्यक्ष पता लगाने) को दर्शाया गया है स्नातकोत्तर / एमएल, 2.5 स्नातकोत्तर / एमएल 250 स्नातकोत्तर / एमएल, 25 स्नातकोत्तर / एमएल, और 0.25 स्नातकोत्तर / एमएल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(8 चित्रा) नहीं दिखा था। RhGH rhGH एंटीबॉडी के साथ क्रियाशील बहुत ही जगह पर इंजेक्ट किया गया था सीरम के नमूने में नुकीला हालांकि, जब संकेत वृद्धि मनाया गया। अंत में, नैनो SPRI मंच rhGH के लिए उत्कृष्ट विशिष्टता और चयनात्मकता का प्रदर्शन किया है।

आंकड़ा 8
8 चित्रा rhGH की दिशा में नैनो SPRI चयनात्मकता का आकलन। एस में rhGH (काला) और IGF-1 (लाल) के इंजेक्शन के बाद नैनो SPRI biosensor प्रतिक्रियाpiked सीरम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक सहसंबंध विश्लेषण SPRI संकेत तीव्रता और एलिसा ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों (9 चित्रा) के बीच संबंध का निर्धारण करने के पियर्सन सहसंबंध गुणांक का उपयोग किया गया था। एक पी मूल्य 0.01 <महत्वपूर्ण माना जाता था। इस ग्राफ में सचित्र, spri और एलिसा द्वारा मापा नुकीला मानव सीरम में rhGH स्तरों के बीच एक अच्छा संबंध है। आर मूल्य 9 विभिन्न नमूनों के लिए 0.9263 था।

9 चित्रा
एलिसा और नैनो SPRI के बीच 9 चित्रा पियर्सन सहसंबंध विश्लेषण। भूखंड एलिसा ऑप्टिकल घनत्व (एक्स अक्ष) मूल्यों के साथ नैनो SPRI संकेत तीव्रता (वाई अक्ष) संबद्ध। (नाशपातीसहसंबंध गुणांक एन = 9, पर आर = 0.9263, पी = ०.०००००१८३)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (कश्मीर डी) एलिसा के लिए GraphPad सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निर्धारित किया गया था। गणना कश्मीर घ मूल्य लगभग 79 एनएम (3 टेबल) था। पर (कश्मीर) और बंद (कश्मीर घ) दरों एलिसा द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है। हालांकि, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, प्रत्यक्ष पहचान पद्धति एक rhGH अणु से मेल खाती है कि 22 केडीए की आणविक जन का उपयोग कर 23 बजे से कश्मीर घ मूल्य के साथ हुई। पर और दरों बंद क्रमशः 6.1 X10 7 एम -1 एस -1 और 1.33 x 10 -3 सेकंड -1, होने की गणना की गई। यह स्वाभाविक है कि अनुवाद के लिए प्रति सेकंड rhGH और एंटीबॉडी परिसरों क्षय का 0.13%। एक के लिए के रूपmplified SPRI प्रयोग, एक मजबूत समग्र बातचीत की गणना बंधन आत्मीयता के रूप में NanoEnhancers और rhGH के बीच मनाया गया 4:03 होने के लिए निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, एक मजबूत एसोसिएशन दर कब्जा एंटीबॉडी से NanoEnhancers और rhGH के लिए मनाया गया / rhGH, तथापि हदबंदी दर चलता है कि प्रति सेकंड NanoEnhancer / rhGH / कब्जा एंटीबॉडी क्षय का 0.26%।

-3 सेकंड -1
विधि कश्मीर डी (आत्मीयता) कश्मीर एक (ऑन-दर) कश्मीर घ (ऑफ दर) लोद
एलिसा 79.45 x 10 -9 एम एनए एनए 1 एनजी / एमएल
SPRI 23.2 x 10 -12 एम 6.1 10 x 7 एम -1 सेकंड -1 3.61 एनजी / एमएल
नैनो SPRI 4.33 x 10 -12 एम 7.54 X10 8 एम -1 सेकंड -1 2.62 X10 -3 सेकंड -1 0.0092 एनजी / एमएल

आत्मीयता के पटल 3. पूर्ण गतिज डेटा विश्लेषण। मूल्यांकन, दर-ऑन और ऑफ दर GraphPad (एलिसा) और डेटा विश्लेषण (SPRI और नैनो SPRI) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिरक्षी प्रतिक्रियाओं की। एक rhGH अणु से मेल खाती है कि 22 केडीए की आणविक जन का उपयोग कर उत्सुकता के निर्धारण के लिए चुना गया था। पता लगाने की सीमा एक्सेल का उपयोग कर सभी तीन अध्ययन के लिए निर्धारित किया गया है।

Discussion

एचजीएच, एक स्वाभाविक रूप से हार्मोन के अनियमित स्तर, मानव विकास और विकास को प्रभावित करने वाले कई चिकित्सा विकारों से जोड़ा गया है। इसके अलावा, rhGH के exogenous प्रशासन आमतौर पर उनके प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए एक डोपिंग एजेंट के रूप में, यह मना किया है, भले ही एथलीटों द्वारा इस्तेमाल किया जाता है। अंतर्जात रूप से बहिर्जात एचजीएच भेद करने में कठिनाई से rhGH दुरुपयोग परिणाम का पता लगाने में चुनौतियां। जैसे, बहिर्जात एचजीएच का पता लगाने के लिए वर्तमान मंजूरी दे दी तकनीक 20 केडीए isoform के संबंध में 22 केडीए एचजीएच isoform के अनुपात को मापने पर निर्भर करता है। कई एचजीएच की माप के लिए isoform परीक्षण की मांग है इसलिए, सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में समय की एक छोटी अवधि के भीतर एक साथ isoforms के बाद से, हम एक अच्छी जोड़ी के रूप में SPRI मंच माना जाता है। इसके अलावा, अंतर्जात एचजीएच स्तर इसलिए पहचान प्रणाली उच्च सपा के साथ आराम से इस सीमा को मापने के लिए सक्षम होना चाहिए खून में एक बहुत कम स्तर (0.03 एनजी / एमएल) के लिए उतार चढ़ावecificity। नतीजतन, हम भी एचजीएच के लिए नैदानिक ​​उपकरण के रूप में इस अध्ययन में नैनो spri की क्षमता की जांच की और SPRI और शास्त्रीय प्रतिरक्षा एलिसा के साथ सीधे तुलना में।

इस अध्ययन से प्राप्त परिणामों के आधार पर, spri और नैनो SPRI विधि का मुख्य लाभ rhGH सांद्रता अधिक पारंपरिक विधि एलिसा की तुलना में एक तेज तरीके से मापा जा सकता है। नैनो SPRI प्रक्रिया में अतिरिक्त कदम के कारण 2 घंटा की आवश्यकता है, जबकि प्रत्यक्ष पता लगाने विधि के साथ एक नमूने में rhGH स्तर को मापने के लिए एक मानक अवधि 1 घंटा था। कुल मिलाकर, spri और नैनो SPRI प्रयोगों के साथ, एक नमूना के इंजेक्शन से पहले, एक अंशांकन कदम अत्यधिक की सिफारिश की है। इसके अलावा, यह केवल विशेष बातचीत प्रकट करने के लिए एक उच्च नमक धो बफर इंजेक्षन करने के लिए जरूरी है कि एक परिणाम के रूप में कुछ गैर विशिष्ट बातचीत में मानव सीरम परिणामों की तरह एक कच्चे नमूने का इंजेक्शन। यह एक धोने कदम बिल्कुल जरूरी है कि यह भी ध्यान देने योग्य हैसेंसर की सतह के अणुओं को अवरुद्ध की शुरूआत के बाद, अपार अणुओं को दूर करने के लिए। एलिसा समय की आवश्यकताओं के लिए एक के रूप में नमूने के विश्लेषण के लिए (~ 16-18 घंटा) तक अधिक से अधिक कर रहे हैं। फोकस का पता लगाने की निचली सीमा तुलना करने के लिए गया था के रूप परख की संवेदनशीलता, इस अध्ययन के लिए विशेष रूप से बढ़ाया है के रूप में एक लंबी ऊष्मायन समय की जरूरत है।

सतह के रसायन शास्त्र के चुनाव को एक आवेदन से दूसरे करने के लिए अलग-अलग होगा और इस SPRI तकनीक की सीमा में से एक के रूप में महसूस किया जा सकता है। इस अध्ययन में, एक विस्तृत श्रृंखला और रासायनिक linkers और अवरुद्ध अणुओं के संयोजन सेंसर की सतह के लिए rhGH का इष्टतम बाध्यकारी दक्षता निरीक्षण करने के क्रम में सही संयोजन को प्राप्त करने के लिए मूल्यांकन किया गया। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, बीएसए और खूंटी के संयोजन गैर विशिष्ट बातचीत को कम करने में अच्छी तरह से सेवा की। हालांकि, कब्जा ligand के एक aptamers था, जहां पिछले एक अध्ययन 17 में, खूंटी अकेले सबसे अच्छा अवरुद्ध अणु के रूप में कार्य किया। चरligand के लिए विश्लेष्य की है कि प्रभावित करते बाध्यकारी दक्षता बफर और तापमान भी पीएच पर निर्भर हैं। इसलिए, किसी भी आवेदन के साथ, इन चर अनुकूलित करने की आवश्यकता। इसके अलावा, यह चिप सतह के लिए ligand के इष्टतम खोलना एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। स्थिर ligands की सांद्रता का एक सीमा के साथ एक अनुमापन प्रयोग अध्ययन शुरू करने से पहले किया जाता है। यह कोई अवशिष्ट तरल बचे हुए है यह सुनिश्चित रूप एलिसा के लिए के रूप में, प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम microplate दोहन से कुओं से धो बफर छानना करने के लिए किया गया था। किसी भी अवशिष्ट तरल लक्ष्य नमूना के संकेत पढ़ने के साथ दखल के रूप में पिपेट साथ बफर धोने को हटाने के लिए पर्याप्त नहीं था।

संवेदनशीलता के संदर्भ में, एलिसा (1 एनजी / एमएल) SPRI (3.61 एनजी / एमएल), लेकिन नैनो SPRI (9.20 स्नातकोत्तर / एमएल) के बराबर है जिससे rhGH के निचले जैविक स्तर पर माप सक्षम, परिमाण के आदेश तीन से संवेदनशीलता में सुधार 0.03 एनजी / एमएल। जैसा कि हम पहले एक रिपोर्ट के रूप में6,17, NanoEnhancers द्वारा दिया संकेत वृद्धि एक जन लोडिंग प्रभाव और फिल्म सोना nanostructures के लिए NIR fluorophores और प्रचार कर plasmons सतह के बीच मौजूद है कि मजबूत युग्मन के लिए जिम्मेदार ठहराया है। हालांकि, नैनो SPRI प्रक्रिया के लिए एक अतिरिक्त कदम कहते हैं, संवेदनशीलता के इस स्तर को विभिन्न दुकानों में SPRI प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों चौड़ा कर सकते हैं।

एलिसा ही आत्मीयता के मूल्यों को रिपोर्ट कर सकते हैं, जबकि SPRI एंटीबॉडी / rhGH बातचीत के (कश्मीर डी, कश्मीर एक और कश्मीर घ) के वैज्ञानिकों ने एक पूर्ण गतिज प्रोफ़ाइल प्रदान करता है। विभिन्नता का गुणांक (सीवी) अच्छा reproducibility, सुझाव SPRI (4.1%) और एलिसा (6.5%) के लिए 10% नीचे था। सेंसर चिप पर स्थिर कब्जा एंटीबॉडी एलिसा 96 अच्छी तरह से थाली में स्थिर एंटीबॉडी से अलग कर रहे हैं क्योंकि एलिसा और SPRI आत्मीयता मूल्यों से अलग हैं। नैनो spri के लिए के रूप में एक उच्च सीवी मूल्य (20%) मनाया गया। त्रुटि के एक स्रोत के रूप में योगदान कर सकते हैं कि कई मापदंडों रहे हैंसीवी निर्धारण के लिए रु। उदाहरण के लिए, विश्लेष्य का एक बहुत कम एकाग्रता मापा जा रहा है नैनो SPRI प्रयोग के साथ, NanoEnhancers के अलावा प्रक्रिया में एक और कदम के लिए कहते हैं और प्रयोग मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया गया था। नैनो SPRI और एलिसा के बीच एक बहुत अच्छा संबंध नुकीला मानव सीरम में rhGH का पता लगाने के लिए हासिल की थी। अंत में, एलिसा विधि ही यह एचजीएच के साथ मामला है यह मुश्किल है, वास्तविक समय की निगरानी और बहुसंकेतन आवश्यकता होती है स्थितियों में उपयोग करने के लिए बनाता है, जो समय लगता है, लेकिन एक विश्वसनीय तकनीक हो सकता है। इसके अलावा, spri एलिसा पर प्रदान करता है कि इस अध्ययन में सीधे जांच नहीं था कि एक अधिक आकर्षक फीचर, एक साथ वास्तविक समय में बातचीत के सैकड़ों उपाय करने की क्षमता है। इसलिए भविष्य में, नैनो SPRI विधि एक व्यवहार्य नैदानिक ​​नैदानिक ​​उपकरण के रूप में अपनी क्षमता की जांच के क्रम में विभिन्न सांद्रता में सीरम में मौजूद कई बायोमार्कर साथ वास्तविक समय में (बहुसंकेतन) का पता लगाने के लिए मूल्यांकन किया जाएगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody  Acris Antibodies DM1015
Bovine Serum Albumin  Fisher Bioreagents  BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody  Acris Antibodies AM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  TCI America D1601
Ethanolamine Acros Organics  141-43-5
Ethanol Fisher Chemicals   BP2818-4
Human HGH ELISA Kit  invitrogen  KAQ1081
Human Serum  Sigma Aldrich  H4522  
Rabbit IgG Antibody  Sigma Aldrich  I5006
11-mercaptoundecanoic acid  Sigma Aldrich  450561
Nanostrip  Cyantek 
N-hydroxysuccinimide  Sigma Aldrich  130672
Phosphate Buffer Saline Invitrogen  00-3002
Polyethylene glycol (800 Da)  Sigma Aldrich  729108
Recombinant Human Growth Hormone  Calbiochem 869008
Sodium Acetate Sigma Aldrich  127-09-3
Sodium Chloride  Fisher Chemicals   7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots  Life Technologies  Q10171MP
UV/Ozone Procleaner Bioforce Nanosciences 
Microwave reactor   CEM Corporation Discover system 
SPRi-Arrayer   LabNext Xactll Microarray System 
SPR biochip HORIBA 
SPRi-Lab+ HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader  BioTek 
ScrubberGen HORIBA Data Analysis software 

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 107 रक्त बायोमार्कर नैनोकणों एंटीबॉडी प्रतिरक्षा आत्मीयता और संवेदनशीलता।
SPRI, नैनो SPRI और एलिसा assays का उपयोग सीरम में मानव विकास हार्मोन का तुलनात्मक विश्लेषण
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Vance, S., Zeidan, E., Henrich, V. C., Sandros, M. G. Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays. J. Vis. Exp. (107), e53508, doi:10.3791/53508 (2016).

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