Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Komparativ analyse av Human Growth Hormone i Serum ved hjelp spri, Nano-spri og ELISA-analyser

Published: January 7, 2016 doi: 10.3791/53508
* These authors contributed equally

Summary

Den foreslåtte arbeids vurderer den diagnostiske potensiale for direkte og forsterket overflate plasmon resonance imaging (Spri) analyser, særlig for påvisning av rekombinant humant veksthormon i pigg humant serum, ved å sammenligne Spri resulterer direkte med kommersielt tilgjengelig enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) kit.

Abstract

Følsomme og selektive fremgangsmåter for påvisning av humant veksthormon (hGH) over et bredt spekter av konsentrasjoner (høye nivåer av 50-100 ng ml - 1, og minimale nivåer på 0,03 ng ml - 1) i sirkulerende blod er viktig som variable nivåer kan indikere endret fysiologi. For eksempel kan vekstforstyrrelser som opptrer i barndommen diagnostiseres ved å måle nivåene av hGH i blod. Også misbruk av rekombinant hGH i idrett ikke bare utgjør et etisk problem det presenterer også alvorlige helsetrusler til overgriperen. En populær strategi for måling av hGH misbruk, er avhengig av detektering av forholdet mellom 22 kDa hGH til total hGH, som ikke er 22 kDa endogene nivåer slipp etter eksogen rekombinant hGH (rhGH) administrering. Surface plasmonresonans imaging (spri) er et analytisk verktøy som tillater direkte (label-free) overvåking og visualisering av biomolekylære interaksjoner ved å registrere endringer i brytnings index i tilknytning til føleroverflaten i sann tid. I motsetning til dette, den mest brukte kolorimetrisk metode, enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) bruker enzym-merkede antistoffer til påvisning indirekte måle analyttkonsentrasjon etter tilsetning av et substrat som induserer en fargeendring. For å øke følsomhet, bruker forsterket spri en sandwich analyseformat og nær infrarøde kvanteprikker (QDS) for å øke signalstyrken. Etter direkte Spri påvisning av rekombinant rhGH i piggete human serum, er Spri signal forsterkes av sekvensiell injeksjon av deteksjonsantistoff belagt med nær-infrarød QDS (Nano-Spri). I denne studien ble det diagnostiske potensialet i direkte og forsterket Spri vurderes for å måle rhGH piggete i humant serum og sammenlignet direkte med egenskapene til en kommersielt tilgjengelig ELISA kit.

Introduction

Menneskelig veksthormon (HGH) er en 191 aminosyrepeptid (22 kDa) produsert av hypofysen og direkte slippes ut i blodbanen. Interaksjoner mellom hypothalamus peptid veksthormon-frigjørende hormon (GHRH) og somatotropinet indusere pulsatile sekret av HGH. Som et resultat av nivåene av hGH variere fra høyder på 50-100 ng / ml til lavtrykk i 0,03 ng / ml området 1. Mangel eller overskudd av hGH i kroppen kan fremkalle et bredt spekter av unormale fysiologiske symptomer. For eksempel kan overskytende nivåer av hGH føre til gigantism 2 og diabetes tre. Utarmet nivåer av HGH føre til lavt blodsukker hos nyfødte, og svak beintetthet og depresjon hos voksne 4.

Administrasjon av rekombinant form av hGH (rhGH) forbedrer muskelmasse og samtidig redusere kroppsfett. Som sådan, ble dette stoffet stoffet av valget for profesjonelle og amatører idrettsutøvere som det forbedrer fysisk styrke som overfører en advantage i konkurranseidrett. rhGH er bannlyst av World Anti-Doping Agency (WADA) 5,6 og mye innsats fra internasjonale forskere har fokusert på å utvikle tester som kan oppdage sin tilstedeværelse eller anabole effekten.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) har vært den foretrukne fremgangsmåten for bestemmelse av hGH i fullblod 7. Selv er ELISA en pålitelig teknikk gir god følsomhet og selektivitet, er det relativt tid- og arbeidskrevende. I tillegg bygger ELISA på indirekte påvisning av hGH ved å ansette enzymatiske tags. I motsetning til dette, overflate-plasmonresonans (SPR) muliggjør deteksjon av hGH direkte uten bruk av etiketter i sanntid. Påvisningen Prinsippet bak SPR omfatter en sensoroverflate som består av et prisme som er belagt med et tynt metall-lag (gull eller sølv); når en monokromatisk polarisert lys samhandler med metalloverflaten, er "overflateplasmons" generert. Bindingen av en analytttil en overflatereseptor immobilisert på metalloverflaten perturbs resonansbetingelser som resulterer i en forskjøvet resonans dip, som deretter kan korreleres til analyttkonsentrasjonen. SPR-baserte biosensorer er nå kommersielt tilgjengelig som tilbyr en real-time, etikett fri teknikk for å overvåke biomolekylære bindende hendelser og biokjemiske reaksjoner 8-10. Mer nylig ble Spri utviklet som svar på behovet for multipleksing (dvs. overvåke flere bindingsbegivenheter samtidig), som ikke var mulig i klassiske SPR biosensorer. Dermed har spri dukket opp som et verktøy for å overvåke flere bindende hendelser samtidig. Nåværende Spri systemer er basert på mikroskopisk avbildning av en overflate som eksiteres med lys ved en spesifikk vinkel og 10 bølgelengde. Bildet blir deretter tatt bort på en CCD (CCD) matrise.

Hittil har det vært et par SPR-baserte analyser utviklet for å oppdage hGH 11-14. En spesiell strategi, Kjent som isoform metode 15, er avhengig av detektering av forholdet mellom 22 kDa hGH til total hGH, som ikke er 22-kDa endogene nivåer slipp etter eksogen rhGH administrering. Nylig har de Juan-Franco et al. 11 rapportert på utvikling av et SPR-baserte immunosensor for selektiv detektering av 22 kDa og 20 kDa hGH-isoformer i humane serumprøver. Monoklonale antistoffer som er spesifikke for hver isoform ble immobilisert direkte på gull sensoren tillater måling av begge isoformer samtidig i en enkelt injeksjon med en deteksjonsgrense ved 0,9 ng ml -1. Alternativt har SPR blitt brukt til å screene antistoffer med høy spesifisitet til hGH 13. Dersom konsentrasjonen av målanalytten faller under spri systemets deteksjonsgrensen (<nM), må man ty til å forsterke Spri signal via utnyttelse av nanopartikler (Nano-Spri). Slik SPR-basert amplifikasjon er godt dokumentert i litteraturen 16-19 for various typer analytt og overflater.

I dette arbeidet ble det analytiske potensialet i spri og Nano-Spri baserte biosensorer undersøkt, særlig for deteksjon av rhGH i pigg humant serum, og sammenligning av dets evne til direkte deteksjon til ELISA. Følgende parametere skal gjennomgås og vurderes: deteksjon tid, følsomhet, kinetisk profil, reproduserbarhet og spesifisitet.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsninger og proteinprøver for Spri

  1. Forbered 100 ml lav salt fosfatbufret saltvann (PBS) løsning inneholdende 10 mM fosfat, 150 mM natriumklorid, og pH 7,4.
  2. Forbered 50 ml høy salt PBS-oppløsning inneholdende 10 mM fosfat, 750 mM natriumklorid, og pH 7,4.
  3. Forbered 5 ml 10 mM natriumacetat.
  4. Forbered et lager av 5 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) fortynnet i lav saltoppløsning PBS.
  5. Tilbered en stamløsning av rekombinant humant veksthormon (rhGH) ved en konsentrasjon på 1 ug / ml i PBS-løsning med lavt saltinnhold.
  6. Forbered stamløsninger av anti-rhGH og negative kontroll-antistoff i en konsentrasjon på 100 ug / ml.

2. Forbered Spri Chip for antistoff Array

  1. Rens chip ved sonikering i 120 ml stabilisert piraja oppløsning (3: 1 konsentrert svovelsyre og 30% hydrogenperoksid) i 90 min ved 50 ° C og følger etter skyllingog sonikering med vann i 5 min. Deretter skyller chip med etanol og tørr med nitrogenstrøm.
  2. Plasser gull brikken i et UV / Ozone kammer i 30 min for å fjerne eventuelle forurensninger.
  3. Legg 150 mg av 11-mercaptoundecanoic syre til 20 ml etanol i et reagensrør som inneholder en rørestav og et rør cap.
  4. Plasser chip i reagensglasset og mikrobølgerøret / chip ved 50 V og 50 ° C i 5 min.
  5. Skyll chip med etanol og suge i etanol i 5 min.
  6. Følg med en skyll med vann og bløt i vann i 5 min.
  7. Legg 150 mg 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid i 20 ml vann i et reagensrør som inneholder en rørestav og et rør cap. Mikrobølgeovn chip som i trinn 2.4.
  8. Skyll chip med vann og bløt i vann i 5 min.
  9. Legg 150 mg N-hydroksysuccinimid i 20 ml vann i et reagensrør som inneholder en rørestav og et rør cap. Mikrobølgeovn chip som i trinn 2.4.
  10. Skyll chip med vann og bløt i vann i 5 min.
  11. Behandling anleggre 250 uM polyetylenglykol (PEG, 800 Da) i 20 ml vann i et reagensrør som inneholder en rørestav og et rør cap. Mikrobølgeovn chip som i trinn 2.4.
    Merk: Mikrobølgebehandling PEG800 på overflaten av sensoren er utført som en blokkerende trinn for å hindre ikke-spesifikk binding av serumproteiner og kvante dot komplekser senere brukt i forsøket. Dette oppnås ved PEG800 omsetning med ikke-okkuperte nakne gull steder på brikken.
  12. Skyll chip med vann og bløt i vann i 5 min.
  13. Forbered 15 ug / ml anti-rhGH antistoffoppløsningen og negative kontroll oppløsning av anti-immunoglobulin G (anti-IgG) og tilsett 10 ul av hver antistoffløsning til en brønn i en 384 brønners plate.
  14. Designe spotting mønster i microarrayer (4 x 7 kvadranter for hver prøve) og spot chip med antistoffer ved hjelp av en 500 mikrometer Teflon tippet pin.
  15. Inkuber spotted chip i 2 timer ved RT og under en fuktig atmosfære av 75% eller høyere.
  16. Skyll og suge chip i vann for5 min. Deretter tørr chip med nitrogen.

3. Spri Experiment Setup og Blokkering

  1. Initial instrumentet og velg katalogen. Velg sanntid kamera og begynne sprøytepumpen på 1 ml / min i 10 ml avgasset vann. Sett chip inn i instrumentet og holde injisere vann inntil alle bobler er fjernet.
  2. Etter skylling chip med 10 ml vann, starte bilde oppkjøpet, og følger ved å bytte buffer til lav salt PBS og la den gå på 1 ml / min for 5 ml og deretter sakte strømningshastighet ned til 20 mL / min i 20 min .
  3. Velge den svært kontrast bilde, som viser de immobiliserte antistoffene flekket på brikken.
  4. Velge og definere de 400 mikrometer individuelle runde flekker som tilsvarer de immobiliserte antistoffer.
  5. Etter instrument sporer plasmon kurver, velg en arbeidsvinkel som har den høyeste skråningen i reflektivitet kurver.
  6. Flow en rennende buffer på 20 pl / min lave sbruke alt PBS gjennom systemet inntil signalet fra alle de valgte stedene stabiliseres.
  7. Installering av BSA (100 ug / ml) i buffer i prøvesløyfen (150 ul) med injeksjonsventilen i lastestilling. Deretter bytte ventilen til injeksjons posisjon for å injisere oppløsningen i strømningscellen.
    Merk: BSA injiseres for å binde seg kovalent til aminet reaktive overflate, vil den resterende ubundet BSA vask av overflaten gjennom bufferen skylling.
  8. Injisere 150 ul av en løsning av 10 mM natriumacetat over overflaten og følge av en 150 ul injeksjon av høy salt PBS.
  9. Injisere 150 ul etanolamin (1 mM) for å deaktivere reaktive amin overflaten.
  10. Injisere 150 ul 10 mM natriumacetat for å vaske overflaten.
  11. Deretter bytter den rennende buffer til PBS med 50 pg / ml BSA ved en strømningshastighet på 250 mL / minutt for en total på 5 ml.
    Merk: 50 pg / ml BSA blir tilsatt til den løpende buffer for ytterligere blokkering av suransikt ved ikke-kovalent opptar de ikke-spesifikke steder, og dette er gjort for ytterligere å redusere ikke-spesifikk binding av serumproteiner til overflaten.
  12. Endring strømningshastigheten til 5 ul / min, og tillate det å stabilisere seg i 20 min.

4. Spri Påvisning av Human Growth Hormone

  1. Fremstille en løsning av en fast konsentrasjon av rhGH (30 000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml og 0,25 pg / ml) i 10% serum og fortynnet i PBS inneholdende 1 mg / ml BSA.
  2. Forberede en 2: 1 løsning ved tilsetning av 1 pl av biotin-merket anti-rhGH deteksjon-antistoffer (6 uM) til 3 pl av streptavidin-belagte nær infrarøde kvanteprikker (1 uM) i et 0,5 ml mikrosentrifugerør, og inkuber i 30 minutter for effektiv kopling .
  3. Injisere 150 ul av hGH tilsatt humant serum oppløsning i injeksjonssløyfe. Dette resulterer i en sterk økning i signal etterfulgt av en sakte dråpe fra den ikke-spesifikt bundet serum skylling av overflaten.
  4. Når skiltetal stabiliserer seg, vaskes overflaten med en oppløsning av 450 mM natriumklorid tilsatt til den rennende buffer.
  5. Fortynn oppløsningen av anti-rhGH deteksjon-antistoffer og kvanteprikker til en konsentrasjon på 10 nM (2: 1) med rennende buffer (PBS med 50 pg / ml BSA) og injisere inn i strømningscellen.

5. Spri Data Analysis

Merk: Etter injeksjonen av rhGH tilsatt humant serum og quantum dot enhancer, oppstår en økning av reflektansendringen som følge av den forsterkede forskyvning av plasmon kurver. Dette resulterer i en forskjell bilde som viser et gråtonebilde korrelere til signalet på brikken.

  1. Importere dataene inn i en dataanalyse program. Plotte Spri signal (% Reflektivitet) versus tid (er), og bestemme forskjellen mellom den anti-rhGH og negative kontroll-antistoff flekker etter den høye saltvasking.

6. ELISA-protokoll (dag 1)

  1. Lagre alle assaykomponenter inkludert in rhGH ELISA kit ved 2-8 ° C. Dette inkluderer den anti-antistoff-belagte rhGH brønners plater, standarder (0-5) i sau serum, kontroller (1 & 2) i humant serum, konjugat buffer, (200x) vaskebuffer, kromogen TMB (tetrametylbenzidin) og stopper reagens.
  2. Oppsett reagensene og følge de fremgangsmåter som er beskrevet i det kommersielle ELISA-sett-protokollen.
  3. For det første tillater den anti-rhGH antistoffbelagt 96-brønner å oppvarmes til romtemperatur før åpning av foliepakke.
  4. Deretter fjerner ønsket antall 8-brønn strips for analyse og forsegle foliepakken inneholder de resterende brønnene og oppbevares ved 2-8 ° C.
  5. Forbered standarder ved rekonstituering i 2 ml destillert vann for standard # 0, i 1 ml destillert vann for standarder (1-5), og i 1 ml destillert vann for kontrollene (1 & 2). Nedenfor er en tabell over de tilsvarende konsentrasjoner av de standarder og kontroller (tabell 1):
Standarder Konsentrasjon (ng / ml)
0 0
1 0,17
2 0,94
3 2,63
4 10.4
5 26.9
Kontroll # 1 1,22 ± 0,33 ng / ml
Kontroll # 2 4,97 ± 1,25 ng / ml

Tabell 1. Konsentrasjon av standardene og kontrollene er inkludert i kommersielt ELISA-sett.

  1. Forbered prøvene som består av rhGH hormon i 10% humant serum ved de følgende konsentrasjoner (tabell 2):
<strong> Sample Konsentrasjon (ng / ml)
1 0.025
2 0.2
3 0.5
4 2.5
5 10
6 30

Tabell 2. Konsentrasjoner av de rhGH prøver fremstilt i 10% Serum.

  1. Tilsett 50 pl av hver standard, kontroll og prøve til hver brønn (i tre paralleller). Forsegle brønnene og inkuber med standarder, kontroller og rhGH prøver O / N ved 4 ° C under forsiktig risting.

7. ELISA Protocol (Dag 2)

  1. Fjern platen fra shaker og la den varme seg opp til romtemperatur (15-20 min) før fortsetter med analysen.
  2. Fjern Anti-rhGH-HRP, konjugat buffer, vaskebuffer (200x), kromogenløsningen TMB (tetrametylbenzidin), end stopp reagent fra kjøleskapet og la oppvarming til RT.
  3. Reagensklargjøring: (i henhold til produsentens spesifikasjoner)
    1. Fortynne Anti-rhGH-HRP 40x med den konjugerte buffer. Klargjør vaskebuffer ved fortynning 200x med destillert vann.
  4. Tilsett 50 ul av anti-rhGH-HRP-konjugat til hver brønn, forsegle brønnene og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter under forsiktig risting.
  5. Dekanter løsning fra brønnene og snus platen og trykk tørr på en absorberende vev. Deretter legger 200 ul vaskebuffer i hver brønn.
  6. Dekanter vaskeløsningen og trykk tørr på en absorberende vev. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
  7. Tilsett 100 ul av kromogen i hver brønn i løpet av 15 min etter vasketrinnet. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur i mørke under forsiktig risting. Løsningene slå fra fargeløs til blå.
  8. Tilsett 100 pl av stopp reagensen i hver brønn. Løsningene slå fra blått til gult. Umiddelbart, lese the absorbansen av hver brønn ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
  9. Plotte standardkurve for de angitte standarder (0-5). Deretter plotte den optiske tetthet av rhGH i 10% serumprøver versus den konsentrasjon av hver prøve.

Representative Results

Ytelsen til Spri og Nano-Spri (SPRI anvendelse av de NanoEnhancers) ble sammenlignet med ELISA for påvisning av rhGH i et komplekst miljø. Forskjellene i oppsettet av disse metodene er beskrevet her kort. For Spri (direkte deteksjon, figur 1), blir fangst-antistoff immobilisert på overflaten, og deretter ble prøven injiseres, og binding av analytt til sensoroverflaten blir målt direkte i sanntid, og etikett-fri måte. Men med Nano-Spri (figur 1), etter at analytten bindes til sensoroverflaten, en påfølgende injeksjon fulgt med kvanteprikker belagt med deteksjon-antistoffer til å forsterke Spri signal.

Figur 1
Figur 1. En skjematisk fremstilling som sammenligner direkte modus (Spri) og amplifisert-modus (Nano-Spri) for påvisning av rhGH i c frekk prøver. ligander (rhGH eller IgG spesifikke antistoffer) ble immobilisert i en rekke format på Spri biochip. Målprotein (rhGH) piggete i humant serum introdusert til sensoroverflaten er direkte registrert (spri) og sekvensielt uthevet med NanoEnhancers (Nano-spri). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Som for ELISA, er multibrønnplater ankommer allerede forhånds funksjonalisert med fangst-antistoff og deretter prøven blir innført, vil analytten av interesse bindes. En deteksjonsantistoff er innført, etterfulgt av tilsetning substrat. Den optiske tetthet ble deretter målt ved 450 nm. I denne studien ble et kommersielt ELISA-sett (figur 2) som brukes til å måle rhGH tilsatt i 10% humant serum.

8 / 53508fig2.jpg "/>
Figur 2. En skjematisk representasjon av ELISA-analyseprosedyre. rhGH protein (blå ovaler) blir introdusert til brønner som har blitt pre-funksjon med monoklonale antistoffer (gul) som er spesifikke for rhGH. Ikke-spesifikke interaksjoner elimineres ved skylling av brønnene med vaskebuffer, fulgt av innføring av et påvisningsantistoff prefunctionalized med pepperrot-peroksidase (HRP, lilla). Løsningen vil endre farge etter å ha lagt underlaget tetrametylbenzidin (TMB, gull). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 representerer titreringskurven av rhGH tilsatt i 10% humant serum, og er plottet mot det oppnådde OD ved 450 nm. En god lineær respons ble observert, og påvisningsgrensen ble bestemt til å være 1 ng / ml. Koeffisienten for Variation (CV) var 6,5% noe som tyder på god reproduserbarhet.

Figur 3
Figur 3. ELISA data analyse. Konsentrasjon av rhGH piggete i serum er plottet mot innhentet OD ved 450 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Deretter ble deteksjon av rhGH tilsatt i humant serum vurderes med Spri. Direkte påvisning av rhGH ført med tilsvarende konsentrasjonsgradient kurven (figur 4), representerer hvert punkt middelverdien av den forskjell i reflektivitet mellom beregnet ut fra tre Spri kinetiske kurver for hver konsentrasjon. Deteksjonsgrensen (LOD) ble bestemt til å være 3,61 ng / ml. Den Spri direkte påvisning analysen var svært reproduserbare som CV av analysenvar bare 4,1%.

Figur 4
Figur 4. Direkte Spri påvisning av hGH tilsatt i 10% humant serum. Den resulterende normaliserte Spri kinetisk plottet etter injeksjonen av forskjellige mengder av hGH tilsatt i humant serum, etterfulgt av injeksjon av en buffer med høyt saltinnhold (stiplet vertikal linje) for å fjerne ikke- -spesifikke interaksjoner. En konsentrasjon gradient kurve som representerer binding av ulike mengder av hGH piggete i humant serum til sensoren overflate som har blitt prefunctionalized med biotinylerte hGH-spesifikt antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å øke følsomheten for Spri biosensor, NanoEnhancers (QDS pre-funksjonalisert med deteksjons antistoffer) er sekvensielt iintroduserte til sensorflaten for å markere tilstedeværelsen av rhGH piggete i humant serum. Etter bakgrunn subtraksjon, NanoEnhancers de var i stand til å forsterke responsen biosensor opp til 7,9%, men med minimal signalendring (Immunoglobulin G (IgG) -spesifikk antistoff, 0,38% endring i reflektivitet, figur 5 på kontrollerte områder av interesse Imaging of. sensoren overflaten avslørte at kun områder av interesse som har rhGH-spesifikke antistoffer immobilisert erfaring den største kontrasten endring bekreftende direkte med kinetic sensorgram respons.

Figur 5
Figur 5. Påvisning av rhGH ved hjelp av en sandwich-assay tilsatt i 10% humant serum. Spri kinetiske plottet etter injeksjonen av rhGH (30 ng / ml) i buffer (10 mM PBS, 150 mM natriumklorid, pH = 7,4) på en pre -functionalized chip med 11-mercaptoundecanoic syre / rhGH-spesifikt antistoff og kontrollere IgG-antistoff deretter blokkert med BSA fulgt av tilsetning av deteksjons antistoffbelagte kvanteprikker (NanoEnhancers). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å demonstrere gjennomførbarhet av Nano-spri biosensor ble måleområde rhGH i råoljeprøver vurderes. En utvidet arbeids- området fra 30 000 pg / ml til 0,25 pg / ml resulterte som en respons på tilsetningen av NanoEnhancers (figur 6). Det er verdt å merke seg at hvert punkt på titreringskurven er i gjennomsnitt fra tre uavhengige eksperimenter. Følgelig ble den nedre grense for påvisning beregnet til 9,20 pg / ml, og variasjonskoeffisient var 20%.

Figur 6
Figur 6.Nano-Spri påvisning av hGH tilsatt i humant serum. Normalisert Spri kinetiske tomt representasjon av hGH_specific_Anti-QDS-forsterkede signal for humane serumprøver tilsatt med forskjellige konsentrasjoner av hGH. En vertikal stiplet linje (grå) representerer injeksjonspunktet for den løpende buffer. (b) En konsentrasjonsgradient kurve som representerer bindingen av NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDS) etter injeksjon av ulike mengder av hGH tilsatt i humant serum til sensoroverflaten som er prefunctionalized med 11-mercaptoundecanoic syre / hGH-spesifikt antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Deretter ble den endring som forekommer i SPR reflektivitet-kurve som en funksjon av konsentrasjonen, sammenlignet mellom den direkte og den NanoEnhancer bioassay-metoden (figur 7). For den direkte deskyttelse teknikk mellom 25 og 0,25 pg / ml, signalet begynte å flate ut, og dette er ikke overraskende ettersom disse konsentrasjonene faller under LOD på 3 ng / ml (figur 7). Likeledes, for den forsterkede teknikk, konsentrasjoner under LOD på 9,2 pg / ml signal begynte å flate ut og viste praktisk talt ingen variasjon.

Figur 7
Figur 7. En sammenlignende analyse av Spri med Nano-Spri. Denne søylediagram viser den prosentvise endring i reflektivitet (% R) etter innføring av rhGH tilsatt i humant serum (direkte påvisning) etterfulgt av injeksjon av NanoEnhancers (amplifisert deteksjons) for 30000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml og 0,25 pg / ml. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

(figur 8). Imidlertid, når rhGH tilsatt i serum prøve ble injisert på samme sted funksjonalisert med rhGH antistoff, ble det observert signalforbedring. I konklusjonen, har Nano-spri plattform demonstrert utmerket spesifisitet og selektivitet for rhGH.

Figur 8
Figur 8. Vurdering av Nano-spri selektivitet mot rhGH. Nano-spri biosensor respons etter injeksjon av rhGH (svart) og IGF-1 (rød) på spiked serum. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En korrelasjonsanalyse ble utført ved anvendelse av Pearson korrelasjonskoeffisient for å bestemme korrelasjonen mellom Spri signalintensitet og ELISA-optiske tetthetsverdier (figur 9). En p-verdi <0,01 ble betraktet som signifikant. Som illustrert i denne grafen, er det en god korrelasjon mellom de rhGH nivåene i pigg humant serum målt ved Spri og ELISA. R-verdien var 0,9263 for 9 forskjellige prøver.

Figur 9
Figur 9. Pearson korrelasjonsanalyse mellom ELISA og Nano-Spri. Plottet korrelerer Nano-Spri signalintensitet (y-aksen) med ELISA optisk tetthet (x-aksen) verdier. (Pearspå korrelasjonskoeffisient n = 9, r = 0,9263, p = 0,00000183). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Likevekts-dissosiasjonskonstanten (KD) ble bestemt ved bruk av GraphPad software for ELISA. Den beregnede K-D-verdien var omtrent 79 nM (tabell 3). De på (K a) og av (K d) priser kan ikke bestemmes av ELISA. Imidlertid, ved hjelp av dataanalyseprogramvare, direkte påvisning metode resulterte med K-D-verdi på 23 pM med molekylmasse på 22 kDa som tilsvarer en rhGH molekyl. Den på og av prisene ble beregnet til å være 6,1 x10 7 M -1 s -1 og 1,33 x 10 -3 sek -1, henholdsvis. Dette betyr i seg selv at 0,13% av rhGH og antistoffkomplekser forråtnelse per sekund. Som for enmplified Spri eksperiment, en sterkere samlet interaksjon ble observert mellom NanoEnhancers og rhGH som beregnes bindende affinitet var fast bestemt på å være 4:03. I tillegg ble en sterkere assosiasjon hastighet observert for NanoEnhancers og rhGH enn fangst-antistoff / rhGH, men dissosiasjon hastighet antyder at 0,26% av NanoEnhancer / rhGH / Capture-antistoffet forråtnelse per sekund.

-3 sek -1
Metode K D (Affinity) K a (on-rate) K d (off-rate) LOD
ELISA 79,45 x 10 -9 M NA NA 1 ng / ml
Spri 23,2 x 10 -12 M 6,1 x 10 7 M -1 sek -1 3,61 ng / ml
Nano-Spri 4,33 x 10 -12 M 7.54 x10 8 M -1 sek -1 2.62 x10 -3 sek -1 0,0092 ng / ml

Tabell 3. Full kinetisk analyse av data. Evaluering av affinitet, på-hastighet og av-hastighet på antistoffresponser ved å bruke GraphPad (ELISA) og dataanalyse (SPRI og Nano-Spri) programvare. Bestemmelsen av aviditet med molekylmasse på 22 kDa som tilsvarer en rhGH molekyl er valgt. Deteksjonsgrensene ble bestemt for alle tre studier med excel.

Discussion

Uregelmessige nivåer av HGH, et naturlig forekommende hormon, har vært knyttet til en rekke medisinske lidelser som påvirker menneskelig vekst og utvikling. Videre er eksogene administrasjon av rhGH ofte brukt av idrettsutøvere, selv om det er forbudt, som et dopingmiddel for å forbedre sine resultater. Utfordringer i å oppdage rhGH misbruk resultatet fra vanskeligheter med å skille eksogene hGH fra endogene formen. Som sådan, den nåværende godkjente teknikk for detektering av eksogent hGH er avhengig av måling av forholdet mellom den 22 kDa hGH isoform i forhold til det 20 kDa isoformen. Siden isoform test krav til måling av fler hGH-isoformer samtidig innenfor en kort tidsperiode i et bredt konsentrasjonsområde, derfor, vurderte vi Spri plattformen som en perfekt match. I tillegg endogent hGH-nivå svinge til et svært lavt nivå (0,03 ng / ml) i blodstrømmen derfor deteksjonssystemet må være i stand til å måle denne serien komfortabelt med høy specificity. Som et resultat har vi også undersøkt i dette studiet potensialet av Nano-Spri som et diagnostisk verktøy for hGH og sammenlignet direkte med Spri og klassisk ELISA immunologisk analyse.

Basert på resultatene oppnådd fra denne studien, er den viktigste fordel av Spri og Nano-Spri metode som rhGH konsentrasjoner kan måles på en raskere måte i forhold til de mer konvensjonelle metoden ELISA. En standard varighet for måling av rhGH nivåer i en prøve med den direkte deteksjonsmetoden var en time, mens den Nano-Spri kreves to timer på grunn av de ytterligere trinn i prosessen. Samlet med spri og Nano-spri eksperimenter, før injeksjon av en prøve, en kalibreringstrinn er sterkt anbefalt. I tillegg har injeksjon av en rå prøve av humant serum som resulterer i noen ikke-spesifikke interaksjoner som et resultat er det viktig å injisere en høy saltvaskebuffer til bare å vise spesifikke interaksjoner. Det er også verdt å merke seg at et vasketrinn er helt nødvendigetter innføringen av blokkering molekyler til sensoroverflaten, for å fjerne ubundne molekyler. Som for ELISA tidskrav er langt høyere (~ 16 til 18 timer) for analyse av en prøve. En lengre inkubasjonstid er nødvendig som analysens følsomhet forbedres spesielt for denne studien, som fokus var å sammenligne den nedre deteksjonsgrense.

Valget av overflatekjemi vil variere fra en anvendelse til en annen, og dette kan bli realisert som en av begrensningen av Spri teknikk. I denne studien ble et stort utvalg og kombinasjon av kjemiske linkere og blokkerer molekyler vurderes for å oppnå riktig kombinasjon for å observere binding optimal effektivitet av rhGH til sensoroverflaten. For eksempel, i denne studien, er kombinasjonen av PEG og BSA tjente også til å minimalisere ikke-spesifikke interaksjoner. I en tidligere studie 17, hvor fangst ligand var et aptamerer, PEG alene tjente som den beste blokkerings molekylet. Variablenesom påvirker bindingseffektivitet av analytt til ligand er også avhengig av pH-verdi, buffer og temperatur. Derfor, med alle programmer, disse variablene må optimaliseres. I tillegg er det viktig å bestemme den optimale spotting konsentrasjonen av liganden til chip overflaten. En titrering forsøk med en rekke konsentrasjoner av immobiliserte ligander utføres før initiering av studien. Som for ELISA, et viktig skritt i prosedyren var å dekantere vaskebuffer fra brønner ved å peke på mikro som dette sikres ingen gjenværende væske er leftover. Fjerning av bufferen vask med pipette var ikke nok, da eventuelle rester av væske blandet med det signal lesning av målet prøven.

Under henvisning til følsomhet, ELISA (1 ng / ml) er sammenlignbare med Spri (3,61 ng / ml), men nano-Spri (9,20 pg / ml) forbedrer følsomheten ved tre størrelsesordener, for derved å muliggjøre målinger på de lavere biologiske nivåer av rhGH 0,03 ng / ml. Som vi tidligere har rapportert en6,17, blir den signalforbedring formidles av NanoEnhancers tilskrives en masse lasteeffekt og den sterke kobling som eksisterer mellom NIR fluoroforer og som forplanter seg på overflaten plasmons for gull filmnanostrukturer. Selv om, legger Nano-spri et ekstra trinn til prosedyren, kan dette nivået av følsomhet utvide anvendelser av spri teknologi i ulike utsalgssteder.

Spri gir forskere en full kinetisk profil (K D, K a og K d) av antistoff / rhGH interaksjon mens ELISA kan rapportere bare Affinitetsverdiene. Variasjonskoeffisienten (CV) var under 10% for Spri (4,1%) og ELISA (6,5%), noe som tyder på god reproduserbarhet. ELISA og Spri Affinitetsverdiene er forskjellige fordi registrerings antistoffene immobilisert på sensorbrikken er forskjellige fra antistoffer immobilisert på ELISA 96-brønners plate. Som for Nano-Spri en høyere CV-verdi (20%) ble observert. Det er flere parametere som kan bidra som en kilde til errors for CV besluttsomhet. For eksempel, med Nano-Spri eksperiment ble en mye lavere konsentrasjon av analytt som blir målt, gir tilsetningen av NanoEnhancers et nytt skritt i fremgangsmåten, og eksperimentet ble utført manuelt. En meget god korrelasjon mellom Nano-Spri og ELISA ble oppnådd for påvisning av rhGH i spiked humant serum. Endelig kan ELISA være en pålitelig teknikk, men fremgangsmåten i seg selv er tidkrevende som gjør det vanskelig å bruke i situasjoner som krever sanntidsovervåking og multipleksing, som det er tilfellet med hGH. I tillegg er et mer tiltalende funksjon som ikke ble undersøkt direkte i denne studien som Spri tilbyr over ELISA, er evnen til å måle hundrevis av interaksjoner samtidig i sanntid. Derfor i fremtiden, vil Nano-spri metoden vurderes å oppdage flere biomarkører samtidig i sanntid (multiplexing) til stede i serum ved ulike konsentrasjoner for å undersøke dens potensial som en levedyktig klinisk diagnostisk verktøy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody  Acris Antibodies DM1015
Bovine Serum Albumin  Fisher Bioreagents  BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody  Acris Antibodies AM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  TCI America D1601
Ethanolamine Acros Organics  141-43-5
Ethanol Fisher Chemicals   BP2818-4
Human HGH ELISA Kit  invitrogen  KAQ1081
Human Serum  Sigma Aldrich  H4522  
Rabbit IgG Antibody  Sigma Aldrich  I5006
11-mercaptoundecanoic acid  Sigma Aldrich  450561
Nanostrip  Cyantek 
N-hydroxysuccinimide  Sigma Aldrich  130672
Phosphate Buffer Saline Invitrogen  00-3002
Polyethylene glycol (800 Da)  Sigma Aldrich  729108
Recombinant Human Growth Hormone  Calbiochem 869008
Sodium Acetate Sigma Aldrich  127-09-3
Sodium Chloride  Fisher Chemicals   7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots  Life Technologies  Q10171MP
UV/Ozone Procleaner Bioforce Nanosciences 
Microwave reactor   CEM Corporation Discover system 
SPRi-Arrayer   LabNext Xactll Microarray System 
SPR biochip HORIBA 
SPRi-Lab+ HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader  BioTek 
ScrubberGen HORIBA Data Analysis software 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
  2. Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
  3. Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, Suppl 1. 27-31 (1991).
  4. Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
  5. The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2015).
  6. The 2014 prohibited list world anti-doping code. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2014).
  7. Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
  8. Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
  9. Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
  10. Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
  11. de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
  12. de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
  13. Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
  14. Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
  15. Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
  16. Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
  17. Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
  18. Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
  19. Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).

Tags

Molecular Biology Blood biomarkører nanopartikler antistoff immunoassay tilhørighet og følsomhet.
Komparativ analyse av Human Growth Hormone i Serum ved hjelp spri, Nano-spri og ELISA-analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vance, S., Zeidan, E., Henrich, V.More

Vance, S., Zeidan, E., Henrich, V. C., Sandros, M. G. Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays. J. Vis. Exp. (107), e53508, doi:10.3791/53508 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter