Summary
Предлагаемая работа оценивает диагностические возможности прямого и усиленного поверхностного плазмонного резонанса (SPRI) анализы, в частности, для обнаружения рекомбинантного человеческого гормона роста в шипами человеческой сыворотки, путем сравнения SPRI приводит непосредственно коммерчески доступный иммуноферментного анализа (ИФА) Комплект.
Abstract
Чувствительность и селективность методы обнаружения гормона роста человека (HGH) в широком диапазоне концентраций (высокие уровни 50-100 нг мл - 1 и минимальные уровни 0,03 нг мл - 1) в циркулирующей крови необходимы как переменные уровни могут указывают изменены физиологию. Например, нарушения роста, происходящие в детском возрасте может быть диагностирована путем измерения уровней гормона роста в крови. Кроме того, злоупотребление рекомбинантного гормона роста в спорте не только ставит этический вопрос он также представляет серьезную угрозу для здоровья обидчика. Один из популярных стратегия для измерения чГР неправильного использования, основан на измерении соотношения 22 кДа гормон роста общего ГР, как не 22 кДа эндогенные уровни падение после экзогенного рекомбинантного чГР (рчГР) администрации. Поверхностного плазмонного резонанса (SPRI) является аналитическим инструментом, который позволяет напрямую (без наклеек) мониторинг и визуализацию биомолекулярных взаимодействий путем записи изменений рефракции экзэкс рядом с поверхностью датчика в режиме реального времени. В противоположность этому, наиболее часто используемый колориметрический метод, иммуноферментный анализ (ИФА) использует антитела, меченые ферментами обнаружения для косвенного измерения концентрации анализируемого вещества после добавления субстрата, что вызывает изменение цвета. Для повышения чувствительности обнаружения, усиливаются SPRI использует формат сэндвич-анализ и ближнего инфракрасного квантовые точки (КТ), чтобы увеличить силу сигнала. После непосредственного обнаружения SPRI рекомбинантного рчГР в шипами человеческой сыворотки, сигнал SPRI усиливается последовательного впрыска детектирующего антитела с покрытием ближней инфракрасной КТ (Нано-SPRI). В этом исследовании, была оценена диагностическая потенциал прямого и усиленного SPRI для измерения рчГР шипами в сыворотке человека и напрямую сравнивать с возможностями имеющегося в продаже ELISA набора.
Introduction
Гормон роста человека (HGH) представляет собой пептидный кислоты 191 амино (22 кДа), полученный в гипофизе и непосредственно попадают в кровь. Взаимодействие между гипоталамо роста пептидного гормона-рилизинг гормона (GHRH) и соматотропина вызвать пульсирующие выделениями ГР. В результате уровень гормона роста варьируются от максимумов в 50-100 нг / мл до минимума в диапазоне 0,03 нг / мл 1. Дефицит или избыток чГР в организме может вызвать широкий спектр физиологических симптомов аномальные. Например, превышение уровней гормона роста может привести к гигантомании 2 и 3 диабета. Истощенные уровни гормона роста вызывает низкий уровень сахара в крови у новорожденных и слабый плотность костной ткани и депрессии у взрослых 4.
Администрация рекомбинантной форме гормона роста (рчГР) улучшает мышечную массу при снижении жира. Таким образом, это вещество стало наркотиком для профессиональных и любительских спортсменов, поскольку это улучшает физическую силу, что наделяет ADVantage в спортивных соревнованиях. рчГР запрещено Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА) 5,6 и особых усилий международных исследователей было сосредоточено на разработке тестов, которые могут обнаружить свое присутствие или анаболический эффект.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), был предпочтительным методом для определения гормона роста в крови 7 всего. Хотя, ИФА является надежным методом предлагая хорошую чувствительность и селективность, сравнительно много времени и трудоемким. Кроме того, ИФА основан на косвенном обнаружении чГР с использованием ферментативных меток. В противоположность этому, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) позволяет обнаруживать чГР непосредственно без использования меток в реальном времени. Принцип обнаружения за SPR включает в себя чувствительный поверхность, состоящую из призмы, покрытого тонким слоем металла (золота или серебра); когда монохромные поляризованный свет взаимодействует с поверхностью металла, "поверхностные плазмоны" генерируются. Связывание аналитас рецептором поверхности с иммобилизованным на поверхности металла возмущает условия резонанса, приводящие к смещенной резонансной падения, которые затем могут быть соотнесены с концентрацией анализируемого вещества. Биосенсоры SPR основе теперь коммерчески доступны, которые предлагают в режиме реального времени, метки, свободное технику для мониторинга биомолекулярные связывания событий и биохимические реакции 8-10. Совсем недавно, SPRI была разработана в ответ на потребность в мультиплексирования (т.е., мониторинг нескольких обязательных мероприятий одновременно), чего не было возможно в классической биосенсоров СРП. Таким образом, SPRI возник как инструмент для мониторинга несколько обязательных мероприятий одновременно. Современные системы SPRI основаны на микроскопических изображений поверхности, возбуждаемого светом под определенным углом и длиной волны 10. Затем изображение захватили на зарядовой связью (ПЗС) массива.
На сегодняшний день, было несколько анализы SPR основе, разработанные для выявления чГР 11-14. Один частности стратегия, Известный как метод изоформы 15, основан на измерении соотношения 22 кДа гормон роста общего чГР, как не 22-кДа эндогенные уровни упасть после экзогенного рчГР. Недавно De Juan-франко др. 11 сообщили о разработке иммуносенсора SPR основе для селективного детектирования 22 кДа и 20 кДа чГР изоформ в образцах сыворотки человека. Моноклональные антитела, специфичные к каждой изоформы были иммобилизованы непосредственно на датчике золота, позволяющего измерять как изоформ одновременно в виде одной инъекции с пределом обнаружения в 0,9 нг мл -1. В качестве альтернативы, SPR был использован для скрининга антител с высокой специфичностью к ГР 13. Если концентрация анализируемого вещества-мишени падает ниже предела системы SPRI в обнаружении (<нМ), приходится прибегать к усиления сигнала с помощью SPRI использования наночастиц (нано-SPRI). Такое усиление SPR основе были хорошо документированы в литературе 16-19 для Various типы аналита и поверхностей.
В этой работе, была исследована аналитическая потенциал биосенсоров на основе SPRI и нано-SPRI, в частности, для обнаружения рчГР в шипами человеческой сыворотки, и сравнение его способности обнаружения непосредственно в ELISA. Следующие параметры будут рассмотрены и учтены: времени обнаружения, чувствительность, кинетическая профиль, воспроизводимость и специфичность.
Protocol
1. Приготовление растворов и белковых проб для SPRI
- Приготовьте 100 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) раствора с низким содержанием соли, содержащей 10 мМ фосфата, 150 мМ хлорида натрия и рН 7,4.
- Подготовка 50 мл солевого раствора высокой PBS, содержащем 10 мМ фосфат, 750 мм хлорида натрия и рН 7,4.
- Подготовка 5 мл 10 мМ ацетата натрия.
- Подготовьте запас 5 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенного в солевом растворе с низким PBS.
- Подготовка исходного раствора рекомбинантного человеческого гормона роста (рчГР) в концентрации 1 мкг / мл в растворе с низким содержанием соли PBS.
- Подготовка исходных растворов анти-рчГР и отрицательного контрольного антитела в концентрации 100 мкг / мл.
2. Подготовьте SPRI чип для антител массив
- Очистить чип с помощью ультразвука в 120 мл стабилизированного раствора пираний (3: 1 концентрированной серной кислоты до 30% пероксида водорода) в течение 90 мин при 50 ° С и последующей путем промывкии ультразвуковую обработку водой в течение 5 мин. Затем промыть чип с этанолом и сухой с потоком азота.
- Поместите золотую фишку в камере УФ / озонового 30 мин для удаления каких-либо примесей.
- Добавить 150 мг 11-меркаптоундекановой кислоты в 20 мл этанола в пробирке, содержащей мешалкой и трубкой колпачок.
- Поместите фишку в пробирки и микроволновой трубки / чип на 50 Вт и 50 ° С в течение 5 мин.
- Промыть чип с этанолом и замочить в этаноле в течение 5 мин.
- Следуйте по промыть водой и замочить в воде в течение 5 мин.
- Добавить 150 мг 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида в 20 мл воды в пробирке, содержащей мешалкой и трубкой колпачок. Микроволновая печь чип, как в шаге 2.4.
- Промыть чип с водой и замочить в воде в течение 5 мин.
- Добавить 150 мг N-гидроксисукцинимида в 20 мл воды в пробирке, содержащей мешалкой и трубкой колпачок. Микроволновая печь чип, как в шаге 2.4.
- Промыть чип с водой и замочить в воде в течение 5 мин.
- ПодготовительномRe 250 мкМ полиэтилена (ПЭГ 800, Da) в 20 мл воды в пробирке, содержащей мешалкой и трубкой колпачок. Микроволновая печь чип, как в шаге 2.4.
Примечание: в микроволновой печи PEG800 на поверхности датчика выполняется как шаг для предотвращения блокировки неспецифического связывания белков сыворотки и квантовых точек комплексов позже используемый в эксперименте. Это достигается за счет взаимодействия с PEG800 без занятых голых золотых сайтов на чипе. - Промыть чип с водой и замочить в воде в течение 5 мин.
- Подготовка 15 мкг / мл анти-рчГР раствора антител и отрицательного контрольного раствора анти-Иммуноглобулин G (IgG анти-) и добавить 10 мкл каждого раствора антител к колодцу в луночного планшета 384.
- Дизайн пятнистость шаблон в microarrayer (4 х 7 квадрантов для каждого образца) и точечной чип с антителами, используя 500 мкм тефлон наконечником контактный.
- Инкубируйте пятнистый чип в течение 2 ч при комнатной температуре и во влажной атмосфере 75% или более.
- Промыть и замочить в воде чип для5 мин. Затем, сухой чип с потоком азота.
3. Эксперимент SPRI Настройка и блокировка
- Инициализация прибора и выберите директорию. Выбор в режиме реального времени камеру и начать шприцевой насос со скоростью 1 мл / мин в течение 10 мл дегазированной воды. Вставьте чип в прибор и сохранить инъекционных воды, пока все пузырьки не будут удалены.
- После промывки чипа с 10 мл воды, начать сканирование изображения, и следовать путем переключения буфера к низкой соли PBS и позволить ему работать со скоростью 1 мл / мин в течение 5 мл и затем медленной скоростью потока до 20 мкл / мин в течение 20 мин ,
- Выберите высоко контрастное изображение, которое показывает иммобилизованные антитела наносили на чип.
- Выбор и определение отдельных круглые пятна 400 мкм, в соответствии с иммобилизованными антителами.
- После инструмент прослеживает кривые плазмонного выберите рабочую угол, который имеет самый высокий склон в кривых отражательной.
- Поток работающий буфер на 20 мкл / мин с низким сальт PBS через систему, пока сигнал от всех выбранных точек не стабилизируется.
- Загрузка BSA (100 мкг / мл) в проточном буфере в образце петли (150 мкл) с клапана впрыска в положении загрузки. Затем переключить кран в положение инъекции вводить раствор в ячейку.
Примечание: БСА вводили ковалентно связываться с амином реактивной поверхности, остальные несвязанных БСА будет смыть поверхность через буфер полоскания. - Вводят 150 мкл раствора 10 мМ ацетата натрия на поверхности и последующей по 150 мкл инъекции большого количества соли PBS.
- Вводят 150 мкл этаноламина (1 мм), чтобы отключить амина реактивную поверхность.
- Вводите 150 мкл 10 мМ ацетата натрия, чтобы вымыть поверхность.
- Затем переключить рабочем буфере PBS до 50 мкг / мл BSA при скорости потока 250 мкл / мин в течение в общей сложности 5 мл.
Примечание: 50 мкг / мл БСА добавляется в рабочем буфере для дополнительного для блокирования сюрЛицо с нековалентно занимая неспецифические сайты, и это делается для дальнейшего снижения неспецифического связывания белков сыворотки до поверхности. - Расход Изменить до 5 мкл / мин и дайте ему стабилизироваться в течение 20 мин.
4. SPRI обнаружения гормона роста человека
- Готовят раствор заданного концентрации рчГР (30000 пг / мл; 250 мкг / мл; 25 пг / мл; 2,5 пг / мл и 0,25 мкг / мл) в 10% сыворотки и разводили в PBS, содержащий 1 мг / мл BSA.
- Приготовьте 2: раствор 1 добавлением 1 мкл биотина меченые анти-рчГР антитела обнаружения (6 мкм) до 3 мкл стрептавидина ближней инфракрасной квантовых точек (1 мкМ) в 0,5 мл микроцентрифужных трубки и инкубировать в течение 30 мин для эффективного сцепления ,
- Инъекционные 150 мкл чГР в шипами человека решение сыворотки в цикле впрыска. Это приводит к сильному увеличению сигнала с последующим медленным падением с неспецифически связанного сыворотке полоскания от поверхности.
- После знакааль стабилизируется, промыть поверхность с раствором 450 мм хлорида натрия добавляют к рабочим буфером.
- Развести раствор анти-антител рчГР обнаружения и квантовых точек, до концентрации 10 нМ (2: 1) с рабочим буфером (PBS с 50 мкг / мл BSA) и вводят в проточную кювету.
5. Анализ данных SPRI
Примечание: После инъекции рчГР шипами сыворотке и квантовой точки усилитель, увеличение изменения отражательной происходит из-за усиленного сдвига кривых плазмонов. Это приводит к разности изображение, показывающее серый масштаб изображения соотносить с сигналом на чипе.
- Импорт данных в программу анализа данных. Участок сигнал SPRI (% отражения) в зависимости от времени (ов) и определить разницу между анти-рчГР и отрицательных точек контрольного антитела после высококонцентрированный солевой промывной раствор.
6. Протокол ELISA (1 день)
- Храните все компоненты анализа включены Iп комплект рчГР ИФА при температуре 2-8 ° С. Это включает в себя антитело против рчГР лунке пластины, стандарты (0-5) у овец сыворотке, контрольной (1 & 2) в сыворотке крови человека, сопряженного буфера, (200x) промывочным буфером, хромоген ТМБ (тетраметилбензидина) и прекратить реагента.
- Настройка реагенты и следовать методам, как описано в коммерческом протокола комплект ELISA.
- Во-первых, позволяют антитело против рчГР покрытием 96-лунок нагреваться до комнатной температуры перед открытием упаковки фольги.
- Затем снимите нужное количество полос 8-а для анализа и запечатать пакет из фольги, содержащий оставшиеся скважин и хранить при температуре 2-8 ° С.
- Подготовка стандартов по восстановления в 2 мл дистиллированной воды для стандарт # 0, в 1 мл дистиллированной воды для стандартов (1-5), и в 1 мл дистиллированной воды для контроля (1 & 2). Ниже приведена таблица соответствующих концентраций стандартов и контроля (таблица 1):
| Стандарты | Концентрация (нг / мл) |
| 0 | 0 |
| 1 | 0.17 |
| 2 | 0.94 |
| 3 | 2.63 |
| 4 | 10.4 |
| 5 | 26,9 |
| Контроль # 1 | 1,22 ± 0,33 нг / мл |
| Контроль # 2 | 4,97 ± 1,25 нг / мл |
Таблица 1. Концентрации стандартов и управления включены в комплект ELISA коммерческой.
- Подготовка образцов, которые состоят из гормона рчГР в 10% сыворотки крови человека в следующих концентрациях (таблица 2):
| <сильный> Пример | Концентрация (нг / мл) |
| 1 | 0,025 |
| 2 | 0,2 |
| 3 | 0,5 |
| 4 | 2.5 |
| 5 | 10 |
| 6 | 30 |
Таблица 2. Концентрации образцов, приготовленных в рчГР 10% сыворотки.
- Добавить 50 мкл каждого стандарта, контроля и образца в каждую лунку (в трех экземплярах). Печать скважин и инкубировать с стандартов, контролей и образцов рчГР O / N при 4 ° С при осторожном встряхивании.
7. Протокол ELISA (День 2)
- Снимите пластину из шейкера и дать ему нагреться до комнатной температуры (15-20 мин) до проведением теста.
- Удалить Анти-рчГР-HRP, сопряженных буфер, промывочный буфер (200x), хромоген ТМБ (тетраметилбензидин), А.Н.д Стоп-реагент из холодильника и позволяют нагреться до комнатной температуры.
- Подготовка реагентов: (в соответствии с требованиями завода-изготовителя)
- Развести Anti-рчГР-HRP 40x с сопряженной буфера. Подготовьте промывочный буфер путем разбавления 200x дистиллированной водой.
- Добавить 50 мкл анти-рчГР-HRP конъюгата в каждую лунку, герметизации скважины и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин при осторожно встряхивая.
- Декантировать раствор из лунок и пластину перевернули и нажмите на сухое абсорбирующего ткани. Затем добавить 200 мкл промывочного буфера в каждую лунку.
- Декантировать промывочного раствора и водопроводной высыхать на ткани адсорбирующего. Повторите этот шаг 3 раза.
- Добавить 100 мкл хромогена в каждую лунку в течение 15 мин после стадии промывки. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте в то время на осторожно встряхивая. Решения обратиться от бесцветного до синего.
- Добавить 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку в. Решения обратиться от синего до желтого. Сразу же, читал йе поглощение каждой лунки при 450 нм с использованием микропланшет-ридера.
- Постройте стандартную кривую для предусмотренных стандартами (0-5). Затем построить оптическую плотность рчГР в 10% образцов сыворотки от концентрации каждого образца.
Representative Results
Производительность SPRI и нано-SPRI (SPRI, использующих NanoEnhancers) сравнивали с ELISA для обнаружения рчГР в сложной среде. Различия в установке этих методов описаны здесь кратко. Для SPRI (с прямым детектированием, рис 1), захват антитела, иммобилизованного на поверхности, а затем пробу вводят и связывание аналита к поверхности датчика измеряется непосредственно в реальном времени и этикеткой свободной форме. Тем не менее, с нано-SPRI (рис 1), после того, как аналит связывается с поверхностью датчика, последовательное впрыска следует с квантовыми точками, покрытых антителами обнаружения для усиления сигнала SPRI.
Рисунок 1. Схематическое представление сравнения прямой режим (SPRI) и усиленный режим (Нано-SPRI) обнаружения рчГР в С грубые образцы. лиганды (рчГР или IgG антитела) конкретные иммобилизация в формате массива на биочипа SPRI. Белка-мишени (рчГР) шипами в сыворотке крови человека, введенного на поверхность датчика непосредственно обнаружено (SPRI) и последовательно выделены NanoEnhancers (Нано-SPRI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Что касается ELISA, как луночные планшеты прибывают уже предварительно функционализированных иммобилизованным антителом, а затем образец вводят, интерес аналита связываются. Антитела обнаружения вводится с последующим подложки того. Оптическую плотность затем измеряли при 450 нм. В этом исследовании, коммерческий набор ELISA (фиг.2) был использован для измерения рчГР шипами в 10% сыворотке человека.
8 / 53508fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Схематическое представление процедуры анализа ELISA. рчГР белок (синие овалы) вводится в лунки, которые были предварительно функционализированных с моноклональными антителами (желтый), специфичных для рчГР. Неспецифических взаимодействий устраняются путем промывки скважин промывочным буфером с последующим введением антитела обнаружения prefunctionalized с пероксидазой хрена (HRP, фиолетовый). Решение будет изменить цвет после добавления субстрата тетраметилбензидина (ТМВ, золото). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 представляет кривой титрования рчГР шипами в 10% сыворотке человека и представлен в зависимости от полученного OD при 450 нм. Хороший линейный отклик наблюдалось, а предел обнаружения был определен как 1 нг / мл. Коэффициент вартельная (CV) составил 6,5% свидетельствует хорошую воспроизводимость.
Рисунок 3. ИФА анализ данных. Концентрация рчГР шипами в сыворотке крови в заговоре против полученного ОД при 450 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Далее, обнаружение рчГР шипами в сыворотке человека оценивали с SPRI. Прямая регистрация рчГР привело с соответствующим градиентом концентрации кривой (рис 4), каждая точка представляет собой среднее значение разности отражательной рассчитанной по три SPRI кинетических кривых для каждой концентрации. Предел обнаружения (LOD) был определен как 3,61 нг / мл. SPRI анализ прямое обнаружение было хорошо воспроизводимым как CV в анализеТолько 4,1%.
Рисунок 4. Обнаружение Прямая SPRI чГР шипами в 10% сыворотке человека. Полученный нормализованы SPRI кинетической участок после инъекции различных количеств чГР шипами в сыворотке человека с последующей инъекцией буфер с высоким содержанием соли (пунктирная линия) по вертикали для удаления не -специфические взаимодействия. Градиент концентрации Кривая связывания различных количеств гормона роста шипами в сыворотке крови человека на поверхность датчика, который был prefunctionalized с биотинилированным чГР-специфических антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Для увеличения чувствительности сенсора SPRI, NanoEnhancers (КТ заранее функционализирован антител обнаружения) последовательно вtroduced на поверхность датчика, для того, чтобы подчеркнуть наличие рчГР шипами в сыворотке крови человека. После вычитания фона, NanoEnhancers смогли усилить реакцию биосенсора до 7,9%, однако, с минимальным изменением сигнала (Иммуноглобулин G (IgG) -специфический антител, изменение отражательной 0,38%; рис 5 на контролируемых регионах интерес Визуализация. поверхность датчика показал, что только регионы, которые имеют интерес рчГР-специфических антител с иммобилизованным испытать большой изменение контрастности подтверждающую непосредственно с кинетической ответ сенсограммы.
Рисунок 5. Обнаружение рчГР с использованием сэндвич-анализ шипами в 10% сыворотке человека. SPRI кинетической участок после инъекции рчГР (30 нг / мл) в буфере (10 мМ PBS, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,4) на предварительно -functionalized чип с 11-меркаптоундекановой кислоты / rhGH-специфическое антитело IgG и контролировать-антитело затем блокировали БСА с последующим добавлением обнаружения покрытых антителами квантовых точек (NanoEnhancers). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Чтобы продемонстрировать целесообразность биосенсора Nano-SPRI, оценивали диапазон измерения рчГР в сырых образцов. Расширенный рабочий диапазон от 30000 пг / мл до 0,25 мкг / мл приводило в ответ на добавление NanoEnhancers (рис 6). Стоит отметить, что каждая точка на кривой титрования усредняется из трех независимых экспериментов. Следовательно, нижний предел обнаружения была рассчитана на 9,20 пг / мл, а коэффициент вариации составил 20%.
Рисунок 6.Обнаружение Нано-SPRI чГР шипами в сыворотке крови человека. Нормированная SPRI кинетическая представление участок hGH_specific_Anti-КТ-усиленного сигнала для образцов сыворотки крови человека с шипами с различными концентрациями гормона роста. Вертикальная пунктирная линия (серый) представляет собой точку впрыска работающей буфера. (б) Градиент концентрации Кривая связывания NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-КТ) после инъекции различных количеств гормона роста шипами в сыворотке человека на поверхность датчика, который был prefunctionalized с 11-меркаптоундекановой кислоты / ГР конкретных антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Далее, изменение, которое происходит в отражательной кривой SPR в зависимости от концентрации сравнивали между прямой и методом биоанализа NanoEnhancer (фиг.7). Для прямого деТехника СРЕДЫ между 25 и 0,25 пг / мл, сигнал начала плато, и это не удивительно, так как эти концентрации падают ниже LOD 3 нг / мл (рисунок 7). Аналогично, для усиленного техники, концентрации ниже LOD 9,2 пг сигнал / мл начали плато и не показали практически не изменения.
Рисунок 7. Сравнительный анализ SPRI с нано-SPRI. Эта гистограмма показывает процентное изменение в отражательной (% R) после введения рчГР шипами в сыворотке крови человека (прямое обнаружение), а затем с помощью инъекции NanoEnhancers (усиленный) для обнаружения 30000 пг / мл, 250 пг / мл, 25 мкг / мл, 2,5 мкг / мл и 0,25 мкг / мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
(рисунок 8). Однако, когда рчГР шипами в образце сыворотки вводили в том же месте, функционализированных антител рчГР, усиление сигнала наблюдалось. В заключение, платформа нано-SPRI продемонстрировала отличную специфичность и избирательность в отношении рчГР.
Рисунок 8. Оценка Нано-SPRI селективности по отношению к рчГР. Биодатчик ответ Нано-SPRI после инъекции рчГР (черный) и IGF-1 (красный) в ссогнувшись в сыворотке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициент корреляции Пирсона для определения корреляции между интенсивностью сигнала SPRI и ELISA значений оптической плотности (рисунок 9). Р-значение <0,01 считали значимым. Как показано на этом графике, существует хорошая корреляция между уровнями рчГР в шипами человеческой сыворотки, измеренных SPRI и ELISA. R-значение было 0,9263 за 9 различных образцов.
Рисунок 9. Корреляция Пирсона анализ между ELISA и Nano-SPRI. Сюжет соотносится интенсивность сигнала Нано-SPRI (Y-ось) с ELISA оптической плотности (ось х) значений. (Грушина коэффициент корреляции п = 9, R = 0,9263, р = 0,00000183). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Равновесие константа диссоциации (KD) определяли, используя GraphPad Software для ELISA. Вычисленное значение Уб была приблизительно 79 нМ (таблица 3). В на (К а) и от (K D) ставки не может быть определена с помощью ELISA. Тем не менее, с помощью программного обеспечения для анализа данных, метод прямое обнаружение привело с K D значения в 23 часов, используя молекулярную массу 22 кДа, что соответствует одной молекуле рчГР. Включения и выключения ставок были вычислены 6.1 x10 7 М -1 с -1 и 1,33 × 10 -3 с -1, соответственно. Это по сути переводит, что 0,13% от распада рчГР и антитело в секунду. Что касается Amplified SPRI эксперимент, улучшить общую взаимодействие наблюдалось между NanoEnhancers и рчГР как расчетной аффинностью связывания была определена в 4:03 вечера. Кроме того, более сильный скорости ассоциации наблюдалось NanoEnhancers и рчГР чем иммобилизованным антителом / рчГР, однако скорость диссоциации показывает, что 0,26% от NanoEnhancer / рчГР / Capture распада антител в секунду.
| Метод | Уб (Affinity) | К а (ставка по-) | К д (от скорости) | ЛОД |
| ИФА | 79.45 х 10 -9 М | Не Доступно | Не Доступно | 1 нг / мл |
| SPRI | 23.2 х 10 -12 М | 6,1 х 10 7 М -1 с -1 | 3.61 нг / мл | |
| Нано-SPRI | 4.33 х 10 -12 М | 7,54 x10 8 М -1 с -1 | 2.62 x10 -3 с -1 | 0,0092 нг / мл |
Таблица 3. Полный кинетический анализ данных. Оценка сродства, на скорости и скорость диссоциации из иммунных реакций с использованием GraphPad (ELISA) и анализ данных программного обеспечения (SPRI и нано-SPRI). Определение авидности помощью молекулярную массу 22 кДа, что соответствует одной молекуле рчГР был выбран. Пределы обнаружения были определены для всех трех исследований с использованием Excel.
Discussion
Нерегулярные уровни гормона роста, естественным гормоном, были связаны с многочисленными медицинских расстройств, которые влияют на человеческий рост и развитие. Кроме того, введение экзогенного рчГР обычно используется спортсменами, хотя это запрещено, в качестве легирующего агента для повышения их эффективности. Проблемы обнаружения рчГР результат неправильного использования из-за трудностей в разграничения экзогенный чГР эндогенной форме. Таким образом, ток одобрен метод обнаружения экзогенного чГР основан на измерении отношение 22 кДа чГР изоформы по отношению к 20 кДа изоформы. Поскольку испытание изоформы требования для измерения многократного ГРЧ изоформы одновременно в течение короткого периода времени в широком диапазоне концентраций, таким образом, мы рассмотрели платформу SPRI как идеальный матч. Кроме того, эндогенные чГР уровень колебаться в очень низком уровне (0,03 нг / мл) в крови, следовательно, система обнаружения должен быть способен измерять этот диапазон удобно с высоким зрecificity. В результате, мы также исследовали в данном исследовании потенциал Nano-SPRI в качестве диагностического инструмента для ГР и сравнил его непосредственно SPRI и классической иммунологического ELISA.
На основании результатов, полученных в этом исследовании, основное преимущество метода SPRI и нано-SPRI, что концентрации рчГР может быть измерена в более быстром образом, по сравнению с более традиционным методом ELISA. Стандартная продолжительность для измерения уровня рчГР в одном образце с помощью метода прямого обнаружения был 1 час в то время как Нано-SPRI требуется 2 ч из-за дополнительных шагов в этом процессе. В целом, с SPRI и нано-SPRI экспериментов, перед инъекцией образца, шаг калибровки рекомендуется. Кроме того, инъекции сырого образца, как результаты человеческой сыворотке в некоторых неспецифических взаимодействий в результате крайне важно, чтобы придать высокую буферную соль стирки только выявить специфические взаимодействия. Стоит также отметить, что стадия промывки является абсолютно необходимымпосле введения блокирующих молекул на поверхность датчика, для удаления несвязанных молекул. Что касается требований времени ELISA, намного больше (~ 16-18 часов) для анализа одного образца. Необходим более длительное время инкубации, как чувствительность анализа усиливается специально для этого исследования, а основное внимание было сравнить нижний предел обнаружения.
Выбор поверхностной химии будет изменяться от одного применения к другому, и это может быть реализовано в качестве одного из ограничений техники SPRI. В этом исследовании, широкий ассортимент и сочетание химических линкеров и блокирующих молекул были оценены достижения правильного сочетания для того, чтобы наблюдать оптимальный связывания эффективность рчГР на поверхность датчика. Например, в этом исследовании, сочетание BSA и ПЭГ служил также в минимизации неспецифических взаимодействий. Тем не менее, в предыдущем исследовании, где 17 захвата лиганд был аптамеры, ПЭГ одна служил в качестве лучшего молекулы блокировки. Переменныекоторые влияют на эффективность связывания с лигандом аналита также зависит от рН, буфер и температура. Таким образом, в любом приложении, эти переменные должны быть оптимизированы. Кроме того, очень важно, чтобы определить оптимальную концентрацию пятнистость лиганда с поверхностью чипа. Титрование эксперимент с диапазоном концентраций иммобилизованного лиганда выполняется до начала исследования. Что касается ELISA, является важным шагом в процедуре было переливать промывочный буфер из лунок, постукивая планшет как это обеспечивается не остаточная жидкость не остатки. Удаление промывочного буфера с пипеткой, не было достаточно, как и любой остаточную жидкость мешал считывания сигнала целевого образца.
В связи с чувствительностью, ИФА (1 нг / мл) сравнима с SPRI (3,61 нг / мл), но нано-SPRI (9.20 пг / мл) повышает чувствительность на три порядка величины, что позволяет измерения на более низких биологических уровнях рчГР 0.03 нг / мл. Как сообщалось ранее 16,17, усиление сигнала даваемые NanoEnhancers приписывается массового эффекта нагрузки и сильной связи, которая существует между NIR флуорофорами и распространяющихся поверхностных плазмонов для золота пленочных наноструктур. Даже если, Нано-SPRI добавляет дополнительный шаг к процедуре, этот уровень чувствительности может расширить применение технологии SPRI в различных торговых точках.
SPRI обеспечивает ученым полную кинетическую анкету (Уб, К и К г) антитела / рчГР взаимодействия, тогда как ELISA может сообщить только значения сродства. Коэффициент вариации (КВ) был ниже 10% для SPRI (4,1%) и ELISA (6,5%), что свидетельствует хорошую воспроизводимость. Значения сродства ELISA и SPRI отличаться, так как антитела захвата иммобилизованным на чипе датчика отличаются от иммобилизованных антител в ELISA 96-луночного планшета. Что касается Nano-SPRI наблюдалось более высокое значение CV (20%). Есть несколько параметров, которые могут способствовать как источник ErroRS для определения CV. Например, в эксперименте Нано-SPRI гораздо ниже концентрация анализируемого измеряемого, добавление NanoEnhancers добавляет еще один шаг в процедуре, и эксперимент был проведен вручную. Очень хорошая корреляция между нано-SPRI и ELISA была достигнута для обнаружения рчГР в шипами человеческой сыворотке. Наконец, ELISA может быть надежным методом, однако сам метод занимает много времени, что делает его трудно использовать в ситуациях, требующих реального времени мониторинг и мультиплексирование, как это имеет место с ГР. Кроме того, более привлекательной особенностью, что не исследовалось непосредственно в этом исследовании, что SPRI предлагает более ELISA, является способность измерить сотни взаимодействий одновременно в режиме реального времени. Поэтому в будущем, метод Nano-SPRI будет оцениваться, чтобы обнаружить несколько биомаркеров одновременно в режиме реального времени (мультиплексирования), присутствующие в сыворотке при различных концентрациях для того, чтобы изучить его потенциал в качестве жизнеспособного клинического диагностического инструмента.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
| Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
| Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
| Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
| Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
| Nanostrip | Cyantek | ||
| N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
| Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
| Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
| Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
| UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
| Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
| SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
| SPR biochip | HORIBA | ||
| SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
| Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
| ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |
References
- Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
- Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
- Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, Suppl 1. 27-31 (1991).
- Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
- The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2015).
- The 2014 prohibited list world anti-doping code. , World Anti-Doping Agency. Available from: https://wada-main-prod.s3.amazonaws.com/resources/files/WADA-Revised-2014-Prohibited-List-EN.PDF (2014).
- Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
- de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
- de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
- Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
- Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
- Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
- Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
- Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
- Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
- Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).
