Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53510
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1, 1,4
1Department of Biochemistry, University of Wisconsin–Madison, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Wisconsin–Madison, 3Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Wisconsin–Madison, 4The Genome Center, University of Wisconsin–Madison

Summary

Identifisere de direkte målene for genom målretting molekyler er fortsatt en stor utfordring. For å forstå hvordan DNA-bindende molekyler engasjere genomet, har vi utviklet en metode som er avhengig av kryssbinding av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC).

Abstract

Genomet er målet for noen av de mest effektive kjemoterapeutiske midler, men de fleste av disse stoffene mangler DNA-sekvens spesifisitet, noe som fører til dosebegrensende toksisitet, og mange uønskede bivirkninger. Målretting genomet med sekvensspesifikke små molekyler kan gjøre det mulig molekyler med økt terapeutisk indeks og færre off-target effekter. N -methylpyrrole / N metylimidazol polyamider er molekyler som kan rasjonelt utformet for å målrette spesifikke DNA-sekvenser med utsøkt presisjon. Og i motsetning til de fleste naturlige transkripsjonsfaktorer, kan polyamider binde til metylert og chromatinized DNA uten tap i affinitet. Sekvensen spesifisiteten av polyamider er blitt grundig undersøkt in vitro med beslektet område identifikasjon (CSI) og med tradisjonelle biokjemiske og biofysiske nærmer seg, men studiet av polyamid binding til genomiske mål i cellene fortsatt ukjent. Her kan vi rapportere en fremgangsmåte til tverrbinding av små molekyler isolate kromatin (COSMIC), som identifiserer polyamid bindingssteder over hele genomet. COSMIC er lik kromatin immunoutfelling (chip), men skiller seg i to viktige måter: (1) en photocrosslinker anvendes for å muliggjøre selektiv, midlertidig styrt innfanging av polyamid bindende hendelser, og (2) biotin affinitet håndtaket benyttes til å rense polyamid -DNA-konjugater i henhold til semi-denaturerende betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. COSMIC er en generell strategi som kan brukes for å avsløre genombindingsbegivenheter av polyamider og andre genom-målretting kjemoterapeutiske midler.

Introduction

Den informasjon for å gjøre hver celle i kroppen er kodet i DNA. Den selektive bruk av denne informasjonen styrer skjebnen til en celle. Transkripsjonsfaktorer (TFS) er proteiner som binder seg til spesifikke DNA-sekvenser for å uttrykke en bestemt undergruppe av gener i genomet, og funksjonsfeil i TFS er knyttet til starten av en lang rekke sykdommer, inkludert utviklingsdefekter, kreft og diabetes . 1,2 Vi har vært interessert i å utvikle molekyler som selektivt kan binde til genomet og modulerer gen regulatoriske nettverk.

Polyamider består av N -methylpyrrole og N metylimidazol er rasjonelt utformet molekyler som kan målrette DNA med særegenheter og slektskap som rivaliserende naturtranskripsjonsfaktorer. 3-6 Disse molekylene binder seg til spesifikke sekvenser i mindre sporet av DNA. 4,5,7 -11 Polyamider har vært ansatt både undertrykke og aktivere uttrykk for spesifikke gEnes. 4,12-19 De har også interessante antivirale 20-24 og kreft 12,13,25-30 egenskaper. En attraktiv funksjon av polyamider er deres evne til å få tilgang til DNA-sekvenser som er metylert 31,32 og pakket rundt histonproteiner 9,10,33.

For å måle de omfattende bindingsspesifisiteter av DNA-bindende molekyler, vårt laboratorium opprettet beslektet område identifikator (CSI) -metoden. 34-39 Den antatte forekomsten av bindingsseter basert på in vitro-spesifisiteter (genomescapes) kan vises på genomet, fordi in vitro bindende intensiteter er direkte proporsjonal med foreningen konstanter (K a). 34,35,37 Disse genomescapes gi innsikt i polyamid belegg over genomet, men måle polyamid bindende i levende celler har vært en utfordring. DNA er tett pakket i kjernen, noe som kan påvirke tilgjengeligheten av bindingssteder. Accessibility av disse chromatinized DNA-sekvenser til polyamider forblir et mysterium.

Nylig, til mange metoder studere samspillet mellom små molekyler og nukleinsyrer har dukket opp. 40-48 Den affinitet fangst og massivt-parallell DNA-sekvensering (chem-seq) er en slik teknikk. Chem-seq bruker formaldehyd for å kryssbinde små molekyler til et genomisk mål av interesse og et biotinylert derivat av et lite molekyl av interesse å fange ligand-target-interaksjon. 48,49

Formaldehyd kryssbinding fører til indirekte vekselvirkninger som kan produsere falske positiver. 50 Vi har utviklet en ny metode, kryssbindingen av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC), 51 med en photocrosslinker å eliminere disse såkalte "fantom" topper. 50 til å begynne, vi designet og syntetisert trifunksjonelle derivater av polyamider. Disse molekylene inneholdt et DNA-bindende polyamide, en photocrosslinker (psoralen), og en tilhørighet håndtaket (biotin, figur 1). Med trifunksjonelle polyamider, kan vi kovalent fange polyamid-DNA-interaksjoner med 365 nm UV-bestråling, en bølgelengde som ikke skader DNA eller indusere ikke-psoralen-baserte tverrbinding. 51 Deretter vi fragmentere genomet og rense det oppfangede DNA under strenge, semi -denaturing betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. Således ser vi på kosmiske som en metode relatert til chem-seq, men med en mer direkte avlesning av DNA målretting. Viktigere, svak (K 10 3 -10 4 M -1) psoralen affinitet for DNA ikke påviselig effekt polyamid spesifisitet. 51,52 anriket DNA-fragmenter kan analyseres enten ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon 51 (kosmiske-qPCR) eller ved neste generasjons sekvense 53 (COSMIC-seq). Disse data aktivere en objektiv, genom styrt design av ligander som interopptre med sine ønskede genomisk loci og minimere off-target effekter.

Figur 1
Figur 1. Bioaktive polyamider og COSMIC ordningen. (A) hårnål polyamider 1 - 2 målet DNA-sekvensen 5'-WACGTW-3 '. Lineære polyamider med 3 - 4 mål 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringer av N-methylimidazole er uthevet for klarhet. Åpne og fylte sirklene representerer N -methylpyrrole og N metylimidazol hhv. Square representerer tre-klortiofen og diamanter representerer β-alanin. Psoralen og biotin er betegnet med P og B, respektivt. (B) COSMIC ordningen. Celler behandles med trifunksjonelle derivater av polyamider. Etter kryssbinding med 365 nm UV-bestråling, cellene er lysed og genomisk DNA er skåret. Streptavidin-belagte magnetiske kuler blir tilsatt for å fange opp polyamid-DNA-addukter. DNA frigjøres og kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR) eller ved neste generasjons sekvensering (NGS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fornetting i levende celler

  1. Begynn med ~ 2.5x10 7 H1 celler, eller andre dyrkede celler.
    MERK: Dette nummeret av H1 celler tilsvarer fem 10-cm retter (ca. 40% konfluens).
  2. Grow celler i E8 media på retter belagt på en overflate som støtter pluripotente stamceller (se Materials List), og inkuber dem ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO 2. Høste celler enzymatisk (se Materials List). Merk: Ikke la H1 celler til å overstige 90% confluency; confluency induserer spontan differensiering av H1 celler. Å telle celler, vokser en ekstra 10-cm rett av celler, løft cellene enzymatisk som beskrevet i avsnitt 1.8-1.10, og telle dem med en hemocytometer.
    1. Forbered E8 dyrkningsmedier som beskrevet i Chen et al. 54
  3. Før tilsetting av polyamid, fjerner brukt kulturmedium med en Pasteur pipette er festet til en vakuum felle. Legg frisk media med såerological pipette og pipette dispenser (8 ml per 10 cm parabol).
    MERK: Legg media til siden av fatet for å unngå å forstyrre cellene. Fra dette punktet videre beskytte cellene mot lys for å unngå for tidlig fototverrbinding.
  4. Legg polyamid med en pipette (8 pl 400 mikrometer polyamid i DMSO, 400 nM endelig konsentrasjon) direkte til kultur media på hver tallerken. Virvle fatet å spre polyamid jevnt i media.
    MERK: Konsentrasjon kan varieres, men sikre at ingen cellulær toksisitet observeres for den valgte behandlingen.
  5. Cellene inkuberes 24 timer 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2, og at de blir beskyttet mot lys.
    MERK: Inkubasjonstiden kan varieres for å måle polyamid binding på tvers av tid.
  6. Vask hver 10-cm tallerken med 4 ml PBS (1,05 mM kaliumfosfat enbasisk, 155,17 mM natriumklorid, 2,97 mM dinatriumhydrogenfosfat) ved hjelp av en serologisk pipette og pipettes dispenser. Aspirer PBS og tilsett 3 ml E8 kulturmedier.
  7. Med lysene dimmes, fjerne lokket av 5 kultur retter og plassere cellene på et flatt underlag utenom panseret. Plasser et glass filter over 5 kultur retter å filtrere ut lys med λ <300 nm. Plasser UV kilde på toppen av filteret. Crosslink prøver 30 min med 365 nm UV bestråling (2,4 mW / cm 2).
    MERK: Crosslinking tid bør bestemmes empirisk.
  8. Overfør kultur retter tilbake til panseret. Aspirer media med en Pasteur pipette er festet til en vakuum felle. Vask hver 10-cm tallerken med 4 ml PBS. Aspirer PBS. Legg 3 ml enzym for celledissosiasjon (se Materials List) per 10 cm rett til å distansere cellene. Inkuber 5 min ved 37 ° C.
    MERK: Ikke forvarme enzymet.
  9. Slukke enzym med 3 ml E8 media per parabolen. Overføring dissosierte celler til en 15 ml konisk rør.
    MERK: Plasser cellene på is fra dette punktet videre.
  10. Centrifuge dissosierte celler 5 min, 500 xg ved 4 ° C. Aspirer supernatanten for å fjerne enzymet, og media.
    MERK: Pause punkt. Celler kan bli flash-frosset i flytende nitrogen, lagret ved -80 ° C for etterfølgende behandling på et senere tidspunkt.

2. Isolering av Chromatin

  1. Tilsett 1,2 ml kosmiske buffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) og pipetter opp og ned flere ganger for å cellepelleten suspenderes for hver prøve i 1,2 ml COSMIC buffer.
    1. Legg 133 ul av hver av 100 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 100 mM benzamidin og 150 uM pepstatin proteaseinhibitorer friske til en sluttkonsentrasjon på 1 mM for PMSF og benzamidin og 1,5 pM for pepstatin. Split løsning av cellelysat i to amber 1,7 ml mikrosentrifugerør.
  2. Sonikere med ultralyd 35 min (10 sekunder på, 10 sekunder av, 60% effekt) for å fragmentere genomet til mellom 100nd 500 bp.
    1. Holde nivået av kromatin løsning i mikrosentrifugerør parallelt med nivået av vann i reservoaret. Bekreft dette nivået ved visuell inspeksjon.
      MERK:. Bekreft at DNA ble skåret med en 1,5% agarosegel 55
    2. Optimalisere ultralyd tid empirisk. Bruke en minimal mengde av is i reservoaret for å kjøle prøvene, og at isen ikke er i konflikt mellom prøvene og koppen horn.
  3. Sentrifuger prøven 12000 xg 10 min. Lagre vandig oppløsning som inneholder løselig kromatin ved å overføre det til et nytt gult mikrosentrifugerør med en pipette. Kast pelleten.
  4. Overfør 110 ul (10%) av prøven til et nytt mikrosentrifugerør og merk den Input DNA. Oppbevar ved -80 ° C. Lagre resten av kromatin prøven på is til bruk i trinn 3,3.

3. Capture av ligand-DNA kryssbindinger

  1. Bruk en pipette til å dispensere 60 mL streptavidin-belagte magnetiske kuler i et mikrosentrifugerør. Tilsett 1 ml kosmiske buffer og blandes på en nutator 5 min ved RT. Plassere magnetiske kuler på magnetisk separasjon stativ 2 min å fange perler. Fjern COSMIC buffer med en pipette.
    MERK: Ikke la perlene å tørke ut. Man går umiddelbart videre til neste trinn.
  2. Legg kromatin prøve (~ 1 ml) for å perler (60 ul) og resuspender perlene. Inkuber kromatin med streptavidin-belagte magnetiske kuler på minst 4 timer i en roterende, gynge blander ved 4 ° C. Inkuber prøvene O / N hvis ønskelig.

4. Isolering av Affinitetsrenset DNA

  1. Vasking av perler med 7 min intervall ved RT med følgende vaskebuffer for å fjerne ikke-spesifikke interaksjoner. Bruk en magnetisk separasjon stativ for å fange perler etter hver vask. Suspender perlene etter hver endring i vaskebuffer.
  2. Tilberede vaskebuffer i destillert avionisert vann og filter (0,2 um) før bruk. Butikken vaske Buffere 1 og 2 ved 4 ° C for several måneder. Forbered Wash Buffer tre fersk hver dag. Legge til og fjerne vask buffere fra prøven med en pipette. For 2 og 4, tilsett 1 og 3 (5 mM), henholdsvis i vaskingene. Prøver kan også bli vasket to ganger med kosmiske buffer (en gang i 12 timer, en gang 4 timer) før vaskingene er oppført nedenfor.
    1. Vask en gang med en vaskebuffer (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 3% SDS). Vask en gang med vaskebuffer 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP40, 1% natriumdeoksycholat). Vask to ganger med vaskebuffer 3 (4 M urea, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,1% NP-40). Vask to ganger med Tris EDTA (TE) buffer (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA).
  3. Resuspender perler i 200 ul TE-buffer med en pipette. Denne prøve er fanget av DNA blir referert til som affinitetsrenset (AP) DNA.
  4. Supplere Input og AP DNA med 10x Crosslink Tilbakeføring Buffer (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], en M KOH, 4 mmEDTA) til 1 x sluttkonsentrasjon. 56,57 Inkuber 30 minutter ved 90 ° C.
    MERK: 254 nm UV-bestråling kan også brukes til å reversere psoralen tverrbindes, 58 men cyklobutyl pyrimidin dimerer kan bli dannet fra bestråling ved denne bølgelengde og forstyrre nedstrøms prosessering av DNA.
  5. For AP DNA, plasserer mikrosentrifugerør inneholder prøven på magnetisk separasjon stativ 2 min ved RT og isolere væske (DNA) med en pipette. Overfør AP DNA (som har blitt sluppet fra perlene) til et nytt gult mikrosentrifugerør.
    NB: Den ønskede AP DNA i det flytende, ikke lenger er bundet til kulene.
  6. Nøytraliser inngang og AP DNA med konsentrert HCl til pH 7 ved å tilsette ca. 1 ul 6 N HCl per 100 pl prøven med en pipette. Bekrefte prøvene nøytralisert ved tilsetning av ~ 0,5 pl på pH-papir med en pipette. ADVARSEL: Konsentrert HCl er en sterk etsende syre. Håndtak i henhold til institusjonens217; s retningslinjer for egnet personlig verneutstyr.
  7. Legg RNase A (100 mg / ml) til 0,2 ug / ul sluttkonsentrasjon for både inngang og AP DNA. Inkuber 1 time ved 37 ° C. Legg Proteinase K (20 mg / ml) til 0,2 ug / ul sluttkonsentrasjon for både inngang og AP-DNA, legg. Inkuber 1 time ved 55 ° C.
  8. Rense DNA med DNA kolonne opprydding kit (se Materials List). 55 Elute DNA i 58 mL DNA-grade H 2 O. Butikken Input og AP prøver ved -20 eller -80 ° C
  9. Analyser AP DNA ved kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) med locus-spesifikke primere, og / eller ved neste generasjons sekvensering. For qPCR, bruker 2 ul DNA-AP pr locus med følgende parametre: 1 syklus med 95 ° C i 10 minutter og 40 sykluser av 95 ° C 20 sek, 54 ° C eller 56 ° C 20 sek, 72 ° C 40 sek.
    MERK: glødetemperaturen bør modifiseres i henhold til smeltetemperaturen av primerparene som brukes. Velg en annealing temperare som minimerer deteksjonssyklusen med ingen uspesifikk amplifikasjon.
    MERK: For analyse av neste generasjons sekvensering, satse på minst 10 millioner kartlagt leser. Antallet kartlagt lesninger kan økes ved å øke mengden av AP-DNA, og ved å kombinere færre sampler i et løp for sekvensering. Mer leser forbedre følsomheten. Standardpakker for ChIP-seq analyse (for eksempel Homer, 59 MACS, 60 og SPP 61) jobber med cosmic-seq data. Som med andre metoder som er avhengige av neste generasjons sekvensering, inkludert genomsekvensering og chip-seq, repetitive regioner skape uklarheter i justering og montering og dermed forbli en teknisk utfordring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å ta hensyn til ikke-uniform genom fragmentering og andre variabler, bør den rensede DNA alltid være normalisert mot en referanse av Input DNA. Primere som er spesifikke for et locus av interesse kan benyttes. Det er også nyttig å analysere et locus hvor molekylet ikke forventes å binde, som en negativ kontroll. Vi ser en> 100 ganger økning i polyamid belegg ved bestråling med 365-nm lys (figur 2).

Anriket DNA kan også analyseres ved neste generasjons sekvensering. DNA blir fremstilt for sekvensering på samme måte som ChIP DNA fremstilles (for eksempel, med en kommersiell prøve prep kit, se Materialer List). Selv med neste generasjons sekvensering, vi fortsatt bruke qPCR å bekrefte anriking av DNA på loci der vi forventer at polyamid å være bundet. Når sekvensert, leser rå DNA er justert til genom og tetthets spor er forberedt med samme programvare utviklet for å analysere Chip-seq data (figur 3). Based på vår analyse av polyamid utdelinger i celler, fant vi at gruppert bindingsseter, som spenner over et bredt spekter av slektskap, best forutsi belegg i celler. Vi utviklet en algoritme å score hele genomet for binding med våre in vitro CSI data (Figur 4A). Dette scoring metoden avdekket at ulike genomisk loci med liknende spådd bindende score vise den mangfoldige clustering av flere områder av varierende slektskap (Figur 4B).

Figur 2
Figur 2. Resultater av COSMIC-qPCR. Effekt av 365 nm UV bestråling på brøkdel av AP / innspill fra HEK293 celler. AP, affinitets-renset. Resultatene er plottet på log skala og representerer gjennomsnitt ± SEM

Figur 3
Figur 3. Resultater av kosmisk-seq i H1 celler. COSMIC-seq tag tetthet spor for lineær polyamid 4 utformet for å målrette AAG gjentar. Tag tetthet ble normalisert til 10 7 tagger og vises med Integrated Genome Viewer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Modell av polyamid binding. (A) Fiolin plott av predikerte score for 2 og 4 bindende i hele genomet. Representative genomescapes for 4 vises også. Med bioinformatiske scoring metode som anvendes, kan genomiske loci summen til den samme forutsagte stillingen på forskjellige måter. (B) Loci med flere lav- og mellom affinitet sekvenser show lignende polyamid occupancy til loci med få høy affinitet sekvenser. Gjengitt med tillatelse. 51 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) any source
Benzamidine any source
Pepstatin any source
Proteinase K any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Life Technologies 65001
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-023 Other sources can be used
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Life Technologies A1110501
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit Illumina IP-202-1012 This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix BD Biosciences 356231 Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper any source
amber microcentrifuge tubes any source
microcentrifuge tubes any source
pyrex filter any source Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix any source
RNase any source
HCl (6 N) any source
10-cm tissue culture dishes any source
Serological pipettes any source
Pasteur pipettes any source
Pipette tips any source
15-ml conical tubes any source
centrifuge any source
microcentrifuge any source
nutator any source
Magnetic separation rack any source
UV source CalSun B001BH0A1A Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator Qsonica S4000 with 431C1 cup horn Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet any source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2013).
  2. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nat Rev Genet. 10, 252-263 (2009).
  3. Meier, J. L., Yu, A. S., Korf, I., Segal, D. J., Dervan, P. B. Guiding the Design of Synthetic DNA-Binding Molecules with Massively Parallel Sequencing. J. Am. Chem. Soc. 134, 17814-17822 (2012).
  4. Dervan, P. B. Molecular recognition of DNA by small molecules. Bioorg. Med. Chem. 9, 2215-2235 (2001).
  5. Wemmer, D. E., Dervan, P. B. Targeting the minor groove of DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 7, 355-361 (1997).
  6. Eguchi, A., Lee, G. O., Wan, F., Erwin, G. S., Ansari, A. Z. Controlling gene networks and cell fate with precision-targeted DNA-binding proteins and small-molecule-based genome readers. Biochem. J. 462, 397-413 (2014).
  7. Mrksich, M., et al. Antiparallel side-by-side dimeric motif for sequence-specific recognition in the minor groove of DNA by the designed peptide 1-methylimidazole-2-carboxamide netropsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7586-7590 (1992).
  8. Edayathumangalam, R. S., Weyermann, P., Gottesfeld, J. M., Dervan, P. B., Luger, K. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 6864-6869 (2004).
  9. Suto, R. K., et al. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. J. Mol. Biol. 326, 371-380 (2003).
  10. Gottesfeld, J. M., et al. Sequence-specific Recognition of DNA in the Nucleosome by Pyrrole-Imidazole Polyamides. J. Mol. Biol. 309, 615-629 (2001).
  11. Chenoweth, D. M., Dervan, P. B. Structural Basis for Cyclic Py-Im Polyamide Allosteric Inhibition of Nuclear Receptor Binding. J. Am. Chem. Soc. 132, 14521-14529 (2010).
  12. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-κB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 1023-1028 (2012).
  13. Yang, F., et al. Antitumor activity of a pyrrole-imidazole polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1863-1868 (2013).
  14. Mapp, A. K., Ansari, A. Z., Ptashne, M., Dervan, P. B. Activation of gene expression by small molecule transcription factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3930-3935 (2000).
  15. Ansari, A. Z., Mapp, A. K., Nguyen, D. H., Dervan, P. B., Ptashne, M. Towards a minimal motif for artificial transcriptional activators. Chem. Biol. 8, 583-592 (2001).
  16. Arora, P. S., Ansari, A. Z., Best, T. P., Ptashne, M., Dervan, P. B. Design of artificial transcriptional activators with rigid poly-L-proline linkers. J. Am. Chem. Soc. 124, 13067-13071 (2002).
  17. Nickols, N. G., Jacobs, C. S., Farkas, M. E., Dervan, P. B. Modulating Hypoxia-Inducible Transcription by Disrupting the HIF-1–DNA Interface. ACS Chemical Biology. 2, 561-571 (2007).
  18. Pandian, G. N., et al. A synthetic small molecule for rapid induction of multiple pluripotency genes in mouse embryonic fibroblasts. Sci. Rep. 2, 544 (2012).
  19. Pandian, G. N., et al. Synthetic Small Molecules for Epigenetic Activation of Pluripotency Genes in Mouse Embryonic Fibroblasts. Chem Bio Chem. 12, 2822-2828 (2011).
  20. He, G., et al. Binding studies of a large antiviral polyamide to a natural HPV sequence. Biochimie. 102, 83-91 (2014).
  21. Edwards, T. G., Vidmar, T. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. DNA Damage Repair Genes Controlling Human Papillomavirus (HPV) Episome Levels under Conditions of Stability and Extreme Instability. PLoS ONE. 8, e75406 (2013).
  22. Edwards, T. G., Helmus, M. J., Koeller, K., Bashkin, J. K., Fisher, C. HPV Episome Stability is Reduced by Aphidicolin and Controlled by DNA Damage Response Pathways. Journal of Virology. , (2013).
  23. Edwards, T. G., et al. HPV episome levels are potently decreased by pyrrole-imidazole polyamides. Antiviral Res. 91, 177-186 (2011).
  24. Dickinson, L. A., et al. Inhibition of RNA polymerase II transcription in human cells by synthetic DNA-binding ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12890-12895 (1998).
  25. Dickinson, L. A., et al. Arresting Cancer Proliferation by Small-Molecule Gene Regulation. Chem. Biol. 11, 1583-1594 (2004).
  26. Nickols, N. G., et al. Activity of a Py–Im Polyamide Targeted to the Estrogen Response Element. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 675-684 (2013).
  27. Raskatov, J. A., Puckett, J. W., Dervan, P. B. A C-14 labeled Py–Im polyamide localizes to a subcutaneous prostate cancer tumor. Bioorg. Med. Chem. 22, 4371-4375 (2014).
  28. Jespersen, C., et al. Chromatin structure determines accessibility of a hairpin polyamide–chlorambucil conjugate at histone H4 genes in pancreatic cancer cells. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4068-4071 (2012).
  29. Chou, C. J., et al. Small molecules targeting histone H4 as potential therapeutics for chronic myelogenous leukemia. Molecular Cancer Therapeutics. 7, 769-778 (2008).
  30. Nickols, N. G., Dervan, P. B. Suppression of androgen receptor-mediated gene expression by a sequence-specific DNA-binding polyamide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 10418-10423 (2007).
  31. Minoshima, M., Bando, T., Sasaki, S., Fujimoto, J., Sugiyama, H. Pyrrole-imidazole hairpin polyamides with high affinity at 5CGCG3 DNA sequence; influence of cytosine methylation on binding. Nucleic Acids Res. 36, 2889-2894 (2008).
  32. Warren, C. L., et al. Fabrication of duplex DNA microarrays incorporating methyl-5-cytosine. Lab on a Chip. 12, 376-380 (2012).
  33. Dudouet, B., et al. Accessibility of nuclear chromatin by DNA binding polyamides. Chem. Biol. 10, 859-867 (2003).
  34. Carlson, C. D., et al. Specificity landscapes of DNA binding molecules elucidate biological function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4544-4549 (2010).
  35. Warren, C. L., et al. Defining the sequence-recognition profile of DNA-binding molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 867-872 (2006).
  36. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Chapter One - Sequence-Specificity and Energy Landscapes of DNA-Binding Molecules. Methods Enzymol. Voigt, C. 497, Academic Press. 3-30 (2011).
  37. Puckett, J. W., et al. Quantitative microarray profiling of DNA-binding molecules. J. Am. Chem. Soc. 129, 12310-12319 (2007).
  38. Keles, S., Warren, C. L., Carlson, C. D., Ansari, A. Z. CSI-Tree: a regression tree approach for modeling binding properties of DNA-binding molecules based on cognate site identification (CSI) data. Nucleic Acids Res. 36, 3171-3184 (2008).
  39. Hauschild, K. E., Stover, J. S., Boger, D. L., Ansari, A. Z. CSI-FID: High throughput label-free detection of DNA binding molecules. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 3779-3782 (2009).
  40. Lee, M., Roldan, M. C., Haskell, M. K., McAdam, S. R., Hartley, J. A. In vitro Photoinduced Cytotoxicity and DNA Binding Properties of Psoralen and Coumarin Conjugates of Netropsin Analogs: DNA Sequence-Directed Alkylation and Cross-Link. 37, 1208-1213 (1994).
  41. Wurtz, N. R., Dervan, P. B. Sequence specific alkylation of DNA by hairpin pyrrole–imidazole polyamide conjugates. Chem. Biol. 7, 153-161 (2000).
  42. Tung, S. -Y., Hong, J. -Y., Walz, T., Moazed, D., Liou, G. -G. Chromatin affinity-precipitation using a small metabolic molecule: its application to analysis of O-acetyl-ADP-ribose. Cell. Mol. Life Sci. 69, 641-650 (2012).
  43. Rodriguez, R., Miller, K. M. Unravelling the genomic targets of small molecules using high-throughput sequencing. Nat Rev Genet. 15, 783-796 (2014).
  44. Guan, L., Disney, M. D. Covalent Small-Molecule–RNA Complex Formation Enables Cellular Profiling of Small-Molecule–RNA Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10010-10013 (2013).
  45. White, J. D., et al. Picazoplatin, an Azide-Containing Platinum(II) Derivative for Target Analysis by Click Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 135, 11680-11683 (2013).
  46. Rodriguez, R., et al. Small-molecule–induced DNA damage identifies alternative DNA structures in human genes. Nat Chem Biol. 8, 301-310 (2012).
  47. Bando, T., Sugiyama, H. Synthesis and Biological Properties of Sequence-Specific DNA-Alkylating Pyrrole−Imidazole Polyamides. Acc. Chem. Res. 39, 935-944 (2006).
  48. Anders, L., et al. Genome-wide localization of small molecules. Nat. Biotechnol. 32, 92-96 (2014).
  49. Jin, C., et al. Chem-seq permits identification of genomic targets of drugs against androgen receptor regulation selected by functional phenotypic screens. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 9235-9240 (2014).
  50. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
  51. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Ansari, A. Z. Mapping Polyamide–DNA Interactions in Human Cells Reveals a New Design Strategy for Effective Targeting of Genomic Sites. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 10124-10128 (2014).
  52. Hyde, J. E., Hearst, J. E. Binding of psoralen derivatives to DNA and chromatin: influence of the ionic environment on dark binding and photoreactivity. Biochemistry. 17, 1251-1257 (1978).
  53. Erwin, G. S., Bhimsaria, D., Rodríguez-Martínez, J. A., Grieshop, M. P., Ansari, A. Z. Genome-wide localization of polyamide-based genome readers reveals sequence-based binding to repressive heterochromatin. In preparation. , (2015).
  54. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, 424-429 (2011).
  55. Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. A. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J Vis Exp. (74), e50286 (2013).
  56. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27, 5174-5178 (1988).
  57. Kumaresan, K. R., Hang, B., Lambert, M. W. Human Endonucleolytic Incision of DNA 3′ and 5′ to a Site-directed Psoralen Monoadduct and Interstrand. J. Biol. Chem. 270, 30709-30716 (1995).
  58. Cimino, G. D., Shi, Y. B., Hearst, J. E. Wavelength dependence for the photoreversal of a psoralen-DNA crosslink. Biochemistry. 25, 3013-3020 (1986).
  59. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol. Cell. 38, 576-589 (2010).
  60. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  61. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotech. 26, 1351-1359 (2008).
  62. Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
  63. Martinson, H. G., True, R. J. On the mechanism of nucleosome unfolding. Biochemistry. 18, 1089-1094 (1979).
  64. Gloss, L. M., Placek, B. J. The Effect of Salts on the Stability of the H2A−H2B Histone Dimer. Biochemistry. 41, 14951-14959 (2002).
  65. Jackson, V. Formaldehyde Cross-Linking for Studying Nucleosomal Dynamics. Methods. 17, 125-139 (1999).
  66. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Meth. 11, 203-209 (2014).
  67. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18602-18607 (2013).
  68. Kundaje, A. Phantompeakqualtools home page. , ENCODE Consortium, Computer Science Dept. Available from: https://www.encodeproject.org/software/phantompeakqualtools/ (2010).
  69. Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
  70. Hurley, L. H. DNA and its associated processes as targets for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 2, 188-200 (2002).

Tags

Molecular Biology COSMIC CSI molekylær anerkjennelse cheminformatics kjemiske genomikk polyamid genom målretting presisjon medisin DNA kromatin immunopresipitering neste generasjons sekvense
Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Erwin, G. S., Grieshop, M. P.,… More

Erwin, G. S., Grieshop, M. P., Bhimsaria, D., Eguchi, A., Rodríguez-Martínez, J. A., Ansari, A. Z. Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin). J. Vis. Exp. (107), e53510, doi:10.3791/53510 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter