Denne artikel beskriver metoderne til screening af gener, der kontrollerer plasmodesmal permeabilitet og dermed auxin gradient under tropiske respons. Dette omfatter måling af graden af tropiske respons i hypokotyle af Arabidopsis thaliana og kontrol plasmodesmal permeabilitet med 8-hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsyre (HPTS) lastning og vurdering endelig callose niveau.
Anlægget hormon auxin spiller en vigtig rolle i mange vækst- og udviklingsprocesser, herunder tropiske reaktioner på lys og tyngdekraft. Etableringen af en auxin gradient er en central begivenhed, der medfører fototropisme og gravitropism. Tidligere blev polar auxin transport (PAT) vist at etablere en auxin gradient i forskellige cellulære domæner af planter. Men Han et al. Nylig vist, at for korrekt auxin gradient dannelse, plasmodesmal callose-medieret symplasmic konnektivitet mellem de tilstødende celler er også en kritisk faktor. I dette manuskript, til den strategi, belyse den rolle, bestemte gener, som kan påvirke fototropisme og gravitropism ved at ændre symplasmic tilslutning via modulerende plasmodesmal callose syntese, diskuteres. Det første skridt er at screene afvigende tropiske svar fra 3 dage gamle etiolerede frøplanter af mutanter eller over-udtryk linjer af et gen sammen med den vilde type. Denne indledende screeningkan føre til identifikation af en række gener fungerer i PAT eller kontrollerende symplasmic tilslutningsmuligheder. Den anden screening indebærer sortering af kandidater, der viser ændrede tropiske svar ved at påvirke symplasmic tilslutningsmuligheder. For at imødegå sådanne kandidater, blev bevægelsen af en symplasmic sporstof og aflejring af plasmodesmal callose undersøgt. Denne strategi vil være nyttigt at udforske nye kandidatgener, der kan regulere symplasmic konnektivitet direkte eller indirekte under tropic svar og andre udviklingsprocesser.
Planter, som sessile levende organismer, har udviklet en meget avanceret netværk af celle-til-cellesignalering at løse forskellige miljømæssige stimuli. Tropic responser er en af de fænomener, som planter reagerer på miljømæssige stimuli. Planter viser to vigtigste tropiske svar, fototropisme og gravitropism. Fotosyntetiske planter bøje mod lyskilden ved fototropisme at høste maksimal energi. Tilsvarende gravitropism gør planterne at vokse mod tyngdepunkt. Den grundlæggende mekanisme, der fører til sådanne tropiske reaktioner involverer asymmetrisk gradient dannelse af phytohormonet auxin en. Det handler om lokale auxin gradient dannelse er godt karakteriseret; de gener, der er involveret i denne mekanisme giver en køreplan for hormon handling 2-8. Den specifikke placering af auxin efflux bærere, såsom PIN-formed (PIN) og p-glycoproteiner, udfører bevægelsen af auxin fra cytoplasmaet til cellevæggen af donorceller 9,10. Furthermore, ved den aktive H + / IAA symport aktivitet af auxin tilstrømning bærere, såsom AUX1 / LAX familie proteiner, auxin er endelig leveret til de tilstødende modtager celler 2,11,12. Denne retningsbestemt bevægelse af auxin er kendt som polar auxin transport (PAT). PAT fører til en differentiel auxin fordeling under forskellige udviklingsstadier og som reaktion på forskellige miljømæssige stimuli 13,14. Desuden afbrydelse i lokalisering eller ekspression af nogen af disse auxin indstrømning eller efflux bærere fører til alvorlig ændring i PAT, som forårsager en afbrydelse af den auxin-gradient, hvilket fører til udviklingsmæssige defekter. For nylig, Han et al. rapporterede, at plasmodesmal forordning er også nødvendig for at opretholde auxin gradient 15. Til dato har mere end 30 plasmodesmal proteiner blevet identificeret 16. Blandt disse proteiner har AtGSL8 blevet rapporteret som et centralt enzym til callose syntese ved plasmodesmata (PD), og derfor spiller en afgørende rolle i maintaining grænse PD udelukkelse størrelse (SEL). Undertrykt AtGSL8 udtryk resulterede i en forvrænget auxin gradient mønster fører til ingen tropiske respons i modsætning til vildtype kimplanter 15.
I dette manuskript, metoder udforske nye kandidatgener, der er involveret i PD regulering leveres. AtGSL8 blev anvendt som en model protein for at teste disse metoder, da det er et vigtigt enzym bidrager til PD callose biosyntese. På grund af den kimplante-letalitet gsl8 knock-out mutanter 17, blev dexamethason (dex) inducerbare RNAi linjer anvendes i overensstemmelse med en tidligere offentliggjort rapport 15. Oplysningerne her strategi kan tilpasses til at screene gener, der er impliceret i hypokotyle tropic respons kontrolleret af PD SEL.
I dette manuskript, til en strategi screene mutant / over-udtryk linjer, der er defekte fototropisk og gravitropic reaktioner som følge af ændret PD callose og dermed er PD SEL beskrevet i detaljer. PD callose syntese og nedbrydning hovedsageligt opnås ved callose syntaser og β-1,3-glucanaser, men reguleringen af disse enzymer er kontrolleret af mange opstrøms faktorer. For at søge efter sådanne opstrøms faktorer eller kandidater, der er direkte involveret i PD regulering, har vi oprettet denne metode til …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Grundforskningsfonden Korea (NRF-2015R1A2A1A10053576), og af en bevilling fra den næste generation af Biogreen 21 Program (SSAC yde PJ01137901), Udvikling af Landdistrikterne Administration, Republikken Korea. RK, WS, ABB og DK blev støttet af Brain Sydkorea 21 Plus-programmet (BK21 +).
HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
100 mL glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
Petri Dish (35×10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
Autoclave | ALP | CL-40L | |
Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |