Protocol
כל הליכי הניסוי אושרו על ידי אוניברסיטת וירג'יניה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.
הערה: איור 1 מציג סקירה סכמטי של הפרוצדורות.
1. הכנת ביציות
- X. טרום ראש laevis נקבות עם 150 U של הסוסה הרה סרום גונדוטרופין (PMSG) כשבוע מראש של בידוד ביצית. הזרק 1 מיליליטר 150 U PMSG / מיליליטר לצק הלימפה הגבי עם מזרק סטרילי 1 סמ"ק עם 29 מחט G.
- הכן את הפתרונות להזרקת ביצית וביצית assay כובע-חיה.
- הכן Ca ++ / Mg ++ -חינם OR2 (OR2-): 82 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4, 50 מ"מ HEPES pH 7.2.
- הכן OR2: OR2- בתוספת 1 מ"מ CaCl 2 ו 1 מ"מ MgCl 2.
- הכן OCM: 60% L15 ליבוביץ, 0.4 מ"ג / מיליליטר BSA, 100 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, pH 7.8.
- מִרֹאשׁלקלף MBS 1x: 88 מ"מ NaCl, 1 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgSO 4, 5 מ"מ HEPES (pH 7.8), 2.5 מ"מ NaHCO 3.
- הכן 3% Ficoll בMBS 1x.
- הכן NAM 1x: 110 מ"מ NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ Ca (NO 3) 2, 1 מ"מ MgSO 4, 0.1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ NaHCO 3, 2 מ"מ Na 3 PO 4, pH 7.4.
- להרדים את הנקבה בפתרון של 0.03% אתיל מלח methanesulfonate 3-aminobenzoate (MS222) ב0.1x MBS (לפזר MS222 0.3 גרם ב 10 מיליליטר אתנול 95% ראשון, ואז לדלל בL 1 MBS 0.1x) על ידי הצבת צפרדע בפתרון ל 10 - 15 דקות או עד שאינו מגיב.
- בדוק ההרדמה שהושלמה על ידי הפיכת צפרדע הרדים על הגב שלה, כדי להבטיח שלא מגיב (חלקי צפרדעים הרדים להזיז גפיים או להתהפך גוף).
- ניתוח לבודד ברי השחלות על ידי ביצוע חתך בבטן דרך עור וקיר גוף עם להב סכין מנתחים, בידוד רקמת השחלה עם מלקחייםומספריים. מניחים שברי השחלות לOR2-. סגור את קיר הגוף עם תפר 3-0 משי על מחט מעוקלת 24 מ"מ ולסגור את העור בנפרד עם אותו התפרים. לאפשר התאוששות של נקבה במלח אקווריום 1 גרם / L במים.
- באמצעות מלקחיים עדינים, רקמת השחלה מדמיע לתוך קטנות - חתיכות (10 20 ביציות) והעברה לOR2- הטרי.
- שברי Defolliculate השחלות ב2.0 מ"ג / מיליליטר collagenase בOR2- על ידי התססה בעדינות על שייקר לשעה 1, העברה לcollagenase הטרי והתססה לשעה אחת נוספת.
- לשטוף ביציות 10 פעמים בOR2 [המכילות Ca ++ / Mg ++], השלכת ביציות קטנות יותר.
- לשטוף ביציות בOCM שתי פעמים ולהעביר לOCM הטרי. לבודד ביציות השלב השישי בגודל על בדיקה ויזואלית וזורקי ביציות לא בשלות (קטנות יותר): ביציות השלב השישי הן גדולות יותר מביציות לא בשלות עם פיגמנטציה אפילו בחצי כדור בעלי החיים וכ 1.2-1.4 מ"מ בקוטר.
- לשמור על ביציות בגיל 18 - אני C ° 20n OCM לפני ההזרקה. הערה: צלחות פטרי מצופה Agarose ניתן להשתמש כדי למזער דבק של ביציות לצלחת.
2. הזרקה של תמלילי הספרייה
- הכן RNA באמצעות ספריית cDNA כיוונית 15 חולץ בשלב מתאים של פיתוח (לדוגמא, שלב צלחת עצבית 14 10). לרכוש ספריית cDNA או לבנות אחד באמצעות ערכה מסחרית לסקירה בארבעה השלבים הבאים.
- לבודד כ 5 מיקרוגרם mRNA על ידי שימוש במוצר להעשרה לפולי () + RNA (ראה טבלה של חומרים) והבאים הוראות יצרן. הערה: התמלילים לשמש כדי לייצר ספריית cDNA עשוי להיות מוגבלת לרקמת התרמה (כגון צלחת העצבית, הבאים microdissection של הרקמה הרצויה), או יכולים להיות מכל עוברים בשלב מסוים.
- לייצר cDNA עם ערכה מסחרית, הבא הוראות יצרן.
- ולקשור כ 20 ng cDNA לתוך vector כלול בערכה המסחרית או אחר וקטור מתאים. וקטור פלסמיד מתאים כולל רצפים ליציבות mRNA כגון 5 'β-גלובין ורצפי 3 פולי (א) (pCS2 +, pTnT, pCS105).
- להפוך קשירה לתאי חיידקים המוסמכים באמצעות הפרוטוקול המומלץ של ספק לשינוי הלם חום.
הערה: לחלופין, אוסף של שיבוטים מסגרת קריאה פתוחה (ORFeome) הוא זמין באופן מסחרי וניתן להשתמש כדי ליצור תעתיקים להזרקה.
- הכן 10 בריכות של פלסמידים של 10 מרס - 10 אפריל מורכבות (10 אפריל - 10 מאי מורכבות כוללת). זה מייצג 10 צלחות עם 1,000 - 10,000 מושבות כל אחד.
- ספריית צלחת תרבות על 10 צלחות LB-אמפיצילין 15 ס"מ, לגדול 12-18 שעות ב 37 C, ולאסוף מושבות מכל על ידי לחץ עדין עם מפזר זכוכית ב -7 ליטראות מיליליטר
- הכן מלאי גליצרול מ0.5 מיליליטר (להוסיף לגליצרול סטרילי 0.2 מ"ל ולאחסן ב -20 ו730 #; ג), ולהשתמש ב6.5 מיליליטר שנותר להכין DNA עם ערכה סטנדרטית זמינה מסחרי DNA miniprep הבא הוראות יצרן.
- Linearize DNA נקווה פלסמיד (1.0-2.0 ק"ג) עם הגבלה מתאימה אנזים עיכול 16 ב 37 C עבור 1-1.5 שעות. לבודד את ה- DNA לינארית עם חילוץ פנול / כלורופורם ואחריו משקעים אתנול וresuspension במים למפרט של ערכת RNA פולימראז משמשת. לסנתז RNA תחושה עם ערכת RNA פולימראז מסחרית הבאים הוראות יצרן.
- הכן מחטים עבור microinjection (באמצעות חולץ מחט עם צינורות זכוכית נימים) של כ 20 מיקרומטר קוטר; למדוד טיפים מחט במיקרוסקופ מתחם עם מיקרומטר עיני מכויל. הערה: הגדרות חולץ מחט חייבת לקבוע באופן אמפירי כדי לייצר מחט עם קצה קנס כזה שכאשר נשבר עם מלקחיים עדינים מניב גודל הקצה הרצוי.
- הכן (לדחוף חימר לשכבה אחידה על תחתית הצלחת) 35 x 10 מ"מ צלחות פטרי עם חריצים מקבילים להחזיק ביציות במקום במהלך microinjection מרופד חימר; לייצר חריצים עם בדיקה קניון או פיפטה פסטר התמזגה בקצה בלהבה. כחלופה לחימר, להכין מנות agarose עושים חריצים עם עובש אלסטומר 17. העברת ביציות עם טפטפת רחב נשא לFicoll 3% בMBS 1X (כ 2 מיליליטר) בשורות במנות עטורות חימר.
- שימוש microinjector, למלא מחט עם 1 ננוגרם / RNA NL ולכוון את האיזון כדי לייצר לחץ חיובי קל (כדי למנוע עריכת של ציטופלסמה ביצית).
- הזרק ביציות עם כ 20 RNA NL באזור הקו המשווה. הרשה שעה 1 לביציות מוזרקות להישאר בFicoll-MBS, ולאחר מכן להעביר בעדינות לMBS 1x. דגירה עבור 8 - 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לפני assay כובע בעלי החיים.
3. בעלי החיים קאפ Assay
- הכן 3 / 4x NAM ולהשיג מלקחיים עדינים, שיער לולאה, שברי coverslip מעוקלים, דיס-מצופה חימרהס עם חריצים בצורת כוס להחזיק ביציות. הפוך ברי coverslip מעוקלים על ידי מתפרק coverslips זכוכית לרסיסים קטנים (1 כ - 2 מ"מ x 2 - 4 מ"מ) ועובר דרך להבה עד קצוות פולני ולצנוח, הפקת חתיכה מעוקלת.
- לדשן X. laevis ביצים 18 דרך במבחנה או הזדווגות ותרבות לgastrula שלבים טבעיות (10 - 11 שעות לאחר הפריה בRT) ב0.1x MBS לפני המיון לפי שלב; לאסוף אמצע gastrula (שלב 11-11.5) 10 עוברים.
- העברה עובר לצלחת פטרי כ חצי מלא עם 3 / 4x NAM. שימוש בשני זוגות של מלקחיים בסדר, להסיר את קרום הפריה (vitelline) מgastrulae.
- העברת ביציות כדי 3 / 4x NAM (כ 2 מיליליטר) במנות עטורות חימר ולשתק בהופעות בודדות בחימר, הפקת הופעות כדי להכיל עוברי אדם כחריצים תוארו לעיל.
- העברה עובר לכלים מצופה חימר ולחתוך כובעי בעלי חיים מזastrulae באמצעות שני זוגות מלקחיים בסדר. דואג לבודד את האאקטודרם כובע חיה רקמה המשוונית בלבד ולא 18.
- הנח כובע בעלי חיים בחצי כדור החיה של כל ביצית עם המשטח הפנימי של כובע החיה פנייה הביצית. החזק recombinants יחד על ידי יישום בר coverslip זכוכית מעוגלת והפעלת לחץ כלפי מטה על הזכוכית, משטח את האאקטודרם כאנשי קשר coverslip החימר (כובעי בעלי חיים יכולים להישאר פתוח עם השכבה הפנימית החשופה על פני השטח של הביצית ל6 - 8 שעות או יותר ).
הערה: לחלופין, למקם את כובע החיה לכניסת חימר עם המשטח הפנימי שלה פונה כלפי מעלה ומניח את ביצית בכובע; לאבטח את רקומביננטי עם סיומות קטנות של חימר. - תרבות בC ° 20 עד עוברי שליטה להגיע רצוי שלב עבור assay.
- רקומביננטי נפרד על ידי הסרת coverslip / חימר ובידוד האאקטודרם עם מלקחיים ושיער לולאה.
- תקן שברי ectodermal עבור שעה 1 בMEMFA (3.8%פורמלדהיד בממ [0.1 M pH 7.4 מגבים, 2 מ"מ EGTA, ו 1 מ"מ MgSO 4]).
- שברי העברה (ועוברים בקרה) מMEMFA לתוך אתנול והחנות ב -20 מעלות.
4. ניתוח של תגובה בהאאקטודרם על ידי אתר בהכלאה (עורך)
- הכן את הפתרונות לאיש.
- הכן 1x PBS: 0.01 מלוח M פוספט שנאגרו, NaCl 0.138 M, pH 7.4
- הכן PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0.1% Tween-20
- הכן את הפתרון של 100x Denhart: BSA 2%, polyvinylpyrrolidone 2%, 2% Ficoll
- הכן הכלאה הצפת: 50 Formamide%, 5x SSC, 1 מ"ג / מיליליטר torula שמרי RNA, 1 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, הפתרון של 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0.1% בחורים, 10 מ"מ EDTA, DEPC-H 2 O
- הכן חומצהמאלית הצפת (MAB): חומצת maleic 100 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.5
- הכן MAB + בלוק: MAB, 2% חסימה מגיב (חום עד 60 ג 'ללפזר)
- הכן אלקליין phosphatase (AP) מאגר: 100 מ"מ טריסpH 9.5, 50 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ NaCl, Tween 0.1%, DH 2 O
- הכן את הבדיקה RNA.
- באמצעות ערכת RNA פולימראז מסחרית ולחפור-NTP לערבב, להוסיף לצינור 1.5 מיליליטר (50 תגובת μl): DEPC-H 25.5 μl 2 O, 10 μl 5X תמלול הצפת, 2.5 μl תערובת 10x חפירה-NTP, 5 μl 100 מ"מ DTT, 2 μl RNAsin, 2 μl תבנית ה- DNA לינארית (~ 1 מיקרוגרם / μl), 3 μl RNA פולימראז ודגירת 37 צלזיוס למשך 90 דקות.
- הוסף 2 μl RNA פולימראז ודגירה 37 צלזיוס למשך 60 דקות.
- בדוק 2 μl של תגובה על 1% agarose ג'ל.
- להוסיף RNase ללא DNase RQ1 μl 1 דגירה 37 צלזיוס למשך 20 דקות.
- לזרז את הבדיקה על ידי הוספת 50 μl DEPC-H 2 O, 25 μl 10 M אמוניום אצטט וμl 313 אתנול. חנות ב -20 מעלות למשך לילה (O / N) ולאחר מכן לשחזר RNA על ידי צנטריפוגה ב13800 XG במשך 20 דקות. לשטוף עם 500 אתנול 75% μl, ספין בקצרה, להסיראתנול ולאפשר גלולה לייבוש באוויר. הוסף 50 μl DEPC-H 2 O.
- להוסיף הכלאה הצפת לריכוז סופי של ~ 0.5 מיקרוגרם / μl.
- הכן רקמות לכלאה. אלא אם צוין אחרת, למלא בקבוקונים לראש עם כל שינוי פתרון מתואר (כ 4 מיליליטר).
- הסר אתנול מבקבוקונים ועוברי העברה לאתנול 75% / PTW, אז 50% אתנול / PTW במשך 10 דקות כל אחד, במאוזן על נדנדה.
- לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
- העבר עד 10 מיקרוגרם / טיפול proteinase K μl בPTW; צינורות רוק אנכי 15 דקות.
- יש לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד ב 0.1 7.8 M Triethanolamine pH - צינורות רוק אנכי.
- להוסיף 12.5 μl אנהידריד אצטית לצינורות ורוק אנכי 5 דקות. חזור עם אנהידריד אצטית 12.5 μl נוסף במשך 5 דקות.
- לשטוף בPTW 5 דקות אנכית על נדנדה.
- Refix ב -4% דקות paraformaldehyde 20 על כיסא נדנדה. חום הכלאה הצפת60 ג.
- לשטוף שלוש פעמים בPTW במשך 5 דקות כל אחד על כיסא נדנדה.
- הסר את כל אבל ~ 1 מיליליטר של PTW מצינור אחד ולהוסיף 250 היב הצפת μl; בעדינות מערבולת צינורות לערבב. צינורות רוק אנכי 5 דקות.
- החלף עם C 60 היב מאגר (0.5 מיליליטר) ולהתסיס בעדינות על 60 ג '10 דק'. החלף עם טרי היב הצפת ולהתסיס בC 60 שנים עד 4 שעות.
- בדיקה חום (1 מיליליטר ברמה של 0.5 מיקרוגרם / μl בהיב מאגר) עד 60 C (3 דקות). הסר היב מאגר ולהוסיף בדיקה לצינורות. להתסיס בעדינות O / N ב 60 ג.
- הכן רקמות לנוגדן.
- 0.1% Tween-20 פתרונות היב מאגר חם ו2x SSC + 60 ג.
- החלף פתרון בדיקה עם היב הצפת (להציל את הבדיקות ב -20 מעלות במשך 2 - 3x שימוש חוזר). לשטוף ב 60 צלזיוס למשך 10 דקות.
- לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב2x SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
- לשטוף שלוש פעמים ב -60 C ב0.2X SSC-Tween (20 דקות כל אחד עם תסיסה).
- לשטוף פעמיים בMAB (RT) במשך 15 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
- להוסיף MAB מיליליטר 1 + בלוק. לשטוף 2 שעות אנכית על נדנדה.
- העברה לMAB מיליליטר 1 + בלוק המכיל 1 / 2,000 אנטי-digoxygenin-AP. רוק אנכי ב 4 CO / N.
- הכן רקמות לצבע מגיב.
- החלף פתרון נוגדן עם MAB; לשטוף שלוש פעמים בMAB 5 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
- לשטוף שלוש פעמים בשעה MAB 1 כל אופקי על נדנדה.
- לשטוף פעמיים בAP הצפת 10 דקות כל אחד במאוזן על נדנדה.
- העבר את רקמות ולמרובה-מגש פלסטיק, להסיר ולהוסיף AP מאגר בע"מ מגיב סגול (~ 1 מיליליטר). לאפשר תגובה להמשיך בדקות 5 כהות לO / N.
- כאשר הצביעה מתאימה מושגת, להעביר רקמות לבקבוקונים של PTW. לשטוף פעמיים 10 דקות כל אחד בPTW על נדנדה.
- לתקן בפתרון של Bouin ב 4 CO / N על נדנדה.
- לשטוף את Bouin של עם שלושה שוטף PTW / 30% אתנול 70% ב RT. המשך to לכידת תמונה באמצעות עלית תאורה ומצלמה רכוב מיקרוסקופ, הלבנה אם 18 דרושים.
5. Sib בחירה ושיבוט
- בריכה בחר עם הפעילות הגבוהה ביותר (התגובה הגדולה ביותר ברקמת ectodermal).
- לכיל (לדלל עם LB לצפיפות מתאימה) מניית גליצרול לבריכה עם הפעילות הגבוהה ביותר וצלחת את עשר צלחות חדשות עם כ עשירית מושבות מהשלב הקודם (באמצעות סעיף 2 בפרוטוקול לעיל).
- להקטין את גודל בריכה עד הפעילות היא לייחס למושבה אחת.
- להשיג רצף ה- DNA באמצעות פריימרים סטנדרטיים בווקטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתגובה לביטוי של mRNA מוזרק לתוך ביציות, להגיב רקמת כובע חיה assayed לביטוי של otx2 ידי הכלאה באתר (איור 2 ולוח 1); otx2 בא לידי ביטוי בהאאקטודרם העדשה המשוערת (PLE) מסגירת צינור עצבית באמצעות placode העדשה עיבוי 19. עם זאת, מאז otx2 בא לידי ביטוי גם בהאאקטודרם הקדמי עצבי כמו גם האאקטודרם ראש שאינו עצבי מחוץ לPLE, זה קשור לשני עצבי ותגובות placodal. השימוש בfoxe3 להקרין את הספרייה למוצר גן מסוגל לייצר תגובת עדשה-אינדוקטיביים בהאאקטודרם כובע חיה עדשה-מוסמכת אפשר גישה ספציפית יותר למטרה של שיבוט הביטוי, מאז foxe3 בא לידי ביטוי בPLE מצלחת עצבית שלבים ולאורך היווצרות שלפוחית עדשת 20, הנמצאים באזורים סמוכים placodal אבל נעדרו מneuroectoder M. שימוש בביטוי השיבוט ופרוטוקול בחירת SIB לעיל והזרקת בריכות של תמלילי ספרייה, גן מסוגל לייצר ביטוי foxe3 בכובעי בעלי החיים בודד (טבלה 2). בעקבות בידוד של השיבוט, 179 מבחני כובע בעלי חיים נוספים באמצעות ביציות הוזרקו תמלילי ספרייה הוקרנו לביטוי של foxe3; 50 היו חיוביים (28%). של 140 חתיכות כובע בעלי החיים מונחות על ביציות uninjected, 0 היו חיוביים (איור 3).
איור 1. ביצית-החיה קאפ Assay וביטוי שיבוט סקירה סכמטי של הפרוטוקול:. תעתיקים ערוכים מספריית השיבוט ומוזרקים לתוך ביציות, האאקטודרם כובע בעלי החיים הוא תרבותי עם ביציות ולאחר מכן assayed עבור ביטוי גנים הנגרם על ידי הכלאה באתר. ד / 53,518 53518fig1large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. תוצאות איור אופייניות של בעלי החיים קאפ Assay הבאים הזרקת mRNA וכלאה באתר לOtx2. (AB) תוצאת נציג התגובה אינדוקטיביים לdorsalized פולי שלב 14 (א) + RNA בכובעי בעלי חיים, assayed לotx2 ביטוי על ידי הר שלם באתר הַכלָאָה. כובעים () בעלי חיים מונחים על ביציות uninjected בשלב 10.5 ותרבותי לשלב 25. שלב 10.5 כובעי בעלי חיים (ב ') שהונחו על ביציות מוזרקות עם 10 ng RNA ותרבותי לשלב 25. otx2 ביטוי נצפה ב6/7 מקרים ושצוין על ידי ראשי חץ. בר = 500 מיקרומטר. "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. תוצאות איור אופייניות של בעלי החיים קאפ Assay הבא הכלאה באתר לFoxe3. (AC) כובעי חיה נציג ממבחני כובע ביצית-חיה, נבדקו לביטוי של foxe3 ידי הכלאה באתר. (א) שלב 11-11.5 כובעי בעלי חיים מונחים על ביציות מוזרק ldb1 ותרבותי ל23. foxe3 ביטוי השלב הוא הצביע על ידי ראשי חץ. שלב (ב) 11-11.5 כובעי בעלי החיים מונחים על ביציות וuninjected תרבותיים לביים 23; אין ביטוי foxe3 זוהה. סעיף (ג) דרך foxe3 החיובי למושרה כובע בעלי חיים מביטוי מראה בשכבות פנימיות וחיצוניות של האאקטודרם. ברים = 500 מיקרומטר.f = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| RNA המוזרק | מקרים חיוביים | גֵן | % |
| שלב 14 mRNA dorsalized, 10 ng | 12/24 | otx2 | 50 |
| בריכות ספרייה של 10 5 שיבוטים, 20 ng | 3/9 | otx2 | 33 |
| בריכות ספרייה של 05-10 אוקטובר 0 clon es, 20 ng | 50/179 | foxe3 | 28 |
| אַף לֹא אֶחָד | 0/140 | foxe3 | 0 |
טבלת 1. ביצית-בעלי החיים קאפ Assay תוצאות תוצאות של assay כובע בעלי החיים שהוערכו על ידי הכלאה באתר עם otx2 וfoxe3, באמצעות ביציות הוזרקו mRNA או עם תמלילים מסונתזים מבריכות ספריית cDNA.; או ביציות uninjected.
| RNA המוזרק | ייעוד בריכה / בחירה | ביטוי foxe3 חיובי |
| א | 2/4 | |
| B * | 4/28 | |
| ג | 4/44 | |
| בריכות ספרייה של 10 שיבוטים 4, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| בריכות ספרייה של 5,000 שיבוטים, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| בריכות ספרייה של 70-200 מושבות, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| בריכות ספרייה של 20 מושבות, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| RNAs הספרייה, 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| RNA הספרייה, 20 ng | L1 אישור (ldb1) | 50/179 |
| * מציין בריכה נבחרת |
טבלת 2. Sib בחירה וExpression שיבוט תוצאות. הבריכה עם הרמה הגבוהה ביותר של תגובה בכל assay כובע בעלי החיים (הנע בין 10% ו -36% חיוביים לביטוי foxe3) נבחרה לשימוש בניסוי הבא כדי לצמצם את הפעילות לשיבוט אחד. כוכבית מציינת בריכה נבחרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן לשיבוט הפונקציונלי של גנים מסוגלים גרימת תגובה בהאאקטודרם מוסמך יכולה לשמש כדי לזהות מגוון רחב של מוצרי גן. שיטה זו מרחיבה על העבודה האחרונה על ידי שילוב של מבחני וישכנע רקמה עם טכניקות שיבוט ביטוי. אנו מנצלים את המסלולים המטבוליים של ביצית Xenopus כמקור לייצור של גרימת גורמים, במישרין או בעקיפין, לאחר הזרקת RNA. זה, בשילוב עם השימוש בשיטות שהוקמו לשיבוט גן של עניין 6,7 באמצעות ביטוי של תמלילים שנוצרו מספריית cDNA או אוסף אחר של שיבוטים, מספק גישה רבת ערך עבור אלה המחפשים לזהות גנים של העניין החדש המעורב בעוברי הַשׁרָאָה. התחולה הרחבה של שיטה זו לזיהוי תפקודי של גנים חדשים היא משלים שימושי לגישות גנטיות הפוכים חדשות ומרגשות, ויכולה לשמש גם לפונקציונליים תמלילי בדיקה זוהו באמצעות גבוה throughput שיטות (כגון RNA-seq) 21.
פקדים הם קריטיים בניטור התפקוד מטבולים של ביציות בשימוש assay הכובע. שני על מנת להבטיח את בריאותם של כל אצווה של ביציות ולהקים את התועלת של מערכת זו כדי לזהות תמלילים נמוך שפע, ריכוזים שונים של mRNA של inducer המזודרם INHBB נבדק; גן זה הוא שאינו קשור לנתיב עדשה-האינדוקציה ושליטה עצמאית מתועדת היטב 14. שריר-התרמה פעילות, assayed על ידי הביטוי של אנטיגנים שריר ספציפי בהאאקטודרם כובע חיה עם הנוגדן 12/101, נצפה עם 2-200 PG INHBB mRNA, אפילו בנוכחות של 500 פי פולי שלב 14 עודף () + RNA. המערכת היא בכך שימושית על מגוון רחב מאוד של כמות RNA מוזרקת, וביציות מסוגלות לייצר יציבות חלבון ולהישאר קיימא לאחר הזרקת cytoplasmic של כרכים של 50 NL וגבוה יותר.
שיקול אחד לuse של ספריית cDNA בפרוטוקול זה הוא הצורך באורך מלא או כמעט שיבוטים באורך מלא. לפני השימוש בפרוטוקול, הספרייה צריכה להיבדק על ידי ניתוח צפון כדי לקבוע את הגודל של תמלילים ידועים בספרייה ולכן לצמצם את האפשרות שהשפעות דומיננטיות שליליות מתקבלות מפוטנציאל מקוצצים תמלילים מוזרקים. מאז בריכת cDNA באורך מלא היא חשובה, השימוש בשיבוטי EST 22 או בצורה אופטימלית, צפרדעי ORFeome 23 (שמספק ערכה של שיבוטים באורך מלא תוקף מלאה) עדיפים לספריית cDNA מסורתית, אלא אם כן מבוים ודקיק מקור ספציפי של cDNA הם ביקשו ומשמש לבניית הספרייה. שיקול נוסף הוא הנוכחות של β-גלובין ופולי () רצפים בוקטור הספרייה נועד להגדיל את יציבות ה- mRNA בתמלילים מוזרקים. אמנם זה רצוי להגדיל את כמות החלבון המופק מmRNA הסינתטי מוזרק, זה גם מעלה את possibility לייצר אפקט דומיננטי שלילי מmRNA שהוא גבוה יותר ביציבות ובפעילות מin vivo. MRNA מספר נמוך עותק לא להפעיל את אותו האפקט כמו עמיתו אנדוגני שלה ברקע של בריכה גדולה של תמלילים; אחד שהוא התייצב בתהליך השיבוט והשעתוק עשוי להימשך כדי לאפשר איתור בassay הכובע. נושא שלישי הוא גודל בריכה; הפחתה ניכרת של גודל בריכה (10 שיבוטים או פחות) כבר הוכיחה להיות יתרון בפרויקטי ההקרנה האחרונים רווח של פונקציה בעוברים 24 והוא צפוי לספק תוצאות ברורות וזיהוי קל יותר של גני מועמדים. גודל בריכה קטן יותר מאשר 10 מרס - 10 אפריל המומלץ בפרוטוקול זה הוא בר השגה אם את המורכבות הכוללת של האוסף של שיבוטים היא פחות מ -10 4, כמו במקרה עם ORFeome 23; אפשר להקרין ~ 9,000 השיבוטים מתחילים עם 10 בריכות של 900, למרות שזה עשוי להיות עתיר עבודה להחריד ללעבד יותר מ -10 בריכות בניסוי.
קביעת הסוג של מוצר גן (על ידי ניתוח רצף) שנעשה על ידי הגן שזוהה במסך קובעת את אופי הבדיקות של תפקודו. מאז קו-פקטורי שעתוק גרעיניים זוהה במסך שלנו 8, היה צורך לאשר את תפקידו של הגרעין בתהליך אינדוקטיבי מופעל על ידי הקדמה של ldb1. יש לי ביציות מכונות סינתטיות חלבון לתפקוד מלא והם קיימא ומסוגל לייצר גורמים מופרשים מתמלילים מוזרקים. עם זאת, היעדר הגרעין יבטל תפקוד של גורמי שעתוק, קו-פקטורים, או מוצרי גן בעקיפין-פועלים אחרים. ניתוחים שלאחר מכן של הגנים שזוהו במסך כוללים קביעת דפוס ביטוי התפתחותי על ידי הכלאה באתר ולהשיג של פונקציה ובדיקות אובדן של הפונקציה. ביטוי יתר על ידי הזרקה של RNA לזיגוטות או על ידי הגבלת הזרקה לSPלסטומרים ecific להגביל את השפעותיו לאזורים מסוימים של העובר יכול לספק תובנות, כמו גם מציאה של תפקוד גן באמצעות הזרקה של oligonucleotides morpholino המכוון נגד תמליל in vivo.
הדמיה ישירה של השפעה אינדוקטיביים בהאאקטודרם כובע בעלי החיים מגיב באמצעות קו מהונדס עם גן כתב (כגון ה- GFP) עשויים לזרז באופן משמעותי את תהליך המיון ולבטל את הצורך בניתוח של ביטוי RNA על ידי הכלאה באתר. כמו כן, השימוש בנוגדנים כאמצעי מהיר של הקרנה רצוי אם נוגדן מתאים (כגון 12/101 לתגובת שריר שנדונה לעיל) זמינים. עוברי אלבינו עשויים לשמש לכובעי בעלי החיים, שלמרות שיותר קשה לשלב בצורה מדויקת בשלבי gastrula, לייעל את תהליך ההכלאה באתרו על ידי ביטול הצורך בהלבנה של פיגמנטציה wild-type לדמיין לדרבן תגובת צבע טוב יותרUCT.
לבסוף, חשוב להביא בחשבון כי מכמה סיבות, במספר רב של ניסויים ייתכן שיהיה צורך שנערך לזהות גן מסוים. לאחד, את מספר המקרים ניתן באופן סביר במשפט נתון מוגבל על ידי הפיתוח (ואובדן סופי של יכולת) המתרחש לאורך זמן אפילו נתן קבוצה גדולה של עוברים וטווח של טמפרטורות שבו לתרבותם, כ גם בהפסד שעלול להתרחש בחתיכות קטנות של האאקטודרם בעיבוד. שנית, שיעורי הצלחה של ביטוי של סמן נבחר בהאאקטודרם עשויים להיות נמוכים מאוד ודורשים מקרים רבים להתבונן השפעה מובהקת סטטיסטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
