Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af University of Virginia Institutional Animal Care og brug Udvalg.
Bemærk: Figur 1 viser en skematisk oversigt over de eksperimentelle procedurer.
1. Fremstilling af oocytter
- Pre-prime X. laevis kvinder med 150 U Gravid Mare Serum Gonadotropin (PMSG) ca. en uge i forvejen oocyt isolation. Injicer 1 ml 150 U / ml PMSG i dorsal lymfeknuder vej med 1 cc steril sprøjte med 29 G nål.
- Fremstille opløsninger til oocyt injektion og oocyt-animalsk cap assay.
- Forbered Ca ++ / Mg ++ -fri OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2.
- Forbered OR2: OR2- plus 1 mM CaCl2 og 1 mM MgCl2.
- Forbered OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 pg / ml gentamycin, pH 7,8.
- Premenligne 1x MBS: 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO3.
- Forbered 3% Ficoll i 1x MBS.
- Forbered 1x NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4.
- Bedøver hunnen i en 0,03% opløsning af ethyl-3-aminobenzoat-methansulfonat salt (MS222) i 0,1 x MBS (første opløses 0,3 g MS222 i 10 ml 95% ethanol, derefter fortyndes i 1 liter 0,1x MBS) ved at placere frø i opløsning 10 - 15 minutter, eller indtil afvisende.
- Kontroller at anæstesi er komplet ved at dreje bedøvet frøen på ryggen for at sikre, at det reagerer ikke (ufuldstændigt bedøvede frøer flytter lemmer eller slå kroppen over).
- Kirurgisk isolere æggestokkene fragmenter ved at gøre et abdominalt indsnit gennem huden og krop væg med skalpel, isolering ovarievævet med pincetog sakse. Placer æggestokkene fragmenter i OR2-. Luk kropsvæggen med en 3-0 silkesutur på en 24 mm krum nål og lukke huden separat med de samme suturer. Tillad inddrivelse af kvindelig i 1 g / l akvarium salt i vandet.
- Brug fine pincet, rive ovarievæv i små (10 - 20 oocytter) stykker og overførsel til frisk OR2-.
- Defolliculate æggestokkene fragmenter i 2,0 mg / ml collagenase A i OR2- ved omrøring forsigtigt på rysteapparat i 1 time, overførsel til frisk collagenase og agitere for en ekstra time.
- Vask oocytter 10 gange i OR2 [indeholder Ca ++ / Mg ++], genudsætning mindre oocytter.
- Vask oocytter i OCM to gange, og overføre til frisk OCM. Isoler Stage VI oocytter efter størrelse ved visuel inspektion og kassér umodne (mindre) oocytter: Stage VI oocytter er større end umodne oocytter med endnu pigmentering i halvkugle dyr og er omtrent 1,2-1,4 mm i diameter.
- Opretholde oocytter ved 18 - 20 ° C in OCM før injektion. Bemærk: Agarose-coatede petriskåle kan anvendes til at minimere klæbning af oocytter til parabol.
2. Injektion af Bibliotek Afskrifter
- Forbered en retningsbestemt cDNA-bibliotek under anvendelse af 15 RNA ekstraheret på et passende tidspunkt i udviklingen (f.eks neuralpladen fase 14 10). Køb en cDNA bibliotek eller konstruere en anvendelse af et kommercielt kit pr oversigten i de fire nedenstående trin.
- Isoler ca. 5 ug mRNA under anvendelse af et produkt til at berige for poly (A) + RNA (se tabel Materialer) og efter producentens anvisninger. Bemærk: De transkripter, der skal anvendes til at fremstille cDNA biblioteket kan begrænses til et inducerende væv (såsom neuralpladen efter mikrodissektion af det ønskede væv) eller kan være fra hele embryoner på et bestemt tidspunkt.
- Fremstil cDNA med et kommercielt kit, efter producentens anvisninger.
- Ligere ca. 20 ng cDNA i en VectoR inkluderet i kommercielt kit eller en anden egnet vektor. En passende plasmidvektor indeholder sekvenser til mRNA-stabilitet, såsom 5'-β-globin og 3 poly (A) sekvenser (pCS2 +, pTnT, pCS105).
- Omdan ligering i kompetente bakterieceller ved hjælp leverandørens anbefalede protokol for varme chok transformation.
Bemærk: Alternativt kan en samling af åben læseramme (ORFeome) kloner er kommercielt tilgængelig og kan anvendes til at frembringe udskrifter til injektion.
- Forbered 10 puljer af plasmider af 3 OKTOBER-4 oktober kompleksitet (april 10 - maj 10 samlede kompleksitet). Dette udgør 10 plader med 1.000 - 10.000 kolonier hver.
- Plade bibliotek kultur på 10 15-cm LB-ampicillinplader, vokser 12 - 18 timer ved 37 ° C, og indsamle kolonier fra hver af et let tryk med en glasspreder i 7 ml LB.
- Forbered en glycerolstamopløsning fra 0,5 ml (føje til 0,2 ml steril glycerol og opbevares ved -20 &# 730; C), og bruge de resterende 6,5 ml til fremstilling af DNA med en standard kommercielt tilgængeligt DNA miniprep kit ifølge producentens anvisninger.
- Linearisere pooled plasmid-DNA (1,0-2,0 ug) med passende restriktionsenzym fordøje 16 ved 37 ˚C til 1 - 1,5 timer. Isoler det lineariserede DNA med phenol / chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning og resuspension i vand pr specifikationerne for RNA-polymerase kit anvendes. Syntetisere RNA med et kommercielt RNA-polymerase kit ifølge producentens anvisninger.
- Forbered nåle til mikroinjektion (ved hjælp af en nål aftrækker med glas kapillarrør) på ca. 20 um diameter; måle nål tips om en forbindelse mikroskop med en kalibreret okular mikrometer. Bemærk: Needle aftrækker indstillinger skal være empirisk fast besluttet på at producere en nål med en fin spids, således at når brudt med fine pincet giver den ønskede spids størrelse.
- Forbered (skubbe ler indensartet lag på bunden af fad) ler-foret 35 x 10 mm petriskåle med parallelle riller til at holde oocytter på plads i løbet af mikroinjektion; producere riller med en mall probe eller Pasteur-pipette fusioneret ved spidsen i flammen. Som et alternativ til ler, fremstille agarose retter gør fordybninger med en elastomer formen 17. Overfør oocytter med en bred-boring pipette til 3% Ficoll i 1X MBS (ca. 2 ml) i rækker i ler-foret retter.
- Ved hjælp mikroinjektor, fylde nål med 1 ng / nl RNA og justere balancen til at producere let positivt tryk (for at forhindre udarbejdelse af oocyte cytoplasma).
- Injicere oocyter med cirka 20 nl RNA i ækvatoriale regionen. Tillad 1 hr til injicerede oocytter at forblive i Ficoll-MBS, derefter overføre forsigtigt til 1x MBS. Der inkuberes i 8 - 24 timer ved 20 ° C forud for dyr cap assay.
3. Animal Cap Assay
- Forbered 3 / 4x NAM og få fine pincet, hår loop, buede dækglas fragmenter, ler-foret disHES med skålformede fordybninger til at holde oocytter. Gør buede dækglas fragmenter ved opbrydning dækglas i små fragmenter (ca. 1 - 2 mm x 2 - 4 mm) og går gennem flammen, indtil kanterne polish og hænge, der producerer en buet stykke.
- Gød X. laevis æg 18 gennem in vitro eller naturlig parring og kultur til gastrula etaper (10-11 timer efter befrugtning ved RT) i 0,1 x MBS før sortering efter fase; indsamle midten gastrula (fase 11 - 11,5) 10 embryoner.
- Overfør embryoner til en petriskål omtrent halvt fyldt med 3 / 4x NAM. Bruger to par fine pincet, fjern befrugtning (vitelline) membran fra gastrulae.
- Overførsel oocytter til 3 / 4x NAM (ca. 2 ml) i ler-foret skåle og immobilisere i individuelle indtryk i ler, der producerer indtryk at imødekomme individuelle embryoer som riller blev beskrevet ovenfor.
- Overfør embryoner til ler-foret retter og skære dyr caps off gastrulae anvendelse af to par af fine tænger. Sørge for at isolere dyr kasket ektoderm kun og ikke ækvatoriale væv 18.
- Placer et dyr hætte på dyret halvkugle af hver oocyt med den indre overflade af dyret hætten i kontakt med oocytten. Hold rekombinanter sammen ved at anvende buede dækglas fragment og at trykke nedad på glasset, udfladning ectoderm som dækglasset i kontakt med ler (animal caps kan forblive åben med det indre lag udsættes for overfladen af oocytten for 6 - 8 timer eller længere ).
Bemærk: Du kan også placere dyret hætte i en ler fordybning med sin indre overflade vender opad og placere en oocyt på hætten; sikre rekombinante med små udvidelser af ler. - Kultur ved 20 ° C, indtil kontrol embryoer reach ønskede scene for analysen.
- Separat rekombinant ved at fjerne dækglas / ler og isolering ectoderm med pincet og et hår sløjfe.
- Fix ektodermale fragmenter i 1 time i MEMFA (3,8%formaldehyd i MEM [0,1 M MOPS, pH 7,4, 2 mM EGTA og 1 mM MgSO4]).
- Transfer fragmenter (og kontrol embryoner) fra MEMFA i ethanol og opbevares ved -20 C.
4. Analyse af respons i ectoderm ved in situ-hybridisering (ISH)
- Forbered løsninger til ISH.
- Forbered 1x PBS: 0,01 M phosphatbufret saltvand, NaCl 0,138 M, pH 7,4
- Forbered PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% Tween-20
- Forbered 100x Denharts opløsning: 2% BSA, 2% polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll
- Forbered hybridiseringsbuffer: 50% formamid, 5 x SSC, 1 mg / ml torula gær-RNA, 1 ug / ml heparin, 1x Denharts opløsning, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H2O
- Forbered maleinsyre Buffer (MAB): 100 mM maleinsyre, 150 mM NaCl, pH 7,5
- Forbered MAB + blok: MAB, 2% blokeringsreagens (varme til 60 ˚C at opløse)
- Forbered alkalisk phosphatase (AP) puffer: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH2O
- Forbered RNA-probe.
- Anvendelse af et kommercielt RNA-polymerase kit og grave-NTP mix tilsættes til et 1,5 ml rør (50 pi reaktion): 25,5 pi DEPC-H2O, 10 pi 5X Transcription Buffer, 2.5 pi 10x dig-NTP mix, 5 pi 100 mM DTT, 2 pi RNAsin, 2 pi lineariseret DNA-template (~ 1 pg / pl), 3 pi RNA-polymerase, og der inkuberes 37 ° C i 90 min.
- Tilsæt 2 pi RNA-polymerase, og der inkuberes 37 ° C i 60 min.
- Kontrol 2 pi reaktion på 1% agarose gel.
- Tilsæt 1 pi RQ1 Rnase-Free DNase og inkuberes 37 C i 20 min.
- Udfælde probe ved tilsætning af 50 pi DEPC-H2O, 25 pi 10 M ammoniumacetat og 313 pi ethanol. Opbevares ved -20 ° C natten over (O / N) og derefter genvinde RNA ved centrifugering ved 13.800 xg i 20 minutter. Vask med 500 pi 75% ethanol, spinde kort, fjernesethanol og tillade pellet lufttørre. Tilføj 50 pi DEPC-H 2 O.
- Tilføj hybridiseringsbuffer til en slutkoncentration på -0,5 pg / pl.
- Forbered Tissue til hybridisering. Medmindre andet er angivet, fyld hætteglas til toppen med hver opløsning beskrevne ændring (ca. 4 ml).
- Fjern ethanol fra hætteglas og overføre embryoer i 75% ethanol / PTW, så 50% ethanol / PTW i 10 min hver, vandret på rocker.
- Vask tre gange i PTW i 5 min på hver rocker.
- Overførsel til 10 pg / pl proteinase K behandling PTW; rock-rør lodret 15 min.
- Skyl to gange 10 minutter hver i 0,1 M Triethanolamin pH 7,8 - Rock rør lodret.
- Tilføj 12.5 pi eddikesyreanhydrid til rør og rock lodret 5 min. Gentag med yderligere 12,5 pi eddikesyreanhydrid i 5 minutter.
- Vask i PTW 5 min lodret på rocker.
- Refix i 4% paraformaldehyd 20 min på rocker. Heat hybridiseringsbuffertil 60 ° C.
- Vask tre gange i PTW i 5 min på hver rocker.
- Fjern alle men ~ 1 ml PTW fra hvert rør og tilsæt 250 pi Hyb Buffer; forsigtigt hvirvel rør til at blande. Rock rør lodret 5 min.
- Erstatte med 60 ° C Hyb buffer (0,5 ml) og omrør forsigtigt ved 60 ° C 10 min. Erstat med frisk Hyb Buffer og agitere ved 60 ˚C to til fire timer.
- Heat sonde (1 ml ved 0,5 ug / ul i Hyb Buffer) til 60 ˚C (3 min). Fjern Hyb buffer og tilføj sonde til rør. Ryst forsigtigt O / N ved 60 ˚C.
- Forbered Tissue for antistof.
- Varm Hyb Puffer og 2x SSC + 0,1% Tween-20 løsninger på 60 ° C.
- Udskift sonde løsning med Hyb Buffer (gem sonder ved -20 C i 2 - 3x genbrug). Vask ved 60 C i 10 min.
- Vask tre gange ved 60 ˚C i 2x SSC-Tween (20 min hver med agitation).
- Vask tre gange ved 60 ˚C i 0,2 x SSC-Tween (20 min hver med agitation).
- Vask to gange i MAB (RT) i 15 minutter hver vandret på rocker.
- Tilsæt 1 ml MAB + blok. Vask 2 timer lodret på rocker.
- Overførsel til 1 ml MAB + blok, der indeholder en 1 / 2.000 Anti-digoxygenin-AP. Rock lodret ved 4 CO / N.
- Forbered Væv til Color Reagens.
- Erstat antistofopløsning med MAB; vaskes tre gange i MAB 5 minutter hver vandret på rocker.
- Vask tre gange i MAB 1 time hver vandret på rocker.
- Vask to gange i AP puffer 10 minutter hver vandret på rocker.
- Overfør væv til multiple-godt plastbakke, fjern AP Buffer og tilføje BM Purple reagens (~ 1 ml). Tillad reaktionen forløber i mørk 5 min til O / N.
- Når det er relevant farvning er opnået, overføre væv til hætteglas med PTW. Vask to gange 10 minutter hver i PTW på rocker.
- Fix i Bouins opløsning ved 4 CO / N på rocker.
- Skyl Bouins med tre 70% ethanol / 30% PTW vaske ved stuetemperatur. Fortsæt to billedoptagelse hjælp epi-belysning og et mikroskop monteret kamera, blegning om nødvendigt 18.
5. Sib Valg og kloning
- Vælg pool med den højeste aktivitet (største respons i ectodermal væv).
- Titrer (fortyndes med LB til passende tæthed) glycerol lager til puljen med den højeste aktivitet og pladen ud ti nye plader med cirka en tiendedel af kolonier fra det foregående trin (under anvendelse af afsnit 2 i protokol ovenfor).
- Reducer pool størrelse, indtil aktiviteten er spores tilbage til enkelt koloni.
- Opnå DNA-sekvens ved anvendelse af standard primere i vektoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som reaktion på ekspression af mRNA injiceres i oocyter, reagerer animalsk cap væv blev analyseret for ekspression af otx2 ved in situ hybridisering (figur 2 og tabel 1) otx2 udtrykkes i den formodede linsen ectoderm (PLE) fra neurale lukning rør gennem linsen placode fortykkelse 19. Men da otx2 også udtrykkes i den forreste neurale ektoderm såvel som ikke-neurale ektoderm hoved uden for PLE, er det forbundet med både neural og placodal reaktioner. Brugen af foxe3 at screene biblioteket for et gen produkt stand til at producere en linse-induktiv respons i linsen-kompetent dyr kasket ectoderm tillod en mere specifik tilgang til målet om udtrykket kloning den, da foxe3 udtrykkes i PLE fra neurale plade etaper og hele linsen vesikeldannelse 20, der er til stede i tilgrænsende placodal regioner, men fraværende fra neuroectoder m. Brug af ekspressionskloning og sib selektionsprotokol ovenfor og injicere puljer af bibliotekets transkripter, blev et gen stand til at producere foxe3 ekspression i animalske hætter isoleret (tabel 2). Efter isolering af klonen, blev 179 yderligere dyr cap assays under anvendelse af oocytter injiceret med bibliotekets transkripter screenet for ekspression af foxe3; 50 var positive (28%). 140 dyr cap stykker placeret på uinjicerede oocytter, 0 var positive (figur 3).
Figur 1. oocyt-assay dyr Cap og ekspressionskloning Skematisk oversigt over protokollen:. Transkripter fremstillet ud fra klonen bibliotek og injiceres i oocyter, animalsk cap ektoderm er dyrket med oocyter og derefter analyseret for induceret genekspression ved in situ hybridisering. d / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Typiske resultater af en Animal Cap Assay følgende mRNA Injection og in situ hybridisering for Otx2. (AB) repræsentativt resultat af induktive svar på dorsalized fase 14 poly (A) + RNA i animalske caps, analyseret for otx2 ekspression ved hele mount in situ hybridisering. (A) Animal hætter placeret på uinjicerede oocytter på stadie 10.5 og dyrket til scenen 25. (B) Etape 10,5 dyr huer placeret på oocytter injiceret med 10 ng RNA og dyrket til scenen 25. otx2 udtryk observeret i 6/7 tilfælde og angivet med pilespidser. Bar = 500 um. "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Typiske Resultater af Animal Cap Assay efter in situ hybridisering til Foxe3. (AC) Repræsentative dyr hætter fra oocyt-dyr cap assays, testet for ekspression af foxe3 ved in situ hybridisering. (A) Etape 11-11,5 dyr hætter placeret på ldb1-injicerede oocytter og dyrket til scenen 23. foxe3 udtryk er angivet med pilespidser. (B) Etape 11-11,5 dyr hætter placeret på uinjicerede oocyter og kulturperler at iscenesætte 23; nr foxe3 ekspression detekteret. (C) Snit gennem foxe3 -positiv induceret dyr cap fra A viser udtryk i indre og ydre lag af ectoderm. Barer = 500 um.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Injiceret RNA | Positive tilfælde | Gene | % |
| Stage 14 dorsalized mRNA, 10 ng | 12/24 | otx2 | 50 |
| Library puljer af 10 5 kloner, 20 ng | 3/9 | otx2 | 33 |
| Library puljer af 05-10 oktober 0 clon es, 20 ng | 50/179 | foxe3 | 28 |
| Ingen | 0/140 | foxe3 | 0 |
Tabel 1. oocyt-Animal Cap assayresultater Resultater af animalsk cap assay vurderet ved in situ hybridisering med otx2 og foxe3, ved hjælp af oocyter injiceret med mRNA eller med udskrifter syntetiseret fra cDNA bibliotek puljer.; eller uinjicerede oocytter.
| Injiceret RNA | Pool betegnelse / udvælgelse | Positiv foxe3 udtryk |
| EN | 2/4 | |
| B * | 4/28 | |
| C | 4/44 | |
| Library puljer af 10 4 kloner, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| Library puljer af 5.000 kloner, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| Library puljer af 70-200 kolonier, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| Library puljer af 20 kolonier, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| Bibliotek RNA'er, 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| Bibliotek RNA, 20 ng | L1 (ldb1) bekræftelse | 50/179 |
| * Angiver valgte pulje |
Tabel 2. Sib Valg og EXPREssion Kloning Resultater. Puljen med det højeste niveau af respons i hvert dyr cap assay (mellem 10% og 36% positive for foxe3 ekspression) blev udvalgt til anvendelse i det næste eksperiment for at indsnævre aktiviteten i en klon. Stjerne angiver valgte pulje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne for den funktionelle kloning af gener stand til at inducere et respons i kompetent ektoderm metode kan anvendes til at identificere en lang række genprodukter. Denne fremgangsmåde udvider tidligere arbejde ved at kombinere væv-inducerende assays med ekspressionskloning teknikker. Vi udnytter de metaboliske veje i Xenopus-oocyt som en kilde til produktion af inducerende faktorer, der direkte eller indirekte, efter RNA injektion. Dette, i kombination med anvendelse af etablerede metoder til kloning af et gen af interesse 6,7 ved hjælp af ekspressionen af udskrifter genereret fra et cDNA bibliotek eller anden samling af kloner, giver en værdifuld tilgang til dem, der søger at identificere gener af nye interesse involveret i embryonale induktion. Den brede anvendelighed af denne metode til funktionel identifikation af nye gener er et nyttigt supplement til spændende nye omvendte genetiske metoder, og kan også bruges til funktionelt test udskrifter identificeret ved hjælp af high-throughput metoder (såsom RNA-seq) 21.
Kontrollerne er kritisk i overvågningen af metaboliske funktion af oocytter, der anvendes i hætten assay. Både for at sikre sundheden for hver batch af oocytter og etablere nytten af dette system til at detektere lav overflod udskrifter, varierende koncentrationer af mRNA for mesoderm inducer INHBB blev testet; dette gen er relateret til linsen-induktion vej og er en veldokumenteret uafhængig kontrol 14. Muskel-inducerende aktivitet, analyseret ved ekspression af muskel-specifikke antigener i dyr cap ektoderm med 12/101 antistof, blev observeret med 2 - 200 pg INHBB mRNA, selv i nærværelse af 500 gange overskud fase 14 poly (A) + RNA. Systemet er således anvendelige i en meget bred vifte af injiceret RNA mængde, og oocytter er i stand til stabilt at producere protein og forblive levedygtige efter cytoplasmatisk injektion af volumener 50 nl og højere.
Et vederlag for uSE af et cDNA bibliotek i denne protokol er nødvendigheden af fuld længde eller næsten fuld længde kloner. Før brug i protokollen, bør biblioteket undersøges af Northern analyse for at bestemme størrelsen af kendte udskrifter i biblioteket, og derfor reducere muligheden for, at der opnås dominante-negative effekter fra potentielt trunkerede injicerede udskrifter. Da en fuld-længde cDNA puljen er vigtigt, at anvendelse af EST-kloner 22 eller optimalt, Xenopus ORFeome 23 (som indeholder et komplet sæt af validerede kloner i fuld længde) foretrækkes frem for en traditionel cDNA-bibliotek, medmindre en stage- og vævs- specifikke kilde cDNA søges og anvendes til bibliotekskonstruktion. En anden overvejelse er tilstedeværelsen af β-globin og poly (A) sekvenser i biblioteket vektor formål at forøge mRNA-stabilitet i injicerede transkripter. Mens dette er ønskeligt at øge mængden af protein produceret af indsprøjtet syntetisk mRNA, men også hæver possibility til fremstilling af en dominant negativ effekt fra mRNA, der er højere stabilitet og aktivitet end in vivo. En lav kopi nummer mRNA kan ikke udøve de samme virkninger som dets endogene modstykke i baggrunden af en stor pulje af udskrifter; en, der er stabiliseret i kloning og transskription proces kan vare ved at muliggøre detektion i hætten assay. Et tredje problem er pool størrelse; betydelig reduktion af pool størrelse (10 kloner eller færre) er blevet påvist at være en fordel i de seneste gevinst-of-funktion screening projekter i embryoner 24 og vil sandsynligvis give klarere resultater og nemmere identifikation af kandidatgener. En mindre pool størrelse end 10 3 - 10 4 anbefales i denne protokol er opnåeligt, hvis den samlede kompleksitet af samlingen af kloner er mindre end 10 4, som det er tilfældet med ORFeome 23; man kunne screene de ~ 9.000 kloner der begynder med 10 puljer af 900, selvom det kan være uoverkommeligt arbejdskrævende tilbehandle mere end 10 puljer i et eksperiment.
Bestemmelse af typen af genprodukt (ved sekvensanalyse) fremstillet af genet identificeret på skærmen bestemmer arten af test af dets funktion. Da et nukleart transkriptionel cofaktor blev identificeret i vores skærm 8, var det nødvendigt at bekræfte rolle kernen i den induktive proces udløses ved indføring af ldb1. Udskrællet oocytter har fuldt fungerende protein syntetisk maskineri og er levedygtige og i stand til at producere udskilles faktorer fra injicerede udskrifter. Fravær af kernen, vil imidlertid ophæve funktion transkriptionsfaktorer, cofaktorer eller andre indirekte virkende genprodukter. Efterfølgende analyser af gener er identificeret i skærmen omfatter fastlæggelse af udviklingsmæssige udtryk mønster ved in situ hybridisering og vinde-of-funktion og tab af funktion tests. Overekspression ved injektion af RNA i zygoter eller ved at begrænse injektion til SPecific blastomeres at begrænse dens virkninger til bestemte regioner i embryo kan give indsigt, samt knockdown af genfunktion ved injektion af morpholino oligonukleotider rettet mod in vivo-transkriptet.
Direkte visualisering af en induktiv effekt i dyr reagerer cap ektoderm anvendelse af en transgen linje med et reportergen (såsom GFP) kan i høj grad fremskynde udvælgelsesprocessen, og eliminerer behovet for analyse af RNA-ekspression ved in situ hybridisering. Tilsvarende anvendelse af antistoffer som hurtigere hjælp af screening er ønskeligt, hvis et passende antistof (såsom 12/101 for muskelrespons diskuteret ovenfor) er tilgængelig. Albino embryoner kan anvendes til dyr hætter, som selv vanskeligere at iscenesætte nøjagtigt på gastrula faser, strømline in situ hybridisering proces ved at eliminere behovet for en blegning af vildtype-pigmentering bedre at visualisere farvereaktionen proddukt.
Endelig er det vigtigt at overveje, at af adskillige grunde, kan et stort antal forsøg skal udføres for at identificere et givet gen. For én, kan antallet af sager en rimelig fremgangsmåde i et givet forsøg er begrænset af udviklingen (og eventuelt tab af kompetence), der opstår over tid selv givet et stort parti af embryoner og en række temperaturer, ved hvilke for kulturen dem, som samt tab, der kan opstå af små stykker ectoderm i behandling. For en anden, kan succesrater for udtryk for en udvalgt markør i ectoderm være meget lav og kræver mange tilfælde at iagttage en statistisk signifikant effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
