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Developmental Biology

Functional Cloning Mit ein doi: 10.3791/53518 Published: January 30, 2016

Protocol

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Alle experimentellen Verfahren wurden von der University of Virginia Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

ANMERKUNG: Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die experimentellen Verfahren.

1. Herstellung von Oozyten

  1. Pre-prime X. laevis Weibchen mit 150 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) etwa eine Woche im Voraus über Eizelle Isolation. Injizieren Sie 1 ml 150 U / ml PMSG in Rücken Lymphsack mit 1 cc sterile Spritze mit 29 G-Nadel.
  2. Bereiten Sie Lösungen für Oocyteninjektion und Oozyten-Tierkappe Assay.
    1. Vorbereitung Ca ++ / Mg ++ -freier OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2.
    2. Bereiten OR2: OR2- plus 1 mM CaCl 2 und 1 mM MgCl 2.
    3. Vorbereitung OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml Gentamycin, pH 7,8.
    4. Prepare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO 3.
    5. Bereiten Sie 3% Ficoll in 1x MBS.
    6. 1fach NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4.
  3. Betäuben die Frau in einer 0,03% igen Lösung von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz (MS222) in 0,1 MBS (erste aufzulösen 0,3 g MS222 in 10 ml 95% Ethanol, dann in 1 L 0,1 x MBS verdünnen), indem Frosch in Lösung 10-15 Minuten oder bis nicht mehr reagiert.
    1. Prüfen Sie, ob der Anästhesie abgeschlossen durch Drehen narkotisierten Frosch auf den Rücken, um sicherzustellen, es reagiert nicht (vollständig betäubten Froschschenkel zu bewegen oder drehen Körper über) ist.
  4. Chirurgisch zu isolieren Eierstockfragmente, indem sie ein Bauchschnitt durch die Haut und Körper Wand mit Skalpell, Isolieren Eierstockgewebe mit einer Pinzetteund Schere. Zeigen Eierstock Fragmente in OR2-. Schließen Sie die Körperwand mit einem 3-0 Seidennaht auf einem 24 mm gebogene Nadel und schließen Sie die Haut separat mit den gleichen Nähten. Eine Wiederherstellung der weiblichen in 1 g / l Aquarium Salz in Wasser.
  5. Verwenden feinen Pinzette, reißEierStockGewebe in kleine (10 - 20 Eizellen) Stücke und Transfer zum frischen OR2-.
  6. Defolliculate ovarian Fragmente in 2,0 mg / ml Collagenase A in OR2- durch Rühren vorsichtig auf einem Schüttler für 1 Stunde, der Übertragung auf frische Kollagenase und Rühren für eine weitere Stunde.
  7. Wasch Oozyten 10mal OR2 [Ca ++ / Mg ++ enthält], Verwerfen kleiner Oozyten.
  8. Waschen Sie Oozyten in OCM zweimal und übertragen an die frische OCM. Isolieren Stufe VI Oozyten nach Größe bei Sichtprüfung und entsorgen unreifen (kleinere) Oozyten: Stufe VI Oozyten sind größer als die unreifen Eizellen mit noch Pigmentierung im Tier Hemisphäre und etwa 1,2 bis 1,4 mm Durchmesser.
  9. Pflegen Oozyten bei 18 - 20 ° C in OCM vor der Injektion. Hinweis: Agarose-beschichteten Petrischalen verwendet werden, um ein Anhaften von Eizellen zu minimieren, austeilen wird.

2. Injektion Bibliothek Transcripts

  1. Vorbereitung einer direktionalen cDNA-Bank 15 unter Verwendung von RNA in einem geeigneten Stadium der Entwicklung (beispielsweise neuronale Platte Stufe 14 10) extrahiert. Erwerben Sie eine cDNA-Bibliothek oder konstruieren eine Verwendung eines kommerziellen Kits pro Übersicht in den vier Schritten unten.
    1. Isolieren Sie etwa 5 ug mRNA mit einem Produkt, für Poly (A) + RNA (Siehe Tabelle der Materialien) zu bereichern und nach den Anweisungen des Herstellers. Anmerkung: Die Transkripte verwendet werden, um die cDNA-Bibliothek kann auf ein induzierendes Gewebe beschränkt sein zu erzeugen (wie beispielsweise das neuronale Platte nach Mikrodissektion des gewünschten Gewebes) oder kann aus ganzen Embryonen in einem bestimmten Stadium können.
    2. Produzieren cDNA mit einem kommerziellen Kit nach Herstelleranweisungen.
    3. Ligieren ungefähr 20 ng cDNA in einen vector, das mit dem kommerziellen Kit oder einem anderen geeigneten Vektor. Einen geeigneten Plasmidvektor enthält Sequenzen, die für mRNA-Stabilität, wie beispielsweise 5'-β-Globin-3 Poly (A) -Sequenzen (pCS2 +, pTnT, pCS105).
    4. Transform-Ligation in kompetente Bakterienzellen mit Lieferanten empfohlenen Protokoll für Hitzeschock-Transformation.
      Hinweis: Alternativ ist eine Sammlung von offenen Leserahmen (ORFeome) Klone Handel erhältlich und können verwendet werden, um Transkripte für die Injektion zu erzeugen.
  2. Herstellung von 10 Pools von Plasmiden von 10 3 bis 10 4 Komplexität (10. April - 10. MAI Gesamtkomplexität). Dies entspricht 10 Platten mit 1.000 - je 10.000 Kolonien.
    1. Plattenbibliothekskultur auf 10 15-cm-LB-Ampicillin-Platten, wachsen 12 bis 18 h bei 37 ° C, und sammeln Sie Kolonien von jeder durch sanften Druck mit einem Glas Treuer in 7 ml LB.
    2. Bereiten Sie eine Glycerin-Stamm von 0,5 ml (0,2 ml sterilem Glycerin und Speicher hinzuzufügen bei -20 &# 730; C), und verwenden Sie die verbleibenden 6,5 ml, um DNA mit einem Standard-Vorbereitung im Handel erhältlichen DNA Miniprep Kit folgenden Herstellers.
  3. Linearisieren gepoolte Plasmid-DNA (1,0 bis 2,0 & mgr; g) mit geeigneten Restriktionsenzymverdau 16 bei 37 ° C für 1 - 1,5 Stunden. Isolieren Sie die linearisierte DNA mit Phenol / Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanolfällung und Resuspension in Wasser nach den Vorgaben der RNA-Polymerase-Kit verwendet wird. Synthetisieren Sinn-RNA mit einer RNA-Polymerase kommerziellen Kits nach Herstelleranweisungen.
  4. Vorbereitung Nadeln für die Mikroinjektion (Verwendung einer Nadel Abzieher mit Glaskapillarröhren) von etwa 20 um Durchmesser; messen Nadelspitzen auf einem zusammengesetzten Mikroskop mit einem kalibrierten Okularmikrometer. Hinweis: Nadelzieher Einstellungen müssen empirisch bestimmt, um eine Nadel mit einer feinen Spitze, so dass, wenn sie mit einer feinen Pinzette gebrochen ergibt die gewünschte Düsengröße zu erzeugen.
  5. Prepare (Push Ton ingleichmäßige Schicht auf der Unterseite der Schale) Lehm ausgekleideten 35 x 10 mm Petrischalen mit parallelen Rillen an Eizellen in während Mikroinjektion zu halten; produzieren Nuten mit einem Einkaufszentrum Sonde oder Pasteur-Pipette an der Spitze in Flammen fusioniert. Als Alternative zu Ton, vorzubereiten Agarose Gerichte machen Vertiefungen mit einem Elastomer Form 17. Übertragungs Oozyten mit weiter Bohrung Pipette bis 3% Ficoll in 1X MBS (ca. 2 ml) in Reihen in den Lehm ausgekleidet Gerichte.
  6. Verwendung Mikroinjektor, füllen Nadel mit 1 ng / nl RNA und stellen Balance leichten Überdruck zu erzeugen (Ausarbeitung Eizelle Zytoplasma zu verhindern).
  7. Injizieren Oozyten, die mit etwa 20 nl RNA in der Äquatorregion. Lassen Sie 1 Stunde für die injizierten Oozyten in Ficoll-MBS bleiben, dann übertragen Sie vorsichtig, um 1x MBS. Inkubation für 8 bis 24 Stunden bei 20 ° C vor der animal cap Assay.

3. Tier Cap Assay

  1. Bereiten Sie 3 / 4x NAM und erhalten feinen Pinzette, Haarschleife, gekrümmte Deckglas-Fragmente, Ton ausgekleideten dishes mit becherförmigen Vertiefungen, um Eizellen zu halten. Machen Sie gebogene Deckglas-Fragmente durch Auseinanderbrechen Deckgläser in kleine Fragmente (ungefähr 1-2 mm x 2 - 4 mm) und durch Flammen, bis Kanten polieren und hängen, wodurch ein Kurvenstück.
  2. Düngung X. laevis Eiern 18 durch in vitro oder natürliche Paarung und Kultur Stufen Gastrula (10 - 11 Stunden nach der Befruchtung bei RT) in 0,1 x MBS vor der Sortierung nach Stufe; Sammeln Mitte der Gastrula (Stufe 11 bis 11,5) 10 Embryonen.
  3. Transfer-Embryonen in eine Petrischale etwa zur Hälfte mit 3/4-fach NAM. Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, entfernen Fertilisation (Dotter) Membran von Gastrulen.
  4. Transfer Oozyten bis 3 / 4x NAM (etwa 2 ml) in Ton ausgekleideten Gerichte und unbeweglich in einzelnen Eindrücke im Ton, Erzeugung Eindrücke auf einzelne Embryonen unterzubringen als Nuten wurden oben beschrieben.
  5. Transfer-Embryonen, um den Ton ausgekleideten Gerichte und schneiden animal caps off gastrulae mit zwei Paaren von feinen Pinzette. Achten Sie darauf, Tierkappe Ektoderm nur und nicht die Äquatorial Gewebe 18 zu isolieren.
  6. Platzieren eines Tieres Kappe auf dem Tierhemisphäre jede Oozyte mit der Innenfläche des Tierkappe Kontaktieren der Eizelle. Halten Rekombinanten gemeinsam durch Anlegen gekrümmten Deckglas-Fragment und nach unten gedrückt, um das Glas, Abflachen des Ektoderms wie die Deckkontakte des Tons (animal caps kann mit der Innenschicht auf die Oberfläche der Eizelle für 6 ausgesetzt bleiben offen - 8 h oder länger ).
    Hinweis: Sie können auch den Tierkappe in einem Ton-Einzug mit seiner Innenfläche nach oben und legen Sie eine Eizelle an der Kappe; sichern die rekombinante mit kleinen Erweiterungen von Ton.
  7. Kultur bei 20 ° C, bis Steuer Embryonen reach gewünschte Bühne für Assay.
  8. Separate rekombinanten durch Entfernen Deckglas / Ton und Isolieren Ektoderm mit einer Pinzette und einer Haarschleife.
  9. Fix ektodermalen Fragmente für 1 Stunde in MEMFA (3,8%Formaldehyd in MEM [0,1 M MOPS, pH 7,4, 2 mM EGTA und 1 mM MgSO 4]).
  10. Transfer-Fragmente (und Kontrolle Embryonen) aus MEMFA zu Ethanol und bei -20 ˚C.

4. Analyse der Antwort in Ektoderm durch in situ Hybridisierung (ISH)

  1. Bereiten Sie Lösungen für die ISH.
    1. Vorbereitung 1x PBS: 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,138 M NaCl, pH 7,4
    2. Vorbereitung PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% Tween-20
    3. Vorbereitung 100x Denhart-Lösung: 2% BSA, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll
    4. Vorbereitung Hybridisierungspuffer: 50% Formamid, 5 × SSC, 1 mg / ml Hefe-RNA torula, 1 ug / ml Heparin, 1x Denhart-Lösung, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H 2 O
    5. Vorbereitung Maleinsäure-Puffer (MAB): 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5
    6. Bereiten MAB + Block: MAB, 2% Blockierungsreagenz (Wärme bis 60 ° C zu lösen)
    7. Vorbereitung alkalische Phosphatase (AP) Puffer: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O
  2. Bereiten Sie die RNA-Sonde.
    1. Unter Verwendung eines kommerziellen RNA-Polymerase-Kit und graben-NTP-Mix, fügen Sie in ein 1,5-ml-Röhrchen (50 & mgr; l-Reaktion): 25,5 & mgr; l DEPC-H 2 O, 10 ul 5X Transcription Buffer, 2,5 ul 10x dig-NTP-Mix, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul linearisierte DNA-Templat (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 90 min.
    2. In 2 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 60 min.
    3. Prüfen 2 ul Reaktions auf 1% Agarose-Gel.
    4. 1 ul RQ1 RNase-Free DNase und Inkubation 37 C für 20 min.
    5. Fällt die Sonde durch Zugabe von 50 & mgr; l DEPC-H 2 O, 25 ul 10 M Ammoniumacetat und 313 ul Ethanol. Lagerung bei -20 C über Nacht (O / N), dann erholen RNA durch Zentrifugation bei 13.800 × g für 20 min. Mit 500 ul 75% Ethanol waschen, kurz drehen, entfernenEthanol und ermöglichen Pellet an der Luft trocknen. In 50 ul DEPC-H 2 O.
    6. Hinzufügen Hybridisierungspuffer bis zu einer Endkonzentration von ~ 0,5 ug / ul.
  3. Bereiten Tissue für die Hybridisierung. Wenn nicht anders angegeben, füllen Fläschchen an die Spitze mit jeder Lösung Änderung beschrieben (ca. 4 ml).
    1. Entfernen von Ethanol aus Fläschchen und Transfer-Embryonen in 75% Ethanol / PTW, dann 50% Ethanol / PTW für jede 10 min, horizontal auf Wippe.
    2. Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min.
    3. Transfer zum 10 ug / ul Proteinase K-Behandlung in PTW; Rockröhren vertikal 15 min.
    4. Spülen Sie zweimal je 10 min in 0,1 M Triethanolamin pH-Wert 7,8 - Rockröhren vertikal.
    5. In 12,5 ul Essigsäureanhydrid, um Rohre und Rock vertikal 5 min. Wiederholen Sie mit zusätzlichen 12,5 ul Essigsäureanhydrid für 5 min.
    6. Waschen Sie in PTW 5 min vertikal auf Wippe.
    7. REFIX in 4% Paraformaldehyd 20 min auf Wippe. Wärmehybridisierungspufferbis 60 ° C.
    8. Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min.
    9. Entfernen Sie alle, aber ~ 1 ml PTW aus jedem Röhrchen und fügen Sie 250 ul Hyb-Puffer; leicht schwenken Rohre zu mischen. Rockröhren vertikal 5 min.
    10. Ersetzen Sie mit 60 ˚C Hyb-Puffer (0,5 ml) und leicht rühren bei 60 ° C 10 min. Ersetzen mit frischem Hyb Puffer und rühren bei 60 ° C zwei bis 4 Stunden.
    11. Wärmesonde (1 ml bei 0,5 ug / ul in Hyb-Puffer) bis 60 ° C (3 min). Entfernen Hyb Puffer und Sonde in Rohren. Leicht bewegen O / N bei 60 ° C.
  4. Bereiten Tissue für Antikörper.
    1. Warm Hyb Puffer und 2x SSC + 0,1% Tween-20-Lösungen bis 60 ° C.
    2. Ersetzen Sondenlösung mit Hyb Buffer (Speichern Sonden bei -20 ° C für 2 - 3x Wiederverwendung). Für 10 Minuten bei 60 ° C waschen.
    3. Dreimal bei 60 ° C in 2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen.
    4. Dreimal bei 60 ° C in 0,2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen.
    5. Zweimal für jeweils 15 min horizontal auf Wippe waschen in MAB (RT).
    6. 1 ml MAB + Block. Waschen Sie 2 Stunden vertikal auf Wippe.
    7. Transfer zum 1 ml MAB + Block mit einer 1 / 2.000 Anti-Digoxygenin-AP. Rock vertikal bei 4 CO / N.
  5. Bereiten Tissue für Farbreagenz.
    1. Ersetzen Antikörperlösung mit MAB; waschen dreimal MAB 5 min jeweils horizontal auf Wippe.
    2. Drei Mal in MAB 1 Stunde jeweils horizontal auf Wippe waschen.
    3. Zweimal in AP-Puffer jeweils 10 Minuten horizontal auf Wippe waschen.
    4. Bringen Gewebe Mehr auch Kunststoffwanne, entfernen AP-Puffer und fügen BM Lila Reagenz (~ 1 ml). Erlauben Reaktion auf in der Dunkelheit 5 Minuten bis O / N fortfahren.
    5. Wenn entsprechende Färbung erreicht ist, zu übertragen, um Gewebedurchstechflaschen mit PTW. Zwei Mal jeweils 10 Minuten auf Wippe waschen in PTW.
    6. Fix in Bouin-Lösung bei 4 CO / N auf Wippe.
    7. Waschen Sie Bouin-mit drei 70% Ethanol / 30% PTW Wäschen bei RT. Gehen to Aufnahme von Bildern mit Auflicht und ein Mikroskop montierten Kamera, Bleichen wenn nötig 18.

5. Sib Auswahl und Klonierung

  1. Wählen Sie Pool mit der höchsten Aktivität (größte Resonanz in ektodermalen Gewebe).
  2. Man titriert (verdünnte mit LB, geeignete Dichte) das Glycerin Lager für den Pool mit der höchsten Aktivität und Platte aus zehn neuen Platten mit etwa einem Zehntel der Kolonien aus dem vorherigen Schritt (unter Verwendung von Abschnitt 2 in Protokoll oben).
  3. Poolgröße zu reduzieren, bis Aktivität auf einzelne Kolonie zurückverfolgt.
  4. DNA-Sequenz zu erhalten, unter Verwendung von Standard-Primer im Vektor.

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Representative Results

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Als Reaktion auf die Expression von mRNA in Oozyten injiziert und reagiert animal cap-Gewebe wurde für die Expression von OTX2 durch in situ-Hybridisierung (Figur 2 und Tabelle 1) untersucht; OTX2 wird in der mutmaßlichen Linsen Ektoderm (PLE) aus Neuralrohrschlusses durch Linsenplakode exprimiert Verdickung 19. Da jedoch OTX2 ist auch in der vorderen neuronalen Ektoderm sowie nichtneuralen Kopf Ektoderm außerhalb des PLE ausgedrückt, er sowohl mit neuronalen und placodal Antworten assoziiert ist. Die Verwendung von foxe3 die Bibliothek für ein Genprodukt in der Lage, eine linsen induktive Verhalten der Linsenkompetenten Tierkappe Ektoderm erlaubt eine genauere Annäherung an das Ziel der Expressionsklonierung screenen, da foxe3 in der PLE aus neuralen Platte ausgedrückt Stadien und in der gesamten Linse Vesikelbildung 20, in benachbarten placodal Regionen vorhanden, aber abwesend neuroectoder Meter Verwendung der Expressionsklonierung und sib Selektionsprotokolls über und Injizieren Pools von Bibliothek-Transkripte wurde ein Gen, das zur Herstellung foxe3 Expression in den animal caps isoliert (Tabelle 2). Nach der Isolierung des Klons wurden 179 weitere Tierkappe Tests unter Verwendung von Eizellen mit Bibliothek Transkripte injiziert zur Expression foxe3 gesiebt; 50 waren positiv (28%). 140 animal cap Stücke auf nicht injizierte Oozyten platziert, 0 positiv waren (Abbildung 3).

Abbildung 1
Abbildung 1. Oocyte-Tier-Cap-Assay und Expressionsklonierung Schematische Übersicht des Protokolls:. Transkripte aus dem Klon-Bibliothek hergestellt und in Oozyten injiziert, ist Tierkappe Ektoderm mit Eizellen kultiviert und dann für die induzierte Genexpression durch in situ Hybridisierung untersucht. D / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Typische Ergebnisse von Tier Cap Assay folgenden mRNA Injection und in situ Hybridisierung für Otx2. (AB) Repräsentative Ergebnis induktive Reaktion auf Stufe 14 Poly (A) + RNA in animal caps dorsalisierte, für OTX2 Expression durch whole mount in situ untersucht Hybridisierung. (A) Tierschutzkappen auf nicht-injizierten Oozyten im Stadium 10,5 bis Bühne platziert und kultiviert 25. (B) Bühnen 10.5 Tierkappen auf Oozyten platziert mit 10 ng RNA injiziert und kultiviert, um Stufe 25 in 6/7 Fällen OTX2 Expression beobachtet und angezeigt durch Pfeilspitzen. Bar = 500 & mgr; m. "Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Typische Ergebnisse von Tier Cap Assay folgenden in-situ-Hybridisierung für Foxe3. (AC) Repräsentative animal caps von Oozyten-Tierkappe Assays, für die Expression von foxe3 in-situ-Hybridisierung getestet durch. (A) 11 bis 11,5 Bühnentierkappen auf LDB1 injizierten Oozyten zu Stufe 23. foxe3 Ausdruck gebracht und kultiviert wird durch Pfeilspitzen markiert. (B) 11 bis 11,5 Bühnentierkappen auf nicht-injizierten Oozyten und legte kultiviert zu Stufe 23; kein foxe3 Expression nachgewiesen. (C) Schnitt durch foxe3 -positiven induzierte Tierkappe von A, die die Expression in inneren und äußeren Schichten des Ektoderm. Balken = 500 & mgr; m.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

RNA injiziert Positive Fälle Gen %
Stufe 14 dorsalisierten mRNA, 10 ng 12/24 OTX2 50
Bibliothek Pools von 10 5 Klone, 20 ng 3/9 OTX2 33
Bibliothekspools von 10 5 bis 10 0 clon ES, 20 ng 50/179 foxe3 28
Keine 0/140 foxe3 0

Tabelle 1 Oocyte-Tier Cap Untersuchungsergebnisse Ergebnisse von Tierkappe Assay durch in situ Hybridisierung mit OTX2 und foxe3 beurteilt, mit Eizellen mit mRNA oder mit Abschriften von cDNA-Bibliothek Pools synthetisiert injiziert. oder nicht-injizierten Oozyten.

acht: 24px; "> Bibliothek Pools von 10 5 Klone, 20 ng ht: 21px; "> Bibliothek Pools von 400 Klonen, 20 ng height = "21" style = "height: 21px;"> Bibliothek Pools von 6-7 Kolonien, 20 ng 1px; ">
RNA injiziert Pool Benennung / Auswahl Positive foxe3 Ausdruck
EIN 2/4
B * 4/28
C 4/44
Bibliothek Pools von 10 4 Klone, 20 ng 1 0/11
2 0/10
3 3/14
4 0/12
5 0/15
6 1/20
7 3/23
8 0/16
9 0/16
10 * 5/20
Bibliothek Pools von 5.000 Klone, 20 ng 1 0/7
2 * 5/16
3 1/7
4 0/7
5 0/7
1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 0/10
5 * 8/26
6 0/11
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/8
Bibliothek Pools von 70-200 Kolonien, 20 ng 1 0/8
2 0/10
3* 1/10
4 * 1/10
5 0/10
6 0/9
7 0/10
8 0/10
Bibliothek Pools von 20 Kolonien, 20 ng 1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 * 7/21
5 0/10
6 0/10
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/10
K2-6, L1 0/10
L2-6, M7 0/10
M8-12, N7-8 0/10
K5-6, L1-4 1/10
L5-6, M7-10 0/10
M11-12, N7-8, K2-4 0/10
K2, K5, L2, L5, M8, M11 0/10
K3, K6, L3, L6, M9, M12 0/9
K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 1/9
Bibliothek RNAs, 20 ng K6 0/10
L1 * 3/10
L3 0/10
L4 0/10
Bibliothek RNA, 20 ng L1 (LDB1) Bestätigung 50/179
* Zeigt Ihnen ausgewählten Pool

Tabelle 2. Sib Auswahl und Expression Cloning Ergebnisse. Der Pool mit dem höchsten Niveau der Antwort in jedem Tier cap-Assay (zwischen 10% und 36% positiv für foxe3 Ausdruck) wurde für den Einsatz in den nächsten Versuch zu einem Klon gezieltere Aktivität ausgewählt. Sternchen zeigt ausgewählten Pool.

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Discussion

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Die für die funktionale Klonierung von Genen in der Lage, eine Antwort in kompetente Ektoderm Induzieren hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Genprodukten zu identifizieren. Diese Methode baut auf früheren Arbeiten durch die Kombination von Gewebe-induzierende Assays mit Ausdruck Klonierungstechniken. Wir nutzen die Stoffwechselwege des Xenopus-Oozyten als Quelle der Erzeugung von induzierende Faktoren, die direkt oder indirekt folgende RNA-Injektion. Dies in Kombination mit der Verwendung von etablierten Methoden für die Klonierung eines interessierenden Gens unter Verwendung von 6,7 Expression von Transkripten aus einer cDNA-Bibliothek oder einer anderen Kollektion von Klonen erzeugt werden, stellt ein wertvoller Ansatz für diejenigen, die Gene von Interesse an neuen embryonalen beteiligt sind Induktion. Die breite Anwendbarkeit dieser Methode, um funktionelle Identifizierung neuer Gene ist eine sinnvolle Ergänzung zu aufregenden neuen Reverse genetische Ansätze, und könnte auch verwendet werden, um identifiziert unter Verwendung von Hoch thr Test Transkripte funktional seinoughput Methoden (wie RNA-seq) 21.

Kontrollen sind kritisch für die Überwachung der Stoffwechselfunktion von Oozyten in der Kappe Assay verwendet. Sowohl für die Gesundheit der einzelnen Charge von Oozyten und die Nützlichkeit dieses Systems in Niedrigfluss-Transkripte nachzuweisen herzustellen gewährleisten, variierenden Konzentrationen von mRNA des Mesoderms Induktor INHBB wurden getestet; Dieses Gen ist nicht mit dem Objektiv-Induktionspfad und ist ein gut dokumentiertes unabhängige Steuerung 14. Muskel-induzierende Aktivität, durch die Expression von Muskel-spezifischen Antigenen in animal cap Ektoderm mit der 12/101-Antikörper untersucht wird, wurde mit 2 beobachtet - 200 pg INHBB mRNA, sogar in Gegenwart von 500-fachem Überschuß Stufe 14 Poly (A) + RNA. Das System ist somit in einem sehr weiten Bereich der injizierten RNA-Menge nützlich, und Oozyten in der Lage, stabil zu Protein zu produzieren und lebensfähig bleiben folgenden zytoplasmatische Injektion von Volumina von 50 nl und höher.

Eine Überlegung zur use einer cDNA-Bibliothek in diesem Protokoll ist die Notwendigkeit, in voller Länge oder nahezu Volllängen-Klone. Vor der Verwendung in dem Protokoll zu verwenden, sollte die Bibliothek durch Northern-Analyse untersucht, um die Größe der bekannten Transkripte in der Bibliothek zu bestimmen und somit die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass dominant-negative Wirkung von potentiell abgeschnitten injiziert Transkripte erhalten werden. Da eine vollständige cDNA-Pool ist wichtig, die Verwendung von EST-Klone 22 oder optimal, das Xenopus ORFeome 23 (die einen vollständigen Satz von validierten Klone voller Länge enthält) zu einem traditionellen cDNA-Bibliothek bevorzugt, es sei denn ein Bühnen- und Gewebe- spezifische Quelle der cDNA gesucht und für die Bibliothekskonstruktion verwendet. Eine weitere Überlegung ist die Anwesenheit von β-Globin und Poly (A) Sequenzen in der Bibliothek Vektor soll die Stabilität der mRNA in spritzt Transkripte zu erhöhen. Dies ist zwar wünschenswert, die Menge des Proteins von spritzte Kunst mRNA hergestellt wächst, gibt es auch die Mögkeit zur Herstellung einer dominant-negativen Effekt von mRNA, die Stabilität und Aktivität höher als in vivo ist. Ein Low-Kopienzahl mRNA möglicherweise nicht die gleichen Wirkungen wie ihre endogenen Gegenstück im Hintergrund aus einem großen Pool von Transkripten auszuüben; eine, die bei der Klonierung und Transkriptionsprozess stabilisiert wird fortbestehen, um den Nachweis in der Kappe Assay zu ermöglichen. Ein drittes Problem ist Pool-Größe; erhebliche Reduzierung der Pool-Größe (10 Klone oder weniger) hat sich gezeigt, als vorteilhaft, in den letzten gain-of-function-Screening-Projekte in Embryonen 24 und wird wahrscheinlich klarer Ergebnisse und leichtere Identifizierung von Kandidatengenen bereitzustellen. Eine kleinere Poolgröße als die 10 3 - 10 4 in diesem Protokoll empfohlen ist erreichbar, wenn die Gesamtkomplexität der Sammlung von Klonen, die weniger als 10 4 ist, wie es der Fall mit dem ORFeome 23; man die ~ 9.000 Klone zu screenen konnte beginnend mit 10 Pools von 900, obwohl es unerschwinglich arbeitsintensiv zu seinProzess 10 Pools in einem Experiment.

Bestimmung der Art von Genprodukt (durch Sequenzanalyse) durch das in dem Bildschirm identifizierte Gen hergestellt bestimmt die Art von Tests auf seine Funktion. Da ein Kerntranskriptions Cofaktor im Bildschirm 8 identifiziert, war es notwendig, die Rolle des Kerns in dem induktiven Prozess durch Einführung LDB1 ausgelöst bestätigen. Entkernte Eizellen haben voll funktionsfähige Proteinsynthesemaschinerie und sind lebensfähig und in der Lage, sezerniert Faktoren ab injiziert Transkripte. Jedoch kann das Fehlen des Kerns wird das Funktionieren von Transkriptionsfaktoren, Kofaktoren oder anderen indirekt wirkende Genprodukte abzuschaffen. Nachfolgende Analysen von Genen, die auf dem Bildschirm identifiziert wurden, gehören die Bestimmung der Entwicklungsexpressionsmuster durch in situ Hybridisierung und gewinnen-of-function und Verlust der Funktionstests. Expression durch Injektion von RNA in Zygoten oder durch Begrenzung Injektion von SPecific Blastomeren, um ihre Auswirkungen auf bestimmte Regionen des Embryos zu beschränken können Erkenntnisse sowie Zuschlags der Genfunktion durch Injektion von Morpholino-Oligonukleotide gegen die in vivo-Transkript gerichtet ist.

Direkte Visualisierung eines induktiven Effekt im antwort animal cap Ektoderm Verwendung einer transgenen Linie mit einem Reportergen (beispielsweise GFP) kann das Screening-Verfahren erheblich beschleunigt und die Notwendigkeit für die Analyse der RNA-Expression durch in situ-Hybridisierung. Ebenso ist der Einsatz von Antikörpern als schneller mittels Sieben wünschenswert, wenn ein geeigneter Antikörper (wie zB die für die Reaktion des Muskels 12/101 oben diskutiert) ist verfügbar. Albino Embryonen können für die animal caps, die zwar schwieriger genau an Gastrula Stufen Bühne, Straffung der in situ Hybridisierungsverfahren, indem die Notwendigkeit für irgendeine Bleiche von Wildtyp-Pigmentierung der Farbreaktion prod besseren Visualisierungdukt.

Schließlich ist es wichtig zu berücksichtigen, daß aus verschiedenen Gründen, muss eine große Anzahl von Studien durchgeführt werden, um ein gegebenes Gen zu identifizieren. Zum einen die Zahl der Fälle kann man vernünftigerweise Prozess in einem bestimmten Prozeß wird durch die Entwicklung (und eventuelle Kompetenzverlust), die im Laufe der Zeit tritt auch eine große Charge von Embryonen und ein Bereich von Temperaturen, bei denen die Kultur ihnen gegeben beschränkt, sowie den Verlust, die der kleine Stücke von Ektoderm in der Verarbeitung auftreten können. Zum anderen kann die Erfolgsraten der Expression eines ausgewählten Marker im Ektoderm sehr gering sein und erfordern vielen Fällen eine statistisch signifikante Wirkung zu beobachten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12/101 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 12/101 Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer Sigma S6639 for ISH
Acetic anhydride Sigma A6404 for ISH
Anti-Dig-AP Roche 11093274910 for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit Bio-Rad 732-6400 Plasmid DNA purification
Blocking Reagent Roche 11096176001 for ISH
BM Purple Roche 11442074001 for ISH
Boekel Hybridization Oven Fisher Scientific 13-245-121 for ISH
Bouin's Solution Sigma HT10132 for ISH
BSA Sigma A9647 for OCM
CHAPS Sigma C3023 for ISH
Collagenase A Roche 10103578001 Defolliculation of oocytes
Cysteine Sigma C121800 Dejelly embryos
DEPC-H2O Fisher Scientific BP5611 for ISH
Dig-RNA Labeling Mix Roche 11277073910 for ISH probes
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 500233 for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate Sigma A5040 MS222 anesthetic
Ficoll PM 400 Sigma F4375 for Injection media
Formamide Sigma F9037 for ISH
Gentamicin sulfate Sigma G1914 for OCM
Glass capillaries World Precision Instruments 4878 3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials Fisher Scientific 06-408B for ISH
Hair loop Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt Sigma H4784 for ISH
Injector Nanoliter 2010 World Precision Instruments Nanoliter 2010 Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean Carolina 972433 Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA Source Bioscience 989_IRBG cDNA library 
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin Teknova L5004 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth Teknova L8650 LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit New England BioLabs S1550S for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid Sigma M0375 for ISH
Manual Microfil Micromanipulator World Precision Instruments M3310R Manual micromanipulator
Nutating Mixer Fisher Scientific 22-363-152 Rocker for ISH
Permoplast Nasco SB33495M Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline Sigma P5368 for ISH
PMSG Sigma G4877 to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone Sigma PVP40 for ISH
Programmable Puller World Precision Instruments PUL-1000 Micropipette needle puller
Proteinase K Sigma P6556 for ISH
pTnT Vector Promega L5610 cDNA library construction
Riboprobe Combination System Promega P1450 in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit Life Technologies 18248013 kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk Fisher Scientific 19-037-516 Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA Sigma R3629 for ISH
Triethanolamine Sigma T1502 for ISH
Tween 20 Sigma P9416 for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System Promega C4360 alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration Source Bioscience 5055_XenORFeome ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells Agilent Technologies 200150 cells for transformation of cDNA library

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References

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Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System
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Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).More

Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).

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