Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla University of Virginia Istituzionale Animal Care and Use Committee.
Nota: la figura 1 mostra una panoramica schematica delle procedure sperimentali.
1. Preparazione di ovociti
- Pre-prime X. laevis femmine con 150 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) circa una settimana di anticipo di isolamento degli ovociti. Iniettare 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale linfa sac con 1 cc siringa sterile con 29 ago G.
- Preparare le soluzioni per l'iniezione degli ovociti e degli ovociti animale cap test.
- Preparare Ca ++ / Mg ++-free OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mm Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2.
- Preparare OR2: OR2- più 1 mM CaCl 2 e 1 mm MgCl 2.
- Preparare OCM: il 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml di BSA, 100 mg / ml Gentamicina, pH 7,8.
- Prepare MBS 1x: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mm CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 NaHCO mm 3.
- Preparare 3% Ficoll in 1x MBS.
- Preparare NAM 1x: 110 mM NaCl, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7.4.
- Anestetizzare la femmina in una soluzione 0,03% di Ethyl sale metansolfonato 3-amminobenzoato (MS222) in 0.1x MBS (prima sciogliere 0,3 g MS222 in 10 ml di etanolo 95%, poi diluite in 1 L 0.1x MBS) ponendo rana in soluzione per 10-15 minuti o fino a quando non risponde.
- Verificare che l'anestesia è completa ruotando rana anestetizzato sulla schiena per assicurarsi che non risponde (non completamente rane anestetizzati muovere gli arti o girare corpo sopra).
- Chirurgicamente isolare frammenti ovarici facendo un'incisione addominale attraverso la pelle e la parete del corpo con bisturi, isolando tessuto ovarico con una pinzae forbici. Mettere i frammenti ovarici in OR2-. Chiudere la parete del corpo con una sutura di seta 3-0 su un ago curvo 24 mm e chiudere la pelle separatamente con gli stessi punti di sutura. Permettere il recupero della femmina in 1 g / L salata serbatoio in acqua.
- Utilizzando una pinza sottile, il tessuto ovarico lacrima in piccole (10 - 20 ovociti) pezzi e trasferimento OR2- fresco.
- Frammenti ovarici Defolliculate a 2,0 mg / ml di collagenasi A OR2- agitando delicatamente su agitatore per 1 ora, il trasferimento di collagenasi fresco e agitazione per un'ora supplementare.
- Lavare ovociti 10 volte in OR2 [contenenti Ca ++ / Mg ++], scartando ovociti più piccoli.
- Lavare gli ovociti in OCM due volte e trasferimento a fresco OCM. Isolare ovociti Fase VI per dimensione su ispezione visiva e scartare immaturi (più piccoli) ovociti: ovociti Fase VI sono più grandi di ovociti immaturi anche con pigmentazione nell'emisfero animale e sono circa 1,2-1,4 mm di diametro.
- Mantenere ovociti a 18 - 20 ° C in OCM prima dell'iniezione. Nota: capsule di Petri Agarosio-rivestiti possono essere utilizzati per ridurre al minimo incollaggio di ovociti a servire.
2. Iniezione di Biblioteca Trascrizioni
- Preparare una libreria di cDNA direzionale 15 utilizzando RNA estratto in una fase adeguato di sviluppo (per esempio, lo stadio piastra neurale 14 10). Acquistare una libreria di cDNA o costruirne uno utilizzando un kit commerciale per la panoramica nelle quattro fasi che seguono.
- Isolare circa 5 mg di mRNA utilizzando un prodotto per arricchire di poli (A) + RNA (vedi Tabella dei Materiali) e seguendo le istruzioni del produttore. Nota: Le trascrizioni da utilizzare per produrre la libreria di cDNA può essere limitata ad un tessuto induzione (come la piastra neurale, dopo microdissezione del tessuto desiderato), o possono essere da embrioni interi in una fase particolare.
- Produrre cDNA con un kit commerciale, seguendo le indicazioni del produttore.
- Legare circa 20 ng cDNA in un vectoR incluso con il kit commerciale o di un altro vettore adatto. Un appropriato vettore plasmidico comprende sequenze di mRNA stabilità come 5 'β-globina e 3 poly (A) + sequenze (pCS2, pTnT, pCS105).
- Trasforma legatura in cellule batteriche competenti mediante protocollo raccomandato del fornitore per la trasformazione shock termico.
Nota: In alternativa, una raccolta di cornice di lettura aperta (ORFeome) cloni è disponibile in commercio e può essere utilizzato per generare trascrizioni per iniezione.
- Preparare 10 piscine di plasmidi di 10 3 al 10 4 complessità (10 4 al 10 5 complessità totale). Questo rappresenta 10 tavole con 1.000 - 10.000 colonie ciascuno.
- Biblioteca piastra di coltura su 10 piatti da 15 cm LB-ampicillina, crescere 12-18 ore a 37 ° C, e raccogliere le colonie da ogni da una leggera pressione con una spatola di vetro a 7 ml LB.
- Preparare un stock di glicerolo da 0,5 ml (aggiungere 0,2 ml glicerolo sterile e conservare a -20 &# 730; C), e utilizzare i restanti 6,5 ml per preparare il DNA con uno standard disponibile in commercio kit miniprep DNA seguendo le indicazioni del produttore.
- Linearizzare pool DNA plasmide (1,0-2,0 mg) con adeguate enzima di restrizione digerire 16 a 37 ° C: 1 - 1,5 ore. Isolare il DNA linearizzato con estrazione con fenolo / cloroformio seguita dalla precipitazione con etanolo e risospensione in acqua secondo le specifiche del kit RNA polimerasi utilizzata. Sintetizzare RNA con un kit RNA polimerasi commerciale seguendo le indicazioni del produttore.
- Preparare aghi per microiniezione (usando un estrattore ago con tubi capillari di vetro) di circa 20 micron di diametro; misurare punte degli aghi su un microscopio composto con un micrometro oculare calibrata. Nota: le impostazioni estrattore ago deve essere empiricamente determinato a produrre un ago con punta fine in modo tale che in caso di rottura con una pinza sottile produce il formato di punta desiderata.
- Preparare (spingere argilla instrato uniforme sul fondo del piatto) argilla alberati 35 x 10 mm piatti di Petri con scanalature parallele di tenere ovociti in atto durante la microiniezione; produrre scanalature con una sonda centro commerciale o pipetta Pasteur fuso alla punta di fiamma. In alternativa argilla, preparare piatti agarosio rendendo rientranze con uno stampo elastomero 17. Ovociti di trasferimento con una pipetta ampio tunnel al 3% Ficoll a 1X MBS (circa 2 ml) in file nei piatti di creta-allineati.
- Utilizzando microinjector, riempire ago con 1 ng / RNA nl e regolare l'equilibrio di produrre una leggera pressione positiva (per evitare stesura di ovociti citoplasma).
- Iniettare ovociti con circa 20 RNA nl nella regione equatoriale. Lasciare 1 ora per ovociti iniettati di rimanere in Ficoll-MBS, quindi trasferire delicatamente per 1x MBS. Incubare per 8-24 ore a 20 ° C prima dell'analisi protezione animale.
3. Animal Cap Assay
- Preparare 3 / 4x NAM e ottenere una pinza sottile, ciclo dei capelli, frammenti coprioggetto curve, dis argilla alberatihes con rientranze a forma di coppa per tenere ovociti. Fai frammenti coprioggetto curve da sbriciolarsi vetrini in piccoli frammenti (circa 1-2 mm x 2-4 mm) e passando attraverso la fiamma fino a quando i bordi polacco e languore, la produzione di un pezzo curvo.
- Fertilizzare X. laevis uova 18 attraverso in vitro o l'accoppiamento naturale e la cultura di gastrula fasi (10 - 11 ore dopo la fecondazione a RT) a 0.1x MBS prima l'ordinamento per fase; raccogliere metà gastrula (fase 11-11,5) 10 embrioni.
- Trasferimento degli embrioni a una capsula di Petri circa mezzo pieno con 3 / 4x NAM. Utilizzando due coppie di una pinza sottile, rimuovere la fecondazione (vitellina) membrana dal gastrulae.
- Trasferimento ovociti a 3 / 4x NAM (circa 2 ml) in piatti di terracotta alberati e immobilizzare in singole impressioni in argilla, producendo impressioni per accogliere singoli embrioni solchi sono stati descritti sopra.
- Trasferimento degli embrioni ai piatti d'argilla alberati e tagliato le protezioni animali fuori gastrulae utilizzando due coppie di pinza sottile. Fare attenzione a isolare animale tappo ectoderma e non tessuti equatoriali 18.
- Inserire un tappo animale nell'emisfero animali di ciascun ovocita con la superficie interna del tappo animale contattando l'ovocita. Tenere ricombinanti insieme applicando frammento coprioggetto vetro curvo e applicando pressione verso il basso sul vetro, appiattimento ectoderma come i contatti coprioggetto l'argilla (tappi animale può rimanere aperto con lo strato interno esposta alla superficie del ovocita per 6 - 8 ore o più ).
Nota: In alternativa, inserire la protezione animale in una rientranza di argilla con la sua superficie interna rivolta verso l'alto e inserire un ovocita sul tappo; fissare il ricombinante con piccole estensioni di argilla. - Cultura a 20 ° C fino a quando gli embrioni di controllo portata desiderata palco per il dosaggio.
- Ricombinante separata rimuovendo vetrino / argilla ed isolando ectoderma con una pinza e un ciclo di capelli.
- Fissare frammenti ectodermica per 1 ora a MEMFA (3,8%formaldeide in MEM [0,1 M pH 7,4 MOPS, 2 mM EGTA, e 1 mM MgSO 4]).
- Frammenti di trasferimento (ed embrioni di controllo) da MEMFA in etanolo e conservare a -20 ° C.
4. Analisi di risposta in Ectoderma l'ibridazione in situ (ISH)
- Preparare soluzioni per ISH.
- Preparare 1x PBS: 0,01 M tampone fosfato, NaCl 0,138 M, pH 7,4
- Preparare PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% di Tween-20
- Preparare la soluzione di 100x Denhart: 2% di BSA, 2% Polivinilpirrolidone, 2% Ficoll
- Preparare Hybridization Buffer: 50% formammide, 5x SSC, 1 mg / ml torula RNA, 1 mg / ml di eparina, soluzione 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0,1% CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H 2 O
- Preparare maleico Acid Buffer (MAB): 100 mM acido maleico, NaCl 150 mM, pH 7,5
- Preparare MAB + blocco: MAB, 2% reagente bloccante (calore a 60 ° C per sciogliere)
- Preparare della fosfatasi alcalina (AP) Buffer: Tris mm 100pH 9.5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O
- Preparare la sonda RNA.
- Utilizzando un kit di RNA polimerasi commerciale e scavare-NTP mix, aggiungere in una provetta da 1,5 ml (50 reazione microlitri): 25,5 ml DEPC-H 2 O, 10 microlitri 5X Transcription Buffer, 2,5 microlitri 10x scavo-NTP mix, 5 ml 100 mM DTT, 2 microlitri RNasin, 2 ml DNA stampo linearizzato (~ 1 mg / mL), 3 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 90 min.
- Aggiungere 2 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 60 min.
- Controllare 2 ml di reazione su 1% gel.
- Aggiungere 1 ml RQ1 RNase-Free DNase e incubare 37 ° C per 20 minuti.
- Precipitare il probe aggiungendo 50 microlitri DEPC-H 2 O, 25 microlitri 10 M ammonio acetato e 313 ml di etanolo. Conservare a -20 ° C durante la notte (O / N) poi recuperare RNA per centrifugazione a 13.800 xg per 20 min. Lavare con 500 ml 75% di etanolo, girare brevemente, rimuovereetanolo e lasciare asciugare all'aria pellet. Aggiungere 50 ml DEPC-H 2 O.
- Aggiungi Tampone di ibridazione a una concentrazione finale di ~ 0.5 mg / mL.
- Preparare dei tessuti per l'ibridazione. Se non diversamente specificato, riempire fiale in cima ad ogni cambio di soluzioni descritte (circa 4 ml).
- Rimuovere l'etanolo da fiale e trasferimento di embrioni in 75% di etanolo / PTW, quindi il 50% di etanolo / PTW per 10 minuti ciascuna, orizzontalmente sulla sedia a dondolo.
- Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo.
- Trasferimento a 10 mg / mL trattamento Proteinase K in PTW; Tubi di roccia verticale 15 min.
- Sciacquare due volte 10 minuti ciascuno a 0,1 M Triethanolamine pH 7,8 - tubi di roccia verticale.
- Aggiungere 12,5 ml di anidride acetica ai tubi e roccia verticale 5 min. Ripetere con l'aggiunta di 12,5 ml di anidride acetica per 5 min.
- Lavare in PTW 5 minuti verticalmente sulla sedia a dondolo.
- REFIX in 4% paraformaldeide 20 min a bilanciere. Calore Tampone di Ibridazionea 60 ° C.
- Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo.
- Rimuovere tutti ma ~ 1 ml di PTW da ciascuna provetta e aggiungere 250 microlitri Hyb Buffer; agitare delicatamente i tubi per mescolare. Tubi di roccia verticale 5 min.
- Sostituire con 60 ° C Hyb Buffer (0,5 ml) e agitare delicatamente a 60 ° C 10 min. Sostituire con fresco Hyb tampone e agitare a 60 ° C per 4 ore due.
- Sonda termica (1 ml a 0,5 mg / mL in Hyb tampone) a 60 ° C (3 min). Rimuovere Hyb Buffer e aggiungere la sonda ai tubi. Agitare delicatamente O / N a 60 ° C.
- Preparare dei tessuti per l'anticorpo.
- Caldo Hyb Buffer e 2x SSC + 0,1% Tween-20 soluzioni a 60 ° C.
- Sostituire soluzione della sonda con Hyb Buffer (salvare le sonde a -20 C per 2 - 3x riutilizzo). Lavare a 60 ° C per 10 min.
- Lavare tre volte a 60 ° C in 2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione).
- Lavare tre volte a 60 ° C a 0.2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione).
- Lavare due volte in MAB (RT) per 15 min per riga sull'attuatore.
- Aggiungere 1 ml MAB + blocco. Lavare 2 ore in verticale sulla sedia a dondolo.
- Trasferimento a 1 ml MAB + blocco contenente un anti-digossigenina-AP 1 / 2.000. Roccia verticale a 4 Co / N.
- Preparare dei tessuti per reagente colore.
- Sostituire soluzione di anticorpi con MAB; lavare tre volte in MAB 5 min per riga sull'attuatore.
- Lavare tre volte in MAB 1 ora ciascuno orizzontalmente sull'attuatore.
- Lavare due volte in AP Buffer 10 minuti ogni orizzontalmente sulla sedia a dondolo.
- Trasferimento tessuto multi-pozzo vassoio di plastica, rimuovere AP tampone e aggiungere BM viola reagente (~ 1 ml). Lasciare reazione di procedere nel buio 5 minuti a O / N.
- Al raggiungimento del caso colorazione, trasferire il tessuto di fiale di PTW. Lavare due volte 10 min ciascuno in PTW sulla sedia a dondolo.
- Fissare in soluzione di Bouin a 4 CO / N sulla sedia a dondolo.
- Lavare Bouin con tre il 70% di etanolo / 30% lavaggi PTW a temperatura ambiente. Procedere to l'acquisizione di immagini con epi-illuminazione e una videocamera a microscopio, candeggio, se necessario 18.
5. Sib Selezione e clonazione
- Selezionare piscina con la più alta attività (grande risposta nel tessuto ectodermica).
- Titolare (diluire con LB alla densità del caso) la stock di glicerolo per la piscina con la più alta attività e piastra fuori dieci nuovi piatti con circa un decimo delle colonie dal passo precedente (utilizzando la sezione 2 del protocollo sopra).
- Ridurre le dimensioni della piscina fino a quando l'attività viene fatta risalire ad un'unica colonia.
- Ottenere sequenza di DNA con primer standard, nel vettore.
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Representative Results
In risposta alla espressione di mRNA iniettato in oociti, rispondendo tessuto protezione animale è stato analizzato per l'espressione di Otx2 mediante ibridazione in situ (Figura 2 e Tabella 1); Otx2 si esprime nella ectoderma lente presuntivo (PLE) da chiusura del tubo neurale attraverso la lente placode ispessimento 19. Tuttavia, poiché Otx2 si esprime anche nella ectoderma neurale anteriore, così come non-neurale ectoderma testa fuori della PLE, è associato sia con neurale e risposte placodal. L'uso di foxe3 allo schermo la libreria per un prodotto del gene in grado di produrre una risposta lenti induttivo lente competente protezione animale ectoderma consentito un approccio più specifico per l'obiettivo della clonazione espressione, dal momento che foxe3 si esprime nella PLE da placca neurale tappe e in tutta lente vescicola formazione 20, presenti nelle regioni limitrofe placodal ma assenti da neuroectoder m. Usando l'espressione e clonazione protocollo selezione sib sopra e iniettando piscine di trascritti di libreria, un gene capace di produrre espressione foxe3 nelle calotte animali è stato isolato (Tabella 2). Dopo aver isolato il clone, 179 ulteriori saggi protezione animale utilizzando ovociti iniettati con trascrizioni di libreria sono stati sottoposti a screening per l'espressione di foxe3; 50 erano positivi (28%). Di 140 pezzi protezione animale immessi sul ovociti uninjected, 0 sono risultati positivi (Figura 3).
Figura 1. ovociti-animale Cap saggio ed Expression Clonazione Schema del protocollo:. Trascrizioni sono preparati dalla libreria clone e iniettato in oociti, protezione animale ectoderma è colta con ovociti e poi analizzati per l'espressione genica indotta da ibridazione in situ. d / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. risultati tipici di Animal Cap Assay seguenti mRNA iniezione e ibridazione in situ per Otx2. (AB) risultato Rappresentante di risposta induttiva a dorsalized fase 14 poli (A) + RNA in capsule animali, effettuati per Otx2 espressione da montare tutto in situ ibridazione. (A) le protezioni animali immessi sul ovociti uninjected in fase 10.5 e coltivate per fase 25. (B) Fase 10.5 protezioni animali immessi sul ovociti iniettati con 10 ng RNA e colto allo stadio 25. Otx2 espressione osservata in 6/7 dei casi e indicato da punte di freccia. Bar = 500 micron. "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. risultati tipici di Animal Cap Assay seguente In situ Ibridazione per Foxe3. (AC) tappi di animali rappresentativi di saggi cap ovocita animale, testati per l'espressione di foxe3 mediante ibridazione in situ. (A) Fase 11-11.5 tappi animali immessi sul ovociti ldb1-iniettato e coltivate per fase 23. foxe3 espressione è indicato da frecce. (B) Fase 11-11.5 tappi animali immessi sul ovociti uninjected e colta di mettere in scena 23; nessuna espressione foxe3 rilevato. (C) Sezione di foxe3 -positivo indotto protezione animale da A mostrando espressione in strati interni ed esterni di ectoderma. Bar = 500 micron.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| RNA iniettato | I casi positivi | Gene | % |
| Tappa 14 mRNA dorsalized, 10 ng | 12/24 | Otx2 | 50 |
| Piscine Biblioteca di 10 cloni 5, 20 ng | 3/9 | Otx2 | 33 |
| Piscine Biblioteca di 5-10 Ottobre 0 clon es, 20 ng | 50/179 | foxe3 | 28 |
| Nessuna | 0/140 | foxe3 | 0 |
Tabella 1. ovociti-animale Cap Assay Risultati Risultati del test protezione animale valutati mediante ibridazione in situ con Otx2 e foxe3, utilizzando ovociti iniettati con mRNA o con trascrizioni sintetizzati dal pool cDNA library.; o ovociti uninjected.
| RNA iniettato | Designazione Pool / selezione | Espressione foxe3 positivo |
| UN | 2/4 | |
| B * | 4/28 | |
| C | 4/44 | |
| Piscine Biblioteca di 10 4 cloni, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| Piscine Biblioteca di 5.000 cloni, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| Piscine Biblioteca di 70-200 colonie, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| Piscine Biblioteca di 20 colonie, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| RNA Biblioteca, 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| RNA Biblioteca, 20 ng | L1 (ldb1) conferma | 50/179 |
| * Indica pool selezionato |
Tabella 2. Sib Selezione e Exprefissione Clonazione Risultati. La piscina con il più alto livello di risposta in ogni analisi protezione animale (che varia tra il 10% e il 36% positivo per l'espressione foxe3) è stato selezionato per l'uso nel prossimo esperimento di restringere l'attività di un clone. L'asterisco indica pool selezionato.
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Discussion
Il metodo descritto qui per il clonaggio funzionale di geni capaci di indurre una risposta in ectoderma competente può essere utilizzato per identificare una vasta gamma di prodotti genici. Questo metodo si espande sul lavoro passato, combinando analisi dei tessuti che inducono con tecniche di clonazione espressione. Utilizziamo le vie metaboliche della oocita Xenopus come fonte di produzione di indurre fattori, direttamente o indirettamente, dopo l'iniezione di RNA. Questo, in combinazione con l'uso di metodi stabiliti per la clonazione di un gene di interesse 6,7 utilizzando l'espressione dei trascritti generati da una libreria di cDNA o altra raccolta di cloni, fornisce un valido approccio per coloro che cercano di identificare i geni di nuovo interesse coinvolti in embrionali induzione. L'ampia applicabilità di questo metodo per l'identificazione di nuovi geni funzionale è un utile complemento nuovi giochi approcci genetici inversa, e potrebbe anche essere utilizzato per funzionalmente trascritti prova identificate utilizzando high-throughput metodi (come RNA-seq) 21.
I controlli sono critici nel controllo della funzione metabolica di ovociti utilizzati nel saggio tappo. Sia per garantire la salute di ogni lotto di ovociti e di stabilire l'utilità di questo sistema per rilevare trascritti bassa abbondanza, concentrazioni variabili di mRNA del induttore mesoderma INHBB sono stati testati; questo gene è correlato al percorso lente induzione ed è ben documentato controllo indipendente 14. Muscle-attività induttiva, dosati con l'espressione di antigeni muscolo-specifici in protezione animale ectoderma con l'anticorpo 12/101, è stato osservato con 2 - 200 pg INHBB mRNA, anche in presenza di 500 volte superiore stadio 14 poli (A) + RNA. Il sistema è quindi utile su una gamma molto ampia di RNA quantità iniettata, e gli ovociti sono in grado di produrre stabilmente proteine e rimanere vitali dopo iniezione citoplasmatica di volumi di 50 nl e superiori.
Una considerazione per l'use di una libreria di cDNA in questo protocollo è la necessità di full-length o quasi cloni full-length. Prima dell'uso nel protocollo, la biblioteca dovrebbe essere esaminata da analisi Northern per determinare la dimensione di trascritti noti nella libreria e quindi ridurre la possibilità che gli effetti dominanti negativi sono ottenuti da trascrizioni iniettati potenzialmente troncati. Poiché una piscina full-length cDNA è importante, l'uso di cloni EST 22 o in modo ottimale, il Xenopus ORFeome 23 (che fornisce una serie completa di convalidati cloni integrali) sono da preferire per una libreria di cDNA tradizionale salvo scena- e tessutale specifica fonte di cDNA sono ricercati e utilizzati per la costruzione della libreria. Un'altra considerazione è la presenza di sequenze nel vettore libreria destinato ad aumentare la stabilità mRNA trascritti in iniettati β-globina e poli (A). Mentre questo è desiderabile aumentare la quantità di proteina prodotta da iniettare mRNA sintetico, solleva anche la possibillità di produrre un effetto dominante negativo da mRNA che è superiore in termini di stabilità e di attività in vivo. Un numero basso copia mRNA non può esercitare gli stessi effetti di sua controparte endogena sullo sfondo di una grande piscina di trascrizioni; uno che è stabilizzato nel processo di clonazione e trascrizione può persistere per consentire il rilevamento nel dosaggio tappo. Una terza questione è la dimensione della piscina; notevole riduzione delle dimensioni della piscina (10 cloni o meno) è stato dimostrato di essere vantaggiosa in recenti progetti guadagno-di-funzione di screening in embrioni di 24 ed è probabile che fornire risultati più chiari e più facile l'identificazione di geni candidati. Una dimensione più piccola della piscina 10 3 - 10 4 raccomandato in questo protocollo è realizzabile se la complessità totale della raccolta di cloni è inferiore a 10 4, come è il caso con il ORFeome 23; si potrebbe schermo del ~ 9.000 cloni che inizia con 10 piscine di 900, anche se può essere proibitivo per intensità di lavoroelaborare più di 10 piscine in un esperimento.
Determinazione del tipo di prodotto genico (mediante analisi di sequenza) realizzato dal gene identificato nella schermata determina la natura delle prove della sua funzione. Poiché un cofattore trascrizionale nucleare è stato identificato nel nostro schermo 8, è stato necessario confermare il ruolo del nucleo nel processo induttivo innescato dall'introduzione di ldb1. Ovociti enucleati hanno proteina pienamente funzionante macchinari sintetico e sono vitali e capaci di produrre fattori secreti dalle trascrizioni iniettati. Tuttavia, l'assenza del nucleo abolisce funzionamento di fattori di trascrizione, cofattori, o altri prodotti genici indirettamente ad azione. Le successive analisi di geni identificati nella schermata includono la determinazione di sviluppo pattern di espressione per ibridazione in situ e guadagno di funzione e la perdita di funzione test. Sovraespressione mediante iniezione di RNA in zigoti o limitando iniezione SPblastomeri ecific per limitare i suoi effetti a particolari regioni del embrione in grado di fornire approfondimenti, così come atterramento della funzione genica mediante iniezione di oligonucleotidi morfolino diretti contro la trascrizione in vivo.
Visualizzazione diretta di un effetto induttivo nel rispondere protezione animale ectoderma utilizzando una linea transgenica con un gene reporter (ad esempio GFP) può accelerare notevolmente il processo di screening e di eliminare la necessità per l'analisi dell'espressione di RNA mediante ibridazione in situ. Analogamente, l'uso di anticorpi come mezzi rapidi di screening è desiderabile se un anticorpo appropriato (come il 12/101 per risposta muscolare discusso sopra) è disponibile. Embrioni albini possono essere utilizzati per i tappi animali, che anche se più difficile in scena precisione nelle fasi gastrula, semplificare il processo di ibridazione in situ, eliminando la necessità di qualsiasi sbianca di tipo selvaggio pigmentazione per visualizzare meglio il prod reazione cromaticaUCT.
Infine, è importante considerare che per vari motivi, un gran numero di prove può essere necessario condotte per identificare un dato gene. Per uno, il numero di casi si può ragionevolmente processo in un determinato processo è limitata dallo sviluppo (e l'eventuale perdita di competenza) che si verifica nel tempo anche in una grande serie di embrioni e una gamma di temperature a cui alla cultura loro, così come la perdita che potrebbe verificarsi di piccoli pezzi di ectoderma in lavorazione. Per un altro, il tasso di successo di espressione di un marcatore scelta nel ectoderma possono essere molto basse e richiedono molti casi per osservare un effetto statisticamente significativo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
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