Protocol
全ての実験手順は、バージニア州制度動物実験委員会の大学によって承認されました。
注： 図1は、実験手順の概略を示しています。
卵母細胞の調製
- 事前プライムX.卵母細胞の単離の前に妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG）の150 Uと女性約1週間をアフリカツメガエル 。 29 G針と1ccの無菌注射器と背側リンパ嚢に1 mlの150 U / mLのPMSGを注入。
- 卵母細胞注入と卵母細胞アニマルキャップアッセイのためのソリューションを準備します。
- 準備のCa ++ / Mg ++を含まないOR 2（OR2-）：82のNaCl、2.5mMのKClを、1.5mMのの Na 2 HPO 4、50mMのHEPES pHは7.2。
- OR2-プラス1 mMのCaCl 2および1mM MgCl 2：OR 2 を準備します。
- 60％リーボビッツL15、0.4 mg / mlのBSA、100μg/ mlのゲンタマイシン、pHが7.8：OCMを準備します。
- 前1X MBS削減する：88のNaCl、1 mMの塩化カリウムを、0.7 mMのCaCl 2を、1mMのMgSO 4を、5 mMのHEPES（pHは7.8）、2.5 mMの炭酸水素ナトリウム3。
- 1X MBSで3％フィコールを準備します。
- 110のNaCl、2 mMの塩化カリウム、1mMのカルシウム（NO 3）2、1mMのMgSO 4を、0.1mMのEDTA、1 mMの炭酸水素ナトリウム、2 mMののNa 3 PO 4、pHが7.4：1×NAMを準備します。
- 用溶液中カエルを配置することによって、0.1×MBSにおけるエチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩（MS222）（第1 Lの0.1×MBSで希釈し、次いで、10 mlの95％エタノール中に0.3グラムのMS222を溶解）の0.03％溶液中で雌を麻酔10から15分、または応答しなくなるまで。
- その麻酔を確認することは、（不完全麻酔下のカエルは、手足を動かしたり身体を裏返し）応答しない保証するために、その背面に麻酔をかけたカエルを回して完了です。
- 外科鉗子で卵巣組織を単離し、メスの刃で肌と体壁を通って腹部切開を行うことによって、卵巣断片を単離はさみ。 OR2-に卵巣の断片を置きます。 24ミリメートル湾曲した針に3-0絹縫合糸で体壁を閉じて、同じ縫合で別々に皮膚を閉じます。水に1グラム/ Lの水族館塩中の女性の回復を許可します。
- （ - 20卵母細胞10）個、新鮮なOR2-への転送細かい鉗子を使用して、小さなに卵巣組織を引き裂きます。
- 、1時間シェーカー上で穏やかに攪拌新鮮なコラゲナーゼに転送し、さらに1時間攪拌することによりOR2-で2.0 mg / mlのコラゲナーゼAのDefolliculate卵巣断片。
- ウォッシュは、より小さな卵母細胞を捨てるOR2での[Ca ++ / Mg ++をを含む ] 10回、卵母細胞。
- OCMで卵母細胞を2回洗浄し、新鮮なOCMへの転送。目視検査時に大きさによって第6期の卵母細胞を分離し、未成熟な（小さい）卵母細胞を捨てる：第6期の卵母細胞は、動物半球であっても色素沈着と未成熟卵母細胞よりも大きく、直径が約1.2〜1.4ミリメートルです。
- 20℃のI - 18に卵母細胞を維持nは注射前にOCM。注：アガロースでコーティングされたペトリ皿を皿に卵母細胞の付着を最小限にするために使用されてもよいです。
図書館転写物の2注入
- （例えば、神経板ステージ14 10）開発の適切な段階で抽出したRNAを用いた指向性cDNAライブラリー15を準備します。 cDNAライブラリーを購入するか、以下の4つのステップで概要につき市販のキットを使用して1つを構築します。
- ポリ（A）+ RNA（材料の表を参照）を濃縮するために製品を使用し、製造業者の指示に従って、約5μgのmRNAを分離してください。注：cDNAライブラリーを作製するために使用される転写物が（所望の組織の顕微解剖以下のような神経板など）の誘導組織に限定することができる、または特定の段階で胚全体からのものであってもよいです。
- 製造業者の指示に従って、市販のキットを用いてcDNAを生成します。
- vectoに約20 ngのcDNAをを連結rは、市販のキットまたは他の適当なベクターに含まれています。適当なプラスミドベクターは、5 'βグロビンおよび3のポリ（A）配列（PCS2 +、pTnT、pCS105）などのmRNA安定性のための配列を含みます。
- 熱ショック形質転換のために、供給業者の推奨するプロトコルを使用して有能な細菌細胞へのライゲーションを変換します。
注：また、オープンリーディングフレーム（ORFeome）クローンの回収は、商業的に入手可能であり、注射のための転写物を生成するために使用することができます。
- 10 4複雑（4月10日から5月10日までの総複雑さ）に10 3のプラスミドの10のプールを準備します。万コロニー各 - これは、千と10のプレートを表しています。
- 37℃で18時間、および7ミリリットルLBのガラススプレッダーと穏やかな圧力によってそれぞれのコロニーを収集 - プレートライブラリ文化10 15 cmのLB-アンピシリンプレート上に、12を成長させます
- 0.5ミリリットルからグリセロールストックを準備します（-20＆で0.2 mlの滅菌グリセロールおよびストアに追加＃730; C）、製造者の指示に従って、標準的な市販のDNAミニプレップキットを用いてDNAを調製するために、残りの6.5ミリリットルを使用しています。
- 1.5時間-酵素1 37℃で16を消化し 、適切な制限付き- （2.0μgの1.0）プールされたプラスミドDNAを線形化。使用されるRNAポリメラーゼキットの仕様に水にエタノール沈殿および再懸濁が続くフェノール/クロロホルム抽出と直線化DNAを単離します。製造業者の指示以下の市販のRNAポリメラーゼキットとセンスRNAを合成します。
- 約20μmの直径の（ガラスキャピラリーチューブと針プラーを使用して）マイクロインジェクション用の針を準備します。較正済み接眼マイクロメータとの複合顕微鏡の針の先端を測定します。注：ニードルプラーの設定が細かい鉗子で壊れたときに所望のチップサイズを生成するように細かいチップで針を製造するために経験的に決定されなければなりません。
- 準備（に粘土を押してくださいマイクロインジェクションの間に所定の位置に卵母細胞を保持するための平行溝と皿の底に均一な層）粘土で内張り35×10ミリメートルペトリ皿。炎で先端に融合したショッピングモールプローブまたはパスツールピペットで溝を作ります。粘土の代替として、エラストマー金型17とのくぼみを作 るアガロース料理を準備します。粘土が並ぶ料理の行で1X MBSで3％フィコール（約2ミリリットル）に広口径ピペットで転送卵母細胞。
- マイクロインジェクターを用いて、1 ngの/ NL RNAと針を記入し、（卵母細胞の細胞質のアップ描画防ぐために）わずかな正の圧力を生成するためにバランスを調整します。
- 赤道域で約20 NL RNAを卵母細胞に注入します。その後、フィコール-MBSに残る1X MBSに優しく転送するために注入した卵母細胞のための1時間を許可します。アニマルキャップアッセイの前に20℃で24時間 - 8インキュベートします。
3.アニマルキャップアッセイ
- 3/4倍NAMを準備し、細かい鉗子、ヘアループ、湾曲したカバースリップフラグメント、粘土ライニングDISを得ます卵母細胞を保持するカップ状のくぼみとHES。 （ - 2ミリメートル×2 - 約1〜4 mm）の小さな断片にカバーガラスを離れて壊すことにより、湾曲したカバースリップフラグメントを作成し、エッジポリッシュまで炎を通過すると垂れ、湾曲した部分を生成します。
- Xを肥やしますアフリカツメガエルの卵のin vitroまたは自然交配やステージ原腸する培養による18 -前段階でソートするに0.1X MBS中（10室温で11時間後に受精を）。 10の胚-ミッド原腸胚（11.5ステージ11）を収集。
- NAM 3/4倍で、ハーフ、フル約ペトリ皿に胚を移します。細かい鉗子の二組を使用して、原腸胚から受精（卵黄）膜を除去します。
- 粘土が並ぶ皿でNAM（約2ミリリットル）3/4倍に転送する卵母細胞との溝は上述したように、個々の胚に対応するために、感想を生産、粘土の個々の印象に固定化します。
- 移植胚粘土が並ぶお料理にとgオフアニマルキャップをカット微細鉗子の二組を使用してastrulae。だけではなく、赤道組織18アニマルキャップ外胚葉を分離するように注意してください。
- 卵母細胞を接触させることをアニマルキャップの内面と各卵母細胞の動物半球上のアニマルキャップを置きます。 8時間以上 - 6のための卵母細胞の表面に露出した内部層に開いたままにすることができます（カバースリップの連絡先などの動物のキャップを粘土を外胚葉を平坦化、湾曲したガラスカバースリップフラグメントを塗布し、ガラスに下向きの圧力を加えることによって組換え体を一緒にホールド）。
注意：別の方法として、その内面を上に向けて、粘土のインデントにアニマルキャップを配置し、キャップに卵母細胞を置きます。粘土の小さな拡張子の組換え体を固定します。 - 20℃での培養制御胚がアッセイに所望の段階に達するまで。
- カバーガラス/粘土を除去し、鉗子とヘアループと外胚葉を単離することにより、組換えセパレート。
- MEMFAで1時間（3.8％のため、外胚葉断片を修正MEM中のホルムアルデヒド[0.1 M MOPS pHは7.4、2 mMのEGTA、および1mMのMgSO 4]）。
- -20℃でエタノールとストアにMEMFAからの断片（およびコントロール胚）を転送します。
in situハイブリダイゼーション （ISH） ではにより外胚葉における応答の解析4。
- ISHのためのソリューションを準備します。
- 準備し、1×PBS：0.01Mのリン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム0.138 M、pH7.4の
- 準備をPBS-Tweenで（PTW）：1×PBS、0.1％のTween-20
- 2％BSA、2％のポリビニルピロリドン、2％フィコール：100×デンハルト溶液を調製します
- ハイブリダイゼーションバッファーを準備します：50％ホルムアミド、5×SSC、1 mg / mlのトルラ酵母RNA、1 / mlのヘパリン、1×デンハルト液、0.1％Tween-20を、0.1％CHAPS、10mMのEDTA、DEPC-H 2 Oを
- 100 mMのマレイン酸、150mMのNaCl、pHが7.5：マレイン酸バッファー（MAB）を準備
- 準備MAB +ブロック：MAB、2％ブロッキング試薬（溶解する60℃の熱）
- 準備アルカリホスファターゼ（AP）緩衝液：100mMトリスpHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaCl、0.1％トゥイーン、のdH 2 O
- RNAプローブを準備します。
- 1.5mlチューブ（50μlの反応）に追加、商業RNAポリメラーゼキットを使用し、ミックスのNTP掘る：25.5μlのDEPC-H 2 O、10μlの5X転写バッファー、2.5μlの10倍DIG-NTPミックス、5μlの100 mMのDTT、2μLのRNAsin、2μlの直線化DNAテンプレート（〜を1μg/μl）を、3μlのRNAポリメラーゼと90分間37℃でインキュベートします。
- 2μlのRNAポリメラーゼを加え、60分間37℃でインキュベートします。
- 1％アガロースゲル上での反応の2μLを確認してください。
- 1μlのRQ1 RNaseフリーのDNaseを追加し、20分間37℃でインキュベートします。
- 50μlのDEPC-H 2 O、25μlの10 M酢酸アンモニウムおよび313μlのエタノールを添加することによって、プローブを沈殿させます。 -20℃で一晩（O / N）で保存し、その後20分間13,800×gで遠心分離することによりRNAを回収します。簡単にスピンし、500μlの75％エタノールで洗浄し、削除しますエタノール、空気乾燥さペレットを許します。 50μlのDEPC-H 2 Oを追加
- 〜0.5μgの/μlの最終濃度になるようにハイブリダイゼーションバッファーを追加します。
- ハイブリダイゼーションのために組織を準備します。特に断りのない限り、説明した各溶液交換（約4ml）でトップにバイアルを埋めます。
- 水平ロッカー上、10分ごとに75％エタノール/ PTW、その後、50％エタノール/ PTWにバイアルおよび移植胚からエタノールを除去します。
- ロッカーに各5分間PTWで3回洗浄します。
- 10μgのPTWで/μlのプロテイナーゼK処理に移します。垂直ロックチューブ15分。
- 垂直ロックチューブ - 0.1 MトリエタノールアミンpHは7.8で10分間2回ずつ洗浄します。
- チューブに12.5μLに無水酢酸を加え、垂直方向に5分を揺すります。 5分間の追加の12.5μlの無水酢酸で繰り返します。
- ロッカーに縦PTW 5分で洗浄します。
- ロッカーに4％パラホルムアルデヒド20分でREFIX。ヒートハイブリダイゼーションバッファー60℃に。
- ロッカーに各5分間PTWで3回洗浄します。
- 各チューブからPTWのすべてが、〜1ミリリットルを削除し、250μlのHybをバッファに追加します。穏やかに混合する管を渦巻きます。垂直ロックチューブ5分。
- 60℃Hybをバッファー（0.5ml）で交換し、60℃10分で静かに攪拌します。新鮮なHybを緩衝液で交換して、60℃2〜4時間で攪拌します。
- 60℃（3分）にヒートプローブ（Hybをバッファー中の0.5μg/μlので1ミリリットル）。 Hybを緩衝液を除去し、チューブにプローブを追加します。 O / Nは、60℃で穏やかに撹拌します。
- 抗体のための組織を準備します。
- 暖かいHybをバッファと、2×SSC + 0.1％Tween-20を60℃にソリューションを提供しています。
- Hybをバッファ（ - 3X再利用2、-20℃のプローブを保存）とプローブ溶液を交換してください。 10分間60℃で洗浄します。
- 2X SSC-Tween中60℃（20分攪拌しながら、それぞれ）で3回洗浄します。
- 0.2X SSC-Tween中60℃（20分攪拌しながら、それぞれ）で3回洗浄します。
- ロッカーにそれぞれ水平に15分間（RT）MABで2回洗浄します。
- 1ミリリットルのMAB +ブロックを追加します。ロッカーの上に縦に2時間を洗ってください。
- 1ミリリットルのMAB + 1 / 2,000の抗ジゴキシゲニンAPを含むブロックに転送します。 4 CO / Nで垂直方向にロック。
- 色試薬のために組織を準備します。
- MABと抗体溶液を交換してください。ロッカーにそれぞれ水平にMAB 5分間で3回洗浄します。
- ロッカーにそれぞれ水平にMAB 1時間で3回洗浄します。
- ロッカー上の各水平APバッファ10分間で2回洗浄します。
- 複数のウェルプラスチックトレーに組織を転送し、APのバッファを削除し、BMパープル試薬（〜1ミリリットル）を追加します。反応は、O / Nに暗い5分で進行させます。
- 適切な染色が達成されると、PTWのバイアルに組織を移します。ロッカー上PTWで2回各々10分間洗浄します。
- ロッカーの4 CO / Nでブアン液中で固定してください。
- RTで3 70％エタノール/ 30％PTW洗浄でブアンを洗浄します。トンを続行Oイメージ落射顕微鏡に取り付けられたカメラを使用してキャプチャ、漂白に必要な18の場合。
5.兄妹の選択およびクローニング
- 最も高い活性（外胚葉組織の最大の応答）とプールを選択します。
- （上記のプロトコルにセクション2を使用して）前のステップからのコロニーを、最も高い活性を有するプールのグリセロールストックを（適切な密度にLBで希釈）と、10分の1程度で新たに10のプレートをプレートアウト滴定します。
- 活動が単一コロニーにトレースされるまで、プールのサイズを減らします。
- ベクター標準プライマーを用いてDNA配列を得ます。
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Representative Results
mRNAの発現に応答して、卵母細胞に注入し、応答動物キャップ組織は、in situハイブリダイゼーション （ 図2および表1）によってOTX2の発現についてアッセイした。OTX2、レンズプラコードを介して神経管閉鎖の推定レンズ外胚葉（PLE）で表され肥厚19。 OTX2も PLE外側前方神経外胚葉ならびに非神経外胚葉ヘッドで表現されているのでしかし、それは神経とplacodal応答の両方に関連付けられています。 foxe3は神経板からPLEで発現されるのでfoxe3の使用は、発現クローニングの目的に、より具体的なアプローチを可能にしたレンズコンピテント動物キャップ外胚葉におけるレンズ誘導応答を産生することができる遺伝子産物のためのライブラリーをスクリーニングします隣接placodal領域に存在するが、neuroectoder欠席ステージとレンズの小胞形成20を通して、メートル。 （ 表2）、アニマルキャップでfoxe3表現を生成することができる遺伝子が単離された上記の発現クローニングおよび同胞選択プロトコルを使用して、ライブラリの転写産物のプールを注入します。クローンを単離した後、ライブラリー転写物を注入した卵母細胞を用いて、179追加のアニマルキャップアッセイはfoxe3の発現についてスクリーニングしました。 50（28％）が陽性でした。注射していない卵母細胞上に配置された140アニマルキャップ片のうち0は（ 図3）陽性でした。
図1卵母細胞、動物キャップアッセイおよび発現クローニング手順の概略：転写産物は、クローンライブラリーから調製し、卵母細胞に注入されているが、動物キャップ外胚葉は、卵母細胞と共に培養した後、in situハイブリダイゼーションにより誘発される遺伝子発現についてアッセイします。 D / 53518 / 53518fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
mRNAの注入と OTX2 のためのin situハイブリダイゼーションを以下の動物キャップアッセイの図2.代表的な結果 。（AB）誘導応答の代表的な結果は、 その場でのホールマウントによりOTX2発現についてアッセイ、アニマルキャップにステージ14のポリ（A）+ RNAをdorsalizedしますハイブリダイゼーション。段階10.5で注射していない卵母細胞上に配置された（A）アニマルキャップとステージ25に培養した（B）ステージ6/7の場合に観察によって示さOTX2表現10 ngのRNAを、ステージ25に培養を注入した卵母細胞上に配置された10.5アニマルキャップ矢じり。バー=500μmの。 「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
in situハイブリダイゼーションによって foxe3の発現について試験卵母細胞アニマルキャップアッセイからの動物キャップアッセイ Foxe3 のためのin situハイブリダイゼーション 、以下の図3代表的な結果 。（AC）代表アニマルキャップ。 （A）ステージ11から11.5アニマルキャップステージ23 foxe3式にLDB1-注入した卵母細胞の上に置き、培養は、矢印で示されています。 （B）段階注射していない卵母細胞およびステージ23に培養上に配置された11から11.5アニマルキャップを。何foxe3の発現は検出されません。 （C）外胚葉の内側と外側の層に示す式からfoxe3陽性誘発されるアニマルキャップの断面。バー=500μmの。F =「https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 注入されたRNA | 正例 | 遺伝子 | ％ |
| ステージ14 dorsalized mRNAを、10 ngの | 12/24 | OTX2 | 50 |
| 10 5クローンのライブラリーのプール、20 ngの | 3/9 | OTX2 | 33 |
| 10 5 0〜10 CLONのライブラリプールエス、20 ngの | 179分の50 | foxe3 | 28 |
| なし | 0/140 | foxe3 | 0 |
表1卵母細胞、動物キャップアッセイ結果のアニマルキャップアッセイの結果は、mRNAまたはcDNAライブラリープールから合成した転写物を注入した卵母細胞を使用して、OTX2とfoxe3とin situハイブリダイゼーションによって評価。または注射していない卵母細胞。
| 注入されたRNA | プールの指定/選択 | 正foxe3式 |
| A | 2/4 | |
| Bの* | 4/28 | |
| C言語 | 4/44 | |
| 10 4クローンのライブラリーのプール、20 ngの | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| 5,000クローンのライブラリーのプール、20 ngの | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| 70-200コロニーのライブラリプール、20 ngの | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 20コロニーのライブラリプール、20 ngの | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6、L1 | 0/10 | |
| L2-6、M7 | 0/10 | |
| M8-12、N7-8 | 0/10 | |
| K5-6、L1-4 | 1/10 | |
| L5-6、M7-10 | 0/10 | |
| M11-12、N7-8、K2-4 | 0/10 | |
| K2、K5、L2、L5、M8、M11 | 0/10 | |
| K3、K6、L3、L6、M9、M12 | 0/9 | |
| K4、L1、L4、M7、M10、N7、N8 | 1/9 | |
| 図書館のRNA、20 ngの | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| 図書館RNA、20 ngの | L1（LDB1）確認 | 179分の50 |
| *選択したプールを示し、 |
表2兄妹の選択とExpressionクローニング（10％foxe3の発現について陽性36％の間の範囲）を各動物キャップアッセイにおける応答の最高レベルのプールが1クローンに活動を絞り込むために次の実験に使用するために選択した結果。アスタリスクは、選択されたプールを示しています。
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Discussion
コンピテント外胚葉における応答を誘導することができる遺伝子の機能的クローニングのためにここに記載された方法は、遺伝子産物の広い範囲を同定することができます。この方法は、発現クローニング技術と組織誘導のアッセイを組み合わせることにより、過去の作品を発展させ。我々は、RNA注入後、直接的または間接的に、誘導因子の産生の供給源としてアフリカツメガエル卵母細胞の代謝経路を利用します。これ、cDNAライブラリーまたはクローンの他のコレクションから生成された転写物の発現を用いて目的6,7の遺伝子をクローニングするための確立された方法の使用と組み合わせて、胚に関わる新たな関心の遺伝子を同定するために求める人々のための貴重なアプローチを提供誘導。新しい遺伝子の機能同定にこの方法の広範な適用は、エキサイティングな新しい逆遺伝学的アプローチに便利な補完であり、また高THRを使用して同定された試験転写物を機能的にするために使用することができます（例えば、RNA-seqのような）oughput法21。
コントロールは、キャップアッセイで使用した卵母細胞の代謝機能を監視するのに重要です。卵母細胞の各バッチの健全性を確保するために、試験したINHBB中胚葉誘導因子のmRNAの濃度を変化させ、低存在量の転写産物を検出するために、このシステムの有用性を確立するために両方。この遺伝子は、レンズ誘導経路とは無関係であり、十分に文書化独立制御14です。でも、500倍過剰ステージ14のポリ（A）の存在下で、200 PG INHBBのmRNA - 101分の12抗体を用いた動物キャップ外胚葉における筋特異的抗原の発現によりアッセイ筋肉誘導活性は、2で観察されました+ RNA。システムは、注入されたRNAの量の非常に広い範囲にわたって有用であり、そして卵母細胞を安定的にタンパク質を産生することが可能であり、50 NL以降の容積の細胞質注入後生存し続けます。
uのための一考察このプロトコルでcDNAライブラリーのSEは、全長またはほぼ完全長クローンの必要性です。プロトコルで使用する前に、ライブラリーは、ライブラリ内の既知の転写物の大きさを決定し、したがって、ドミナントネガティブ効果は、潜在的に切り捨て注入転写物から得られる可能性を低減するために、ノーザン分析によって試験されるべきです。完全長cDNAプールは重要であるため、ESTクローン22または最適の使用は、（検証済みの完全長クローンの完全なセットを提供します） アフリカツメガエル ORFeome 23は stage-や組織が ない限り、従来のcDNAライブラリーに好まれますcDNAの特定のソースを求め、ライブラリー構築のために使用されています。別の考慮事項は、注入された転写物中のmRNAの安定性を増強することを目的とライブラリーベクター中のβグロビンおよびポリ（A）配列の存在です。これは、注入された合成mRNAから産生されるタンパク質の量を増加させることが望ましいが、それはまた、possibilを提起生体内でより安定性および活性が高く、mRNAからのドミナントネガティブ効果を生み出すの性。低コピー数のmRNAが転写物の大きなプールの背景にその内因性の対応と同様の効果を発揮しない場合があります。クローニングおよび転写過程で安定化されたものは、キャップアッセイにおける検出を可能にするために持続することができます。第三の問題は、プールサイズです。プールサイズ（10クローンまたはそれ以下）の大幅な減少は、胚24における最近の機能獲得型スクリーニングプロジェクトに有利で あることが実証し、より明確な結果と候補遺伝子を容易に識別情報を提供する可能性がされています。 10 3よりも小さいプールサイズ- ORFeome 23の場合と同様にクローンの集合の総複雑さは、10 4未満である場合、このプロトコルで推奨10 4は達成可能です。それは法外労働集約的になるかもしれませんが1は、900の10のプールで始まる〜9,000個のクローンをスクリーニングすることができ実験では10以上のプールを処理します。
スクリーニングで同定された遺伝子によって作ら（配列分析により）遺伝子産物の種類の決意は、その機能のテストの性質を決定します。核転写補助因子が我々のスクリーン 8に同定されたので、LDB1の導入によって誘発さ誘導過程における核の役割を確認する必要がありました。除核卵母細胞は、完全に機能するタンパク質合成機構を持っている、生存と注入された転写物から分泌される因子を生成することができます。しかしながら、核の非存在は、転写因子、補因子、または他の間接的に作用する遺伝子産物の機能を廃止します。画面に同定された遺伝子のその後の分析は、in situハイブリダイゼーションによって発達の発現パターンの決意を含み、機能獲得および機能喪失をテストします。接合体へのRNAの注入またはSPに注射を制限することにより過剰発現胚の特定の領域への影響を制限するecific割球は、洞察を提供だけでなく、in vivoでの転写産物に対して向けられたモルホリノオリゴヌクレオチドの注入による遺伝子機能のノックダウンすることができます。
（例えば、GFPなど）レポーター遺伝子を有するトランスジェニック系統を用いて応答する動物キャップ外胚葉における誘導効果の直接可視化を大幅にスクリーニングプロセスを促進し、in situハイブリダイゼーションによりRNA発現の分析の必要性を排除することができます。 （例えば、上述の筋応答の101分の12のような）適切な抗体が利用可能である場合も同様に、スクリーニングの迅速な手段としての抗体の使用が望ましいです。アルビノ胚はより良い色反応PRODを可視化するために、野生型の色素沈着の任意の漂白のための必要性を排除することによって、in situハイブリダイゼーションプロセスを合理化、より難しいが、原腸胚段階で正確にステージングするアニマルキャップに使用することができますUCT。
最後に、いくつかの理由のために、試験の多くは、与えられた遺伝子を同定するために実施される必要があり得ることを考慮することが重要です。一つには、症例数は1が合理的に与えられた裁判の処理が開発（と能力の最終的な損失）によって制限される場合がありながらも、胚の大規模なバッチとで文化にそれらの温度の範囲を指定した時間の経過とともに発生しますよく処理における外胚葉の小片の発生する可能性がある損失など。別の場合は、外胚葉で選択したマーカーの発現の成功率は非常に低いことと、統計的に有意な効果を観察するために、多くの例が必要な場合があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
