Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

를 사용하여 기능성 복제 doi: 10.3791/53518 Published: January 30, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

모든 실험 절차는 버지니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.

참고도 1은 실험 과정의 개략도를 나타낸다.

난자 1. 준비

  1. 사전 프라임 (X) 난 모세포의 분리에 앞서 임신 마레 혈청 성선 자극의 150 U (PMSG) 약 1 주일와 여성을 laevis의. 29 G 바늘 1 CC 멸균 주사기 등의 림프 낭에 1 ml의 150 U / ㎖의 PMSG를 주사.
  2. 난 모세포 주입 및 난자 동물 캡 분석을위한 솔루션을 준비합니다.
    1. 칼슘을 준비 ++ / 마그네슘 + + - 무료 OR2 (OR2-) : 82 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 50 mM의 HEPES pH가 7.2.
    2. OR2- 플러스 1 mM의 염화칼슘 2, 1 밀리미터의 MgCl 2 : OR2를 준비합니다.
    3. 60 % 라이 보 비츠 L15, 0.4 ㎎ / ㎖ BSA, 100 μg의 / ㎖ 겐타 마이신, pH가 7.8 : OCM을 준비합니다.
    4. 사전1X MBS 깎다 : 88 mM의 염화나트륨, 1 mM의 KCl을을 0.7 mM의 CaCl2를, 1mM의 황산, 5 mM의 HEPES (PH 7.8), 2.5 mM의 NaHCO3을.
    5. 1X MBS의 3 % 피콜을 준비합니다.
    6. 1X NAM을 제조 : 110 mM의 염화나트륨, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 칼슘을 (NO 3) 2, 1mM의 황산, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 NaHCO3을, 2 mM의 나트륨 3 PO 4, pH가 7.4.
  3. 0.1X MBS 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트, 메탄 술폰산 염을 0.03 % 용액 (MS222)으로 여성 마취위한 용액 개구리 배치하여 (제 10 ml의 95 % 에탄올 중의 0.3 g의 MS222을 용해하고 1 L 0.1X의 MBS에 희석) 10-15 분 또는 응답하지 않는 때까지.
    1. 그 마취가 응답하지 않도록 (불완전 마취 된 개구리가 사지를 움직이거나 몸을 뒤집)하기 위해 다시에 마취 된 개구리를 돌려 완료 확인합니다.
  4. 수술 집게로 난소 조직을 분리, 메스 블레이드와 피부 및 신체 벽을 통해 복부 절개를하여 난소 조각을 분리가위. OR2-에 난소 조각을 놓습니다. 24mm 곡선 바늘에 3-0 실크 봉합사와 신체 벽을 닫고 같은 봉합 별도로 피부를 닫습니다. 물에 1g / L 수족관 소금에 여성의 복구를 허용합니다.
  5. (- 20 난자 10) 조각과 신선한 OR2-로 전송 작은으로 미세 집게, 눈물 난소 조직을 사용.
  6. 1 시간 동안 진탕 기에서 부드럽게 교반 신선한 콜라게나 제에 전송하고 하나의 추가 시간 동안 교반하여 OR2- 2.0 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제에 Defolliculate 난소 조각.
  7. 워시 작은 난자를 폐기 OR2에 [칼슘 + + / 마그네슘 + +를 ​​포함하는 10 번, 난자.
  8. OCM에 두 번 난자를 세척하고 신선한 OCM에 전송합니다. 육안 검사에 크기에 따라 단계 VI 난자를 분리하고 미숙 (작은) 난자를 폐기 : 단계 VI 난자는 동물 반구도 색소 침착과 미성숙 난자보다 큰 약 직경 1.2-1.4 mm이다.
  9. 20 ° C 형 I - 18에서 난자를 유지주입하기 전에 N OCM. 주 : 아가 로스 코팅 페트리 접시는 접시 난자의 점착을 최소화하기 위해 사용될 수있다.

도서관 성적 증명서 2. 사출

  1. 개발의 적절한 단계 (예를 들어, 신경 판 단계 14 10)에서 추출 방향 cDNA 라이브러리 (15) 사용하여 RNA를 준비합니다. cDNA 라이브러리를 구입하거나 아래의 4 단계 개요 당 상용 키트를 사용하여 하나를 구축합니다.
    1. 폴리 (A) + RNA (재료의 표 참조) 풍부하게 제품을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 약 5 μg의 mRNA의를 격리합니다. 주 : 사체 (원하는 조직의 미세 절제 다음과 같은 신경 판으로) 유도 조직에 한정 될 수있다 cDNA 라이브러리를 생성하기 위하여 사용되는, 또는 특정 단계에서 전체 배아 일 수있다.
    2. 제조업체의 지침에 따라, 상용 키트의 cDNA를 생성합니다.
    3. vecto로 cDNA를 NG 약 20 결찰R은 상용 키트 또는 다른 적절한 벡터에 포함. 적절한 플라스미드 벡터는 mRNA의 안정성 등 5 'β-글로빈 3 폴리 (A) 시퀀스 (PCS2 +, pTnT, pCS105)에 대한 시퀀스를 포함한다.
    4. 열충격 형질 전환 공급자의 권장 프로토콜을 사용하여 능력 균체 내로 결찰 변환.
      참고 : 또는 오픈 리딩 프레임 (ORFeome) 클론의 수집이 시판되고 주입 전 사체를 생성하기 위해 사용될 수있다.
  2. 10 4 복잡성 (10월 4일에서 10월 5일까지 총 복잡성) 10 (3)의 플라스미드 (10) 풀을 준비합니다. 10,000 식민지 각 - 이것은 1000 10 판을 나타냅니다.
    1. 37 ℃에서 18 시간, 7 ㎖의 (LB)에 유리 스프레더와 부드러운 압력에 의해 각에서 식민지를 수집 - 플레이트 도서관 문화 10 15-CM LB-암피실린 플레이트 상에, (12)을 성장
    2. 0.5 ml의에서 글리세롤 주식을 준비합니다 (-20에서 0.2 ml의 멸균 글리세롤 및 저장에 추가# 730; C), 및 표준 제조사의 지침에 따라 시판중인 DNA 미니 프렙 키트 DNA를 제조 6.5 mL의 나머지를 사용한다.
  3. 1.5 시간 - 효소 (1) 37 ℃에서 16 다이제스트 적절한 제한과 - (2.0 μg의 1.0) 풀링 된 플라스미드 DNA를 선형화. 사용 된 RNA 폴리머 라제 키트의 사양에 물 및 에탄올 침전에 재 부유 한 다음 페놀 / 클로로포름 추출과 선형화 된 DNA를 분리. 제조업체의 지침에 따라 상업 RNA 중합 효소 키트 센스 RNA를 합성.
  4. 약 20 μm의 직경 (유리 모세관 튜브와 바늘 풀러를 사용하여) 미세 주입 용 바늘을 준비; 교정 된 안구 마이크로 미터와 복합 현미경에 바늘 끝을 측정한다. 참고 : 니들 풀러 설정이 미세 집게로 깨진 경우 원하는 팁 크기를 얻을 수 있도록 좋은 팁 바늘을 생산하는 경험적으로 결정되어야한다.
  5. (에 점토를 밀어를 준비접시의 바닥)에 균일 한 층 점토 늘어선 35 X 10mm 미세 주입하는 동안 장소에 난자를 유지하는 병렬 홈으로 배양 접시를; 불꽃의 끝에서 융합 쇼핑몰 프로브 또는 파스퇴르 피펫으로 홈을 생산하고 있습니다. 점토에 대한 대안으로서, 엘라스토머 (17)와 톱니 형을 아가로 요리를 준비한다. 점토 늘어선 요리의 행에 1X MBS의 3 % 피콜 (약 2 ㎖)에 넓은 구멍 피펫으로 전송 난자.
  6. 마이크로 인젝터를 사용하여, 1 NG / NL RNA와 바늘을 작성하고 (난자 세포질의 그리기 방지하기 위해) 약간의 긍정적 인 압력을 생산하기 위해 균형을 조정합니다.
  7. 적도 지역에서 약 20 NL RNA와 난 모세포를 주입한다. 다음, 피콜-MBS에 남아 1X MBS에 부드럽게 전송 주입 난 모세포에 대한 1 시간을 허용합니다. 이전에 동물 캡 분석에 20 ℃에서 24 시간 - 8 품어.

3. 동물 모자 분석

  1. 미세 집게, 헤어 루프, 곡선 coverslip에 조각, 점토 늘어선 DIS 3 / 4 배 NAM을 준비하고 획득컵 모양의 톱니와 HES는 난자를 개최합니다. 곡선 부분을 생산, (4 MM - - 2 MM × 2 약 1)과 가장자리 광택과 처지까지 불꽃을 통과하는 작은 조각으로 커버 글라스를 따로 끊어서 곡선 coverslip에 조각을 확인합니다.
  2. X를 기름지게 laevis의 달걀 체외 또는 자연 교배와 단계 낭배하는 문화를 통해 18 - 이전 단계에 의해 정렬에 0.1X MBS (10 실온에서 11 시간 포스트 수정을); 10 배아 - 중간 낭배 (11.5 단계 11)를 수집합니다.
  3. 3 / 4 배 NAM와 약 반 전체 배양 접시로 전송 배아. 미세 집게 두 쌍을 사용하여, gastrulae에서 수정 (난황) 막을 제거합니다.
  4. 전송 점토 늘어선 요리 3 / 4 배 NAM (약 2 ㎖)에 난자 홈이 상기 된 개별 배아를 수용하기 위해 인상을 생산, 점토의 개별 노출에 고정.
  5. 점토 늘어선 요리로 전송 배아 및 G 오프 동물 모자를 잘라astrulae 잘 포셉 두 쌍을 사용하여. 만 아니라 적도 조직 (18) 동물 모자 외배엽을 분리주의하십시오.
  6. 난자와 접촉하는 동물 캡의 내부 표면과 각 난자의 동물 반구에 동물 캡을 놓습니다. 8 시간 이상 - 6 난자의 표면에 노출 된 내부 층으로 열려있다 (커버 슬립 연락처 동물성 캡 점토 외배엽 평탄화, 곡면 유리 커버 슬립 단편을인가하고, 유리로 하향 압력을인가하여 재조합을 함께 보유 ).
    , 또는 위쪽을 향 내면에 점토 들여 쓰기에 동물 캡을 배치하고 뚜껑에 난자를 배치; 참고 : 점토의 작은 확장자를 가진 재조합을 고정합니다.
  7. 20 ° C에서 문화 제어 배아는 분석 무대를 원하는에 도달 할 때까지.
  8. 커버 슬립 / 진흙을 제거하고 집게와 헤어 루프 외배엽을 분리하여 별도의 재조합.
  9. MEMFA에서 1 시간 (3.8 %를 외배엽 조각을 수정(MEM) [0.1 M MOPS의 pH가 7.4, 2 mM의 EGTA, 1 mM의 황산 4]에서 포름 알데히드).
  10. -20 ℃에서 에탄올과 저장소로 MEMFA에서 전송 조각 (및 제어 배아).

에서의 현장 하이브리드 화에 의한 외배엽에서 응답 4. 분석 (ISH)

  1. ISH을위한 솔루션을 준비합니다.
    1. 1X PBS를 준비 : 0.01 M 인산 완충 식염수, 염화나트륨 0.138 M, pH가 7.4
    2. 제조 PBS-트윈 (PTW) 1X PBS, 0.1 % 트윈 -20
    3. 100 × 덴 하르트의 용액을 제조 하였다 : 2 % BSA, 2 % 폴리 비닐 피 롤리 돈을, 2 % 피콜
    4. 혼성화 완충액을 제조 50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 1 mg의 / ㎖ torula 효모 RNA, 1 μg의은 / ㎖ 헤파린 1X 덴 하르트의 용액, 0.1 % 트윈 -20, 0.1 % CHAPS, 10 mM의 EDTA, DEPC-H 2 O
    5. 제조 말레 산 완충액 (MAB) : 100 mM의 말레 산, 150 mM의 염화나트륨, pH가 7.5
    6. (용해 60 ℃에 열) MAB, 2 % 시약을 차단 : MAB + 블록을 준비
    7. 100 mM 트리스 : 알카라인 포스파타제 (AP) 버퍼를 준비합니다pH가 9.5의 50 mM의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈, DH 2 O
  2. RNA 프로브를 준비합니다.
    1. 1.5 ML 튜브 (50 μL 반응)에 추가, 상업 RNA 중합 효소 키트를 사용하여 혼합 - NTP의 발굴 : 25.5 μL의 DEPC-H 2 O, 10 μL 5 배 전사 버퍼, 2.5 μL 10 배 발굴-NTP 믹스, 5 μL 100 밀리미터 DTT, 2 μL RNAsin, 2 μL 선형화 DNA 주형 (~ 1 μg의 / μL), 3 μL RNA 중합 효소와 90 분 동안 37 ℃를 품어.
    2. 2 μL RNA 중합 효소를 추가하고 60 분 동안 37 ℃를 품어.
    3. 1 % 아가 로스 젤에 반응 2 μL를 확인합니다.
    4. 1 μL의 RQ1 RNA 분해 효소가없는 DNase를 추가하고 20 분 동안 37 ℃를 품어.
    5. 50 μL의 DEPC-H 2 O, 25 ㎕의 10 M 암모늄 아세테이트 및 에탄올 313 μL를 첨가하여 침전물을 프로브. -20 ℃에서 보관 하룻밤 (O / N)은 다음 20 분 동안 13,800 XG에서 원심 분리하여 RNA를 복구 할 수 있습니다. 간단히 회전, 500 μL 75 % 에탄올로 세척, 제거에탄올과 공기 건조에 펠렛을 할 수 있습니다. 추가 50 μL의 DEPC-H 2 O
    6. 0.5 μg의 / μL ~의 최종 농도 하이브리드 버퍼를 추가합니다.
  3. 하이브리드를 위해 조직을 준비합니다. 특별히 언급하지 않는 한, 각 솔루션의 변화를 설명 (약 4 mL)로 정상에 튜브를 입력합니다.
    1. 수평 로커에, 10 분 각 75 % 에탄올 / PTW, 다음 50 % 에탄올 / PTW에 튜브 및 이식란으로부터 에탄올을 제거합니다.
    2. 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오.
    3. 10 μg의 PTW에서 / μL 테 K 처리로 이동; 바위 튜브를 수직으로 15 분.
    4. 수직 바위 튜브 - 0.1 M 트리에탄올 아민 pH가 7.8에 두 번 10 분 각 씻어.
    5. 튜브에 12.5 μL에게 무수 초산을 추가하고 수직으로 5 분 바위. 5 분 동안 추가로 12.5 μL 아세트산 무수물로 반복한다.
    6. 로커에 분 수직 PTW 5 씻으십시오.
    7. 로커에 4 % 파라 포름 알데히드 20 분에 REFIX. 열 하이브리드 버퍼60 ℃에.
    8. 5 분 로커에 각각 PTW에 세 번 씻으십시오.
    9. 250 μL HYB 버퍼를 각 튜브에서 PTW의 모든하지만 ~ 1 ml의를 제거하고 추가; 부드럽게 섞어 튜브를 소용돌이 친다. 락 튜브를 수직으로 5 분.
    10. 60 ℃ HYB 버퍼 (0.5 ml)로 교체하고 60 ℃ 10 분에서 부드럽게 교반. 신선한 HYB 버퍼로 교체하고 60 ℃에서 2 4 시간에서 교반.
    11. 열 프로브 (60) C (3 분)에 (0.5 μg의 HYB 버퍼에 / μL에서 1 ㎖). HYB 버퍼를 제거하고 튜브에 프로브를 추가 할 수 있습니다. O / N은 ​​60 ℃에서 부드럽게 선동.
  4. 항체를위한 조직을 준비합니다.
    1. 60 ℃로 따뜻한 HYB 버퍼 및 배 SSC + 0.1 % 트윈 20 솔루션을 제공합니다.
    2. (- 배 재사용이 -20 ℃에서 프로브를 저장) HYB 버퍼와 프로브 솔루션을 교체합니다. 10 분 동안 60 ℃에서 씻으십시오.
    3. 배 SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오.
    4. 0.2X SSC-트윈에서 60 ℃ (20 분 교반과 함께 각)에서 세 번 씻으십시오.
    5. 로커에 15 분마다 수평에 대해 MAB (RT)에 두 번 씻으십시오.
    6. 1 ML의 MAB + 블록을 추가합니다. 로커에 수직으로 2 시간을 씻으십시오.
    7. 1 / 2,000 안티 digoxygenin-AP를 포함하는 1 ML의 MAB + 블록에 전송. 4 주 / N에서 수직 바위.
  5. 색상 시약을위한 조직을 준비합니다.
    1. MAB와 항체 솔루션을 교체; MAB 5 분마다 수평 로커에 세 번 씻는다.
    2. MAB 1 시간에 각각의 수평 로커에 세 번 씻으십시오.
    3. AP 버퍼 10 분에 각각 수평 로커에 두 번 씻으십시오.
    4. 여러 웰 플라스틱 트레이로 조직을 이동 AP 버퍼를 제거하고 BM에게 보라색 시약을 추가 (1 ~ ㎖). 반응이 O / N 어두운 5 분에 할 수있게합니다.
    5. 적절한 염색이 달성되면, PTW의 바이알에 조직을 전송. 로커에 PTW에 두 번 10 분 각각을 씻으십시오.
    6. 로커에 4 주 / N에서 Bouin의 솔루션에 고정합니다.
    7. 실온에서 Bouin의 세 70 % 에탄올 / 30 % PTW 세척과를 세척 할 것. T를 진행필요한 경우 18 에피 조명 및 현미경에 장착 된 카메라, 표백을 사용 O 이미지 캡처.

5. SIB 선정 및 복제

  1. 가장 높은 활성을 선택 풀 (외배엽 조직에 가장 큰 응답).
  2. (위의 프로토콜 섹션 2를 사용) 이전 단계의 식민지를 가장 높은 활성을 가진 풀의 글리세롤 주식을 (적절한 밀도 LB로 희석) 약 십분의 일에 열 새로운 판을 판 적정한다.
  3. 활동이 하나의 식민지로 추적 될 때까지 풀의 크기를 줄입니다.
  4. 벡터 표준 프라이머를 이용하여 DNA 서열을 얻습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

동물 캡 조직 응답, 난자에 주입의 mRNA의 발현에 대응하여 현장 하이브리드 (그림 2, 표 1)에 의해의 Otx2의 발현을 측정 하였다;의 Otx2이 렌즈 placode를 통해 신경관 폐쇄에서 추정 렌즈 외배엽 (PLE)로 표현된다 농축 (19). 도의 Otx2 PLE 외부 전방 신경 외배엽뿐만 아니라 비 - 신경 외배엽 헤드 표현이기 때문에,이를 신경과 placodal 반응 모두와 연관된다. foxe3 신경 판으로부터 PLE 표현되므로 foxe3의 사용은 발현 클로닝의 목적에 더 구체적인 접근을 허용 가능한 렌즈 유능한 동물 캡 외배엽의 렌즈의 유도 반응을 생성 할 수있는 유전자 산물의 라이브러리를 선별 할 인접 placodal 지역에 존재하지만 neuroectoder 결석 단계와 렌즈 소포 형성 (20)에 걸쳐, 엠. 상기 클로닝 및 발현 SIB 선택 프로토콜을 사용하여 라이브러리 사체의 풀을 주입 동물 대문자 foxe3 식을 생성 할 수있는 유전자 (표 2)를 단리 하였다. 클론의 분리에 따라, 라이브러리 성적 증명서를 주입 난자를 사용하여 179 추가 동물 캡 분석은 foxe3의 발현에 대해 스크리닝 하였다 50 양성이었다 (28 %). uninjected 난자에 배치 (140) 동물 캡 조각, 0 (그림 3) 양성이었다.

그림 1
그림 1. 난자 동물 모자 분석 및 표현 복제 프로토콜의 도식 개요 :. 성적 증명서는 클론 라이브러리에서 준비하고 난자에 주입은 동물 모자 외배엽은 난 모세포를 배양 한 후 현장 하이브리드에 의해 유도되는 유전자 발현에 대한 분석이다. D / 53518 / 53518fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
mRNA의 주입과의 Otx2에 대한 현장 하이브리드에 다음과 동물 모자 분석 그림 2. 일반적인 결과. (AB) 유도 응답의 대표적인 결과는 현장에서 전체 마운트로의 Otx2 발현을 분석, 동물 모자에 단 14 폴리 (A) + RNA를 dorsalized하기 이종 교잡. 난자에 위치 (A) 동물 모자 단계로 단계 10.5 uninjected 난자에 배치 배양 (25) (B) 단계 10.5 동물 캡은 10 ng의 RNA를 주입과 표현에 의해 6/7의 경우에 관찰 및 표시의 Otx2 단계 (25)에 배양 화살촉. 바 = 500 μm의. "대상 ="_ 빈은 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
현장 하이브리드에 의해 foxe3의 발현 테스트 난자 동물 캡 분석에서 동물 모자 분석이 Foxe3에 대한 현장 하이브리드에 다음과 같은 그림 3. 일반적인 결과. (AC) 대표 동물 모자. (A) 단계 11-11.5 동물 모자 단계 23 foxe3 표현 LDB1 주입 난 모세포에 배치 배양는 화살촉으로 표시됩니다. (B) 단계 uninjected 난자과에 배치 11-11.5 동물 모자 23 단계로 배양; 더 foxe3 발현은 검출되지. foxe3를 통해 (C) 항은 외배엽의 내부 및 외부 층에서 보여주는 표현에서 동물 모자를 유도 양성. 바는 500 μm의 =.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

주입 된 RNA 긍정적 인 경우 유전자 %
단계 14 dorsalized의 mRNA, 10 NG 12/24 의 Otx2 (50)
10 5 클론의 도서관 풀, 20 NG 3/9 의 Otx2 (33)
10 5 클론 10-0의 도서관 풀 ES, 20 NG 179분의 50 foxe3 (28)
없음 0/140 foxe3 0

표 1. 난자 - 동물 모자 분석 결과 동물 캡 분석의 결과의 mRNA 또는 cDNA 라이브러리 풀에서 합성 된 성적 증명서를 주입 한 난자를 사용하여,의 Otx2foxe3와 현장 하이브리드에 의해 평가.; 또는 uninjected 난자.

여덟 : 24px; "> 105 클론의 라이브러리 풀, 20 NG HT : 21px; "> 400 클론의 라이브러리 풀, 20 NG 높이 = "21"스타일 = "높이 : 21px;"> 6 도서관 풀 - 7 식민지, 20 NG 1 픽셀; ">
주입 된 RNA 풀 지정 / 선택 긍정적 인 foxe3 식
에이 2/4
비* 4/28
기음 4/44
10 4 클론의 도서관 풀, 20 NG 1 0/11
(2) 0/10
3 3/14
4 0/12
(5) 0/15
(6) 1/20
7 3/23
8 0/16
9 0/16
10 * 5/20
5000 클론의 도서관 풀, 20 NG 1 0/7
2 * 5/16
3 1/7
4 0/7
(5) 0/7
1 0/10
(2) 0/10
3 0/10
4 0/10
5 * 8/26
(6) 0/11
7 0/10
8 0/10
9 0/10
(10) 0/8
70-200 식민지의 도서관 풀, 20 NG 1 0/8
(2) 0/10
3* 1/10
4 * 1/10
(5) 0/10
(6) 0/9
7 0/10
8 0/10
20 식민지의 도서관 풀, 20 NG 1 0/10
(2) 0/10
3 0/10
4 * 7/21
(5) 0/10
(6) 0/10
7 0/10
8 0/10
9 0/10
(10) 0/10
K2-6, L1 0/10
L2-6, M7 0/10
M8-12, N7-8 0/10
K5-6, L1-4 1/10
L5-6, M7-10 0/10
M11-12, N7-8, K2-4 0/10
K2, K5, L2, L5, M8, M11 0/10
K3, K6, L3, L6, M9, M12 0/9
K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 1/9
도서관 RNA를, 20 NG K6 0/10
L1 * 3/10
(L3) 0/10
(L4) 0/10
도서관 RNA, 20 NG L1 (LDB1) 확인 179분의 50
* 선택한 풀을 나타냅니다

표 2. SIB 선정 및 Expression 복제는 (10 % foxe3 식에 대한 긍정적 인 36 % 사이의 범위) 각 동물 캡 분석에서 응답의 가장 높은 수준으로 풀이 한 클론으로 활동 범위를 좁힐 수있는 다음 실험에 사용하기 위해 선정되었다. 결과. 별표는 선택한 풀을 나타냅니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

유능한 외배엽에서 반응을 유도 할 수있는 유전자의 기능적 클로닝 여기 기재된 방법은 유전자 산물의 넓은 범위를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 표현의 복제 기술과 조직 유도 분석을 결합하여 과거의 일에 확장합니다. 우리는 RNA 주입 다음, 직접 또는 간접적으로 유도 인자의 생성 소스로서 제노 푸스 난 모세포의 대사 경로를 이용한다. 이것은, 관심 cDNA 라이브러리 또는 클론의 다른 컬렉션으로부터 발생 전 사체의 발현을 사용하여 6,7의 유전자를 클로닝하기위한 확립 된 방법의 사용과 조합하여 배아 관련된 새로운 관심의 유전자를 동정하고자하는 사람들에게 유용한 방법을 제공한다 유도. 새로운 유전자의 기능 식별이 방법의 광범위한 적용은 흥미로운 새로운 역 유전 적 접근 방법에 대한 유용한 보완하고, 또한 높은 THR 사용하여 확인 시험 성적 증명서를 기능적하는 데 사용할 수 있습니다oughput (예 : RNA-서열 등)의 방법 (21).

컨트롤 캡 분석에 사용 된 난자의 신진 대사 기능을 모니터링에서 중요하다. 둘 INHBB 테스트 한 중배엽 유도제의 mRNA의 농도를 변화, 각 배치의 난자와 미량 사체를 검출하기 위해,이 시스템의 유용성을 확립의 상태를 확인하는 단계; 이 유전자는 렌즈 유도 경로에 무관하고 잘 문서화 독립적으로 제어 (14)이다. 2 관찰되었다 1백1분의 12 항체 동물 캡 외배엽 근육 특이 항원의 발현에 의해 분석, 활성을 근육 유도 - 짝수의 존재하에, 200 PG INHBB mRNA의 과잉 스테이지 (14)의 폴리 (A)를 500 배 + RNA. 주입 시스템은 RNA 량의 매우 넓은 범위에 걸쳐 따라서 유용하고, 난자 안정적 단백질을 생산하고, 50 NL 이상의 볼륨 세포질 주입 다음 생존 유지 할 수있다.

U에 대한 하나의 고려 사항이 프로토콜의 cDNA 라이브러리의 SE는 전체 길이 또는 거의 전체 길이 클론의 필요성이다. 프로토콜에 사용하기 전에, 라이브러리는 라이브러리의 공지 된 전 사체의 크기를 결정하고, 따라서 도미넌트 네거티브 효과가 잘릴 가능성이 주입 전 사체로부터 획득되는 가능성을 줄이기 위해 노던 분석에 의해 검사한다. 전장 cDNA 풀에서 중요하기 ​​때문에, EST 클론의 사용은 22 또는 최적으로는, (검증 전장 클론의 완전한 세트를 제공한다) 제노 ORFeome 23 전통적인 cDNA 라이브러리로 바람직하다 건배! 및 조직 - 않는다면 cDNA를 특정 소스는 노력과 도서관 건설에 사용됩니다. 또 다른 고려 사항은 β-글로빈과 폴리 (A)에 주입 사체 mRNA의 안정성을 보강하기위한 라이브러리 벡터 서열의 존재이다. 이 주입의 mRNA로부터 생성 된 합성 단백질 량을 증가시키는 것이 바람직하지만, 또한 possibil 제기생체 내에서보다 안정하고 활성이 높은 mRNA의 발 우성 - 음성 효과를 제조 성만. 낮은 카피 수의 mRNA 전 사체의 큰 풀의 배경에서의 내인성 대조와 동일한 효과를 발휘할 수있다; 복제 및 전사 과정에서 안정화 한 캡 분석에서 검출 할 수 있도록 유지된다. 세 번째 문제는 풀 크기입니다 풀 크기의 상당한 감소 (10 클론 이하) 배아 (24)의 최근 이득의 기능 스크리닝 프로젝트에 유리한 것으로 입증 선명 결과와 후보 유전자를 쉽게 식별을 제공 할 가능성이있다. 10 (3)보다 작은 크기 풀 - 클론의 수집의 총 복잡도는 10 미만이면 4 ORFeome 23의 경우와 같이,이 프로토콜 추천 104은 달성; 그것은 엄청나게 노동 집약적에있을 수 있지만 하나는, 900의 10 풀로 시작 ~ 9,000 클론을 선별 할 수실험에서 10 개 이상의 풀을 처리합니다.

화면에서 확인 된 유전자에 의해 만들어진 (서열 분석에 의해) 유전자 생성물의 유형의 결정은 그것의 기능 테스트의 특성을 결정한다. 핵 전사 보조 인자가 우리의 화면 (8)에서 식별하므로, LDB1의 도입에 의해 트리거 유도 과정에서 핵의 역할을 확인하는 것이 필요했다. 탈핵 난자 완전히 작용 단백질 합성 기계를 가지고 생존 및 주입 전 사체로부터 분비 인자를 생성 할 수있다. 그러나, 핵의 부재는 전사 인자, 보조 인자, 또는 다른 간접적으로 작용하는 유전자 산물의 기능을 폐지 할 것이다. 화면에서 확인 된 유전자의 후속 분석은 현장 하이브리드에 의해 발달 식 패턴의 결정을 포함 기능 획득 및 손실의 기능 테스트합니다. 접합자 RNA 내로 주입하거나 주사 할 SP를 제한하여 과발현ecific 할구는 생체 내 전사에 대해 지시 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드의 주입을 통해 통찰력뿐만 아니라 유전자의 기능을 제공 할 수있는 최저 배아의 특정 영역에 미치는 영향을 제한한다.

크게 스크리닝 과정을 촉진하고 계내 혼성화에 의해 RNA의 발현 분석을위한 필요성을 제거 할 수있다 (예를 들면 GFP 등) 리포터 유전자 형질 전환 라인을 사용하여 응답 동물 캡 외배엽에서 유도 효과의 직접적인 시각화. 마찬가지로, 심사의 빠른 수단으로 항체의 사용이 바람직하다 경우 적절한 항체로 볼 수 있습니다 (위의 논의 근육 응답 1백1분의 12가 등). 알비노 배아 나은 색 반응 자극 시각화 야생형 색소 중 표백에 대한 필요성을 제거하여 원위치 혼성화 과정을 간소화 어려워 있지만 낭배 단계에서 정확하게 스테이지 동물 뚜껑에 사용될 수있다UCT.

마지막으로, 여러 가지 이유로, 시험 다수의 주어진 유전자를 확인하기 위해 수행 될 필요가있을 수 있음을 고려하는 것이 중요하다. 하나, 경우 하나의 수는 소정의 절차에서 합리적으로 프로세스는 다음과 같이, 심지어 배아 큰 배치하고있는 배양 그들을 온도까지의 범위에서 소정의 시간에 걸쳐 발생하는 현상 (및 능력의 최종 손실)에 의해 제한되어있다 잘 처리 외배엽의 작은 조각으로 발생할 수있는 손실. 또 다른 경우, 외배엽의 선택 마커의 발현의 성공률은 매우 낮은과 통계적으로 유의 한 효과를 관찰하기 위해 대부분의 경우 필요할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12/101 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 12/101 Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer Sigma S6639 for ISH
Acetic anhydride Sigma A6404 for ISH
Anti-Dig-AP Roche 11093274910 for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit Bio-Rad 732-6400 Plasmid DNA purification
Blocking Reagent Roche 11096176001 for ISH
BM Purple Roche 11442074001 for ISH
Boekel Hybridization Oven Fisher Scientific 13-245-121 for ISH
Bouin's Solution Sigma HT10132 for ISH
BSA Sigma A9647 for OCM
CHAPS Sigma C3023 for ISH
Collagenase A Roche 10103578001 Defolliculation of oocytes
Cysteine Sigma C121800 Dejelly embryos
DEPC-H2O Fisher Scientific BP5611 for ISH
Dig-RNA Labeling Mix Roche 11277073910 for ISH probes
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 500233 for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate Sigma A5040 MS222 anesthetic
Ficoll PM 400 Sigma F4375 for Injection media
Formamide Sigma F9037 for ISH
Gentamicin sulfate Sigma G1914 for OCM
Glass capillaries World Precision Instruments 4878 3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials Fisher Scientific 06-408B for ISH
Hair loop Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt Sigma H4784 for ISH
Injector Nanoliter 2010 World Precision Instruments Nanoliter 2010 Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean Carolina 972433 Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA Source Bioscience 989_IRBG cDNA library 
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin Teknova L5004 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth Teknova L8650 LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit New England BioLabs S1550S for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid Sigma M0375 for ISH
Manual Microfil Micromanipulator World Precision Instruments M3310R Manual micromanipulator
Nutating Mixer Fisher Scientific 22-363-152 Rocker for ISH
Permoplast Nasco SB33495M Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline Sigma P5368 for ISH
PMSG Sigma G4877 to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone Sigma PVP40 for ISH
Programmable Puller World Precision Instruments PUL-1000 Micropipette needle puller
Proteinase K Sigma P6556 for ISH
pTnT Vector Promega L5610 cDNA library construction
Riboprobe Combination System Promega P1450 in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit Life Technologies 18248013 kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk Fisher Scientific 19-037-516 Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA Sigma R3629 for ISH
Triethanolamine Sigma T1502 for ISH
Tween 20 Sigma P9416 for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System Promega C4360 alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration Source Bioscience 5055_XenORFeome ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells Agilent Technologies 200150 cells for transformation of cDNA library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
  2. Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
  3. Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
  4. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1, (12), 1273-1276 (2012).
  5. Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
  6. Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
  7. Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  8. Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243, (12), 1606-1618 (2014).
  9. Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
  10. Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  11. Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
  12. Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
  13. Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1, (5), 673-683 (1998).
  14. Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
  15. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. (2015).
  16. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. (2015).
  17. Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
  18. Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
  19. Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
  20. Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
  21. Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
  22. Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
  23. Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. e79469 (2013).
를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).More

Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter