Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены Университета Вирджинии Уходу за животными и использованию комитета.
Примечание: на фиг.1 показан схематический обзор экспериментальных процедур.
1. Подготовка ооцитов
- Предварительно премьер Х. Laevis самок с 150 U беременных Маре Сыворотка гонадотропин (PMSG) примерно за одну неделю до начала изоляции ооцитов. Вводите 1 мл 150 U / мл PMSG в спинной лимфатический мешок с 1 см стерильного шприца с иглой 29 G.
- Готовят растворы для инъекций ооцитов и ооцитов животного крышки анализа.
- Подготовка Ca ++ / Mg ++ -бесплатный OR 2 (OR2-): 82 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, 50 мМ HEPES рН 7,2.
- Подготовка OR 2: OR2- плюс 1 мМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2.
- Подготовьте OCM: 60% Лейбовиц L15, 0,4 мг / мл BSA, 100 мкг / мл гентамицина, рН 7,8.
- Заранеечистить 1x MBS: 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 5 мМ HEPES (рН 7,8), 2,5 мМ NaHCO 3.
- Подготовьте 3% Ficoll в 1x MBS.
- Приготовьте 1х NAM: 110 мм NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ Са (NO 3) 2, 1 мМ MgSO 4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaHCO 3, Na 2 мМ 3 PO 4, рН 7,4.
- Обезболить самку в 0,03% раствора этил 3-аминобензойной кислоты соли метансульфокислоты (MS222) в 0.1x MBS (первый растворить 0,3 г MS222 в 10 мл 95% -ного этанола, а затем разбавленной в 1 л 0,1 x MBS), поместив лягушки в растворе для 10 - 15 мин или до отвечать на запросы.
- Убедитесь, что анестезия является полным поворотом наркозом лягушку на спину, чтобы убедиться, что он не реагирует (полностью анестезию лягушки двигаться конечности или повернуть тело на).
- Хирургическим изолировать яичников фрагменты, сделав надрез в животе через кожу и стенки тела с лезвие скальпеля, изолируя ткани яичника с щипцамии ножницы. Поместите яичников фрагменты в OR2-. Закройте стенки тела с 3-0 шелковой нити на 24 мм изогнутой иглы и закрыть кожу отдельно с теми же швами. Разрешить восстановление женского в 1 г / л аквариумной соли в воде.
- Использование тонких щипцов, слезоточивый ткани яичника в малых (10 - 20 ооцитов) штук и передачи свежей OR2-.
- Defolliculate яичников фрагменты в 2,0 мг / мл коллагеназы А в OR2- перемешиванием осторожно шейкере в течение 1 ч, перенос на свежий коллагеназы и перемешивания в течение одного часа.
- Вымойте ооцитов в 10 раз OR2 [содержащие Са ++ / Mg ++], отбрасывая мелкие ооциты.
- Вымойте ооцитов в ОПК в два раза и перенести на свежий ОПК. Изолировать Стадия VI ооциты по размеру при визуальном осмотре и отбросить незрелых (меньше) ооцитов: Стадия VI ооциты больше незрелых ооцитов с еще пигментации в животном полушарии и примерно 1,2-1,4 мм в диаметре.
- Поддержание ооцитов на 18 - 20 ° C Iн ОЦМ перед инъекцией. Примечание: в агарозном покрытием чашки Петри могут быть использованы для минимизации прилипания ооцитов блюдо.
2. Инъекции библиотечных стенограммы
- Подготовьте направленного библиотека кДНК 15, используя РНК извлеченного на соответствующем этапе развития (например, нервная пластинка этап 14 10). Покупка библиотеки кДНК или построить одну использованием коммерческого набора в соответствии с информацией в четыре этапа ниже.
- Изолировать примерно 5 мкг мРНК, используя продукт для обогащения поли (А) + РНК (табл материалов) и в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: транскрипты, которые будут использоваться для получения библиотеки кДНК могут быть ограничены индуцирующего ткани (например, нервной пластинки, после микродиссекции желаемой ткани), или может быть из цельного эмбрионов на определенной стадии.
- Продукция кДНК с коммерческого набора, следуя указаниям изготовителя.
- Перевязывать примерно 20 нг кДНК в VectoR входит в коммерческого набора или другого подходящего вектора. Соответствующий плазмидный вектор включает последовательности мРНК для стабильности, такие как 5 'бета-глобина и 3 поли (А) последовательностей (шт.2 +, pTnT, pCS105).
- Transform перевязка в компетентные бактериальных клеток с использованием рекомендованный протокол поставщика для преобразования теплового шока.
Примечание: В качестве альтернативы, сборник открытой рамки считывания (ORFeome) клонов коммерчески доступен и может быть использован для создания транскриптов для инъекций.
- Подготовьте 10 бассейнов плазмид от 10 3 до 10 4 сложности (10 4 до 10 5 Общий сложности). Это представляет 10 пластин с 1000 - 10000 колоний каждого.
- Тарелка библиотека культуры на 10 15 см LB-ампициллин пластинах, растут 12 - 18 ч при 37 ° С, и собирать колонии друг от нежным давлением со стеклянной разбрасыватель в 7 мл LB.
- Подготовьте глицерине от 0,5 мл (добавить в 0,2 мл стерильной глицерина и хранят при -20 &# 730; С), и использовать оставшиеся 6,5 мл подготовить ДНК со стандартной коммерчески доступной ДНК минипрепаративную комплект следующим направлениям производителя.
- Линеаризации объединенного плазмидной ДНК (1,0 - 2,0 мкг) с соответствующим ферментом рестрикции переварить 16 при 37 ° С в течение 1 - 1,5 ч. Изолировать линеаризованной ДНК с экстракцией фенолом / хлороформом с последующим осаждением этанолом и ресуспендирования в воде согласно спецификациям набора РНК-полимеразы, используемой. Обобщить смысл РНК с коммерческого набора РНК-полимеразы следующим направлениям производителя.
- Подготовка иглы для микроинъекции (используя иглы съемник с стеклянной капиллярной трубки) приблизительно 20 мкм диаметром; измерения иглы советы по сложным микроскопом с калиброванной окулярного микрометра. Примечание: Настройки съемник иглы должны быть определены эмпирически для получения иглу с помощью тоненького кончика, что, когда порвал с тонким пинцетом дает нужный размер наконечника.
- Приготовьтесь (нажать глину вравномерным слоем на дне тарелки) глины выстроились 35 х 10 мм чашки Петри с параллельными канавками, чтобы держать ооцитов в месте во время микроинъекции; производить канавки с молл зонда или пипетки Пастера плавленого на кончике в пламени. В качестве альтернативы глины, подготовки агарозном блюда делает углубления с эластомерной плесени 17. Передача ооцитов с широким отверстием пипетки до 3% Ficoll в 1X MBS (примерно 2 мл) в строках в глиняных картонных блюд.
- Использование microinjector, заполните иглу с 1 нг / нл РНК и настроить баланс, чтобы произвести небольшое положительное давление (для предотвращения составления цитоплазме ооцита).
- Вводите ооциты с примерно 20 нл РНК в экваториальной области. Разрешить 1 час для инъекции ооцитов, чтобы остаться в Ficoll-MBS, а затем перенести мягко 1x MBS. Инкубировать в течение 8 - 24 часов при 20 ° С до животного крышки анализа.
3. Животное Кап Анализ
- Подготовьте 3 / 4x NAM и получить тонкий пинцет, цикл волос, изогнутые фрагменты покровное, глиняные картонных DISГЭС с чашеобразных углублений провести ооцитов. Сделать изогнутые фрагменты покровного по разваливается покровные стекла на мелкие фрагменты (примерно 1 - 2 мм х 2 - 4 мм) и не проходя через пламя до краев ногтей и свисать, создавая изогнутую часть.
- Оплодотворите X. Laevis яйца 18 через в пробирке или природного спаривания и культуры гаструлы (10 - 11 ч после оплодотворения при комнатной температуре) в 0.1x MBS до сортировать по сцене; собирать середине гаструла (этап 11 - 11,5) 10 эмбрионов.
- Эмбрионы перевод в чашке Петри примерно наполовину с 3/4-кратным ДН. Использование двух пар тонких щипцов, удалить оплодотворения (желточный) мембрану из гаструлы.
- Передача ооцитов 3 / 4x ДН (примерно 2 мл) в глиняных картонных блюд и иммобилизации в отдельных впечатлений в глине, производя впечатления для размещения индивидуальных эмбрионов в канавки были описаны выше.
- Эмбрионы передачи в глиняных картонных блюд и сократить шапки животных от гastrulae с помощью двух пар тонких щипцов. Позаботьтесь, чтобы изолировать животное колпачок эктодермы только и не экваториальный ткани 18.
- Поместите животное колпачок на животных полушарии каждого ооцита с внутренней поверхностью, контактирующей животного крышкой ооцит. Удержание рекомбинантов вместе с применением изогнутого стекла покровное фрагмент и применения понижающее давление на стекло, уплощение эктодермы, как покровное контактов глину (колпачки животное может оставаться открытой с внутренним слоем воздействию поверхности ооцита на 6 - 8 ч или больше ).
Примечание: В качестве альтернативы, поместите животное колпачок в глиняном отступа с его внутренней поверхности вверх и разместить яйцеклетки на крышке; обеспечить рекомбинантный с небольшими расширениями глины. - Культура в 20 ° С до контрольных эмбрионов не достигают желаемого почву для анализа.
- Отдельная рекомбинантный путем удаления покровное / глины и выделения эктодермы щипцами и петлей для волос.
- Fix эктодермальные фрагменты в течение 1 часа в MEMFA (3,8%формальдегида в MEM [М MOPS 0,1 рН 7,4, 2 мМ EGTA, 1 мМ и MgSO 4]).
- Фрагменты передачи (и эмбрионы управления) от MEMFA в этаноле и хранят при -20 ° С.
4. Анализ ответов в эктодермы по гибридизация (ISH)
- Готовят растворы для ISH.
- Подготовка 1X PBS: 0,01 М фосфатный буферный солевой раствор NaCl, 0,138 М, рН 7,4
- Подготовьте PBS-Tween (PTW): 1X PBS, 0,1% Tween-20
- Приготовьте раствор 100X Денхарта: 2% BSA, 2% поливинилпирролидон, 2% фиколл
- Подготовка гибридизации буфер: 50% формамида, 5x SSC, 1 мг / мл РНК дрожжей Torula, 1 мкг / мл гепарина, раствора 1x Денхарта, 0,1% Твин-20, 0,1% CHAPS, 10 мМ ЭДТА, DEPC-H 2 O
- Подготовьте малеиновой кислоты буфера (МАВ): 100 мм малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, рН 7,5
- Подготовка МАБ + блок: МАБ, 2% блокирующий реагент (тепла до 60 ° С, чтобы растворить)
- Подготовка щелочной фосфатазы (AP) буфера: 100 мМ ТрисрН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Твин, дН 2 O
- Подготовка РНК зонд.
- Использование коммерческого набора РНК-полимеразы и рыть-NTP смесь, добавить 1,5 мл трубки (50 мкл реакции): 25,5 мкл DEPC-H 2 O, 10 мкл 5X транскрипции буфера, 2,5 мкл 10х DIG-NTP смесь, 5 мкл 100 мМ ДТТ, 2 мкл Rnasin, 2 мкл ДНК-матрице линеаризованной (~ 1 мкг / мкл), 3 мкл РНК-полимеразы и инкубируют 37 ° С в течение 90 мин.
- Добавить 2 мкл РНК-полимеразы и инкубировать 37 ° C в течение 60 мин.
- Проверка 2 мкл реакции на 1% агарозном геле.
- Добавить 1 мкл RQ1 РНКазы ДНКазы и инкубировать 37 ° C в течение 20 мин.
- Осадок зонд путем добавления 50 мкл DEPC-H 2 O, 25 мкл 10 М ацетата аммония и 313 мкл этанола. Хранить при -20 ° С в течение ночи (O / N) затем восстановить РНК центрифугированием при 13800 х г в течение 20 мин. Промыть 500 мкл 75% этанола, кратко спина, удалитьэтанол и позволяют гранулы высохнуть на воздухе. Добавить 50 мкл DEPC-H 2 O.
- Добавить гибридизации буфер до конечной концентрации ~ 0,5 мкг / мкл.
- Подготовка ткани для гибридизации. Если не указано иное, заполнения флаконов на вершину с каждым изменением Решение, описанное (приблизительно 4 мл).
- Удалить этанола из флаконов и эмбрионов передачи в 75% этанола / PTW, то 50% этанол / PTW в течение 10 мин каждый, горизонтально на качалке.
- Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
- Трансфер до 10 мкг / мкл протеиназы К лечения в PTW; рок трубки вертикально 15 мин.
- Промыть два раза 10 минут каждый в 0,1 М триэтаноламин рН 7,8 - рок труб по вертикали.
- Добавить 12,5 мкл уксусного ангидрида в пробирки и рок вертикально 5 мин. Повторите с дополнительной уксусного ангидрида 12,5 мкл в течение 5 мин.
- Стирать в PTW 5 мин на рокера вертикально.
- Refix в 4% параформальдегид 20 мин на качалке. Тепло Гибридизация буфера60 ° C.
- Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
- Удалить все, но ~ 1 мл PTW из каждой пробирки и добавить 250 мкл Hyb буфера; нежно вихревой трубы, чтобы перемешать. Рок трубы вертикально 5 мин.
- Замените 60 ° Hyb буфера (0,5 мл) и перемешивают осторожно в 60 ˚C 10 мин. Замените свежим Hyb буфера и агитировать на 60 ˚C два 4 ч.
- Тепло зонд (1 мл на 0,5 мкг / мкл в буфере Hyb) до 60 ° С (3 мин). Удалить Hyb буфера и добавить зонд труб. Перемешайте осторожно O / N на 60 ° C.
- Подготовка ткани для антитела.
- Теплый Hyb буфера и 2x SSC + 0,1% Tween-20 решения 60 °.
- Заменить зонд решение с Hyb буфера (сохранить зондов при -20 ° С в течение 2 - 3 раза повторного). Мыть в 60 ° С в течение 10 мин.
- Вымойте три раза при 60 ° С в 2х SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
- Вымойте три раза при 60 ° С в 0,2 x SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
- Вымойте два раза в МАБ (RT) в течение 15 мин каждый горизонтально на качалке.
- Добавить 1 мл МАБ + блок. Вымойте 2 ч вертикально на качалке.
- Трансфер в 1 мл МАБ + блока, содержащего 1/2000 Anti-дигоксигенин-AP. Rock вертикально в 4 CO / N.
- Подготовка ткани для цвета реагента.
- Заменить раствор антител с МАБ; мыть три раза в МАБ 5 мин каждый горизонтально на качалке.
- Вымойте три раза в МАБ 1 час каждый горизонтально на качалке.
- Вымойте два раза в AP буфера 10 мин каждый горизонтально на качалке.
- Передача ткани многократного а пластиковый лоток, удалить AP буфером и BM Фиолетовый реагента (~ 1 мл). Разрешить протекания реакции в темно-5 мин до O / N.
- При необходимости окрашивания достигается, трансфер ткани флаконов PTW. Вымойте два раза 10 минут в каждом PTW на качалке.
- Fix в растворе Буэна в 4 CO / N на качалке.
- Промойте Буэна с тремя 70% этанола / 30% PTW моет при комнатной температуре. Действуйте тО захвата изображения с помощью эпи-освещение и микроскопа монтажа камеры, отбеливание, при необходимости, 18 лет.
5. Сиб Выбор и клонирование
- Выберите бассейн с высокой активностью (наибольший резонанс в ткани эктодермы).
- Титрование (разбавить LB для соответствующей плотности) в глицерине для бассейна с высокой активностью и пластины из десяти новых пластин с примерно одной десятой колонии от предыдущей стадии (с использованием раздел 2 в протоколе выше).
- Уменьшить размер пула, пока деятельность не прослеживается в одной колонии.
- Получение ДНК-последовательность, с использованием стандартных праймеров в векторе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В ответ на экспрессию мРНК введенного в ооцитах, отвечая животных колпачок ткань анализировали на экспрессию Otx2 от гибридизация (рисунок 2 и таблица 1); Otx2 выражается в предполагаемый линзы эктодермы (PLE) от закрытия нервной трубки через объектив плакоде утолщение 19. Однако, поскольку Otx2 выражается также в передней части нервной эктодермы, а также не-нервной головной эктодермы вне PLE, это связано как с нервной и плакод ответов. Использование foxe3 для скрининга библиотеки для генного продукта, способного продуцировать ответ объектива-индуктивный объективом компетентных животных крышки эктодермы позволило более конкретный подход к цели экспрессионного клонирования, так foxe3 выражается в PLE от нервной пластинки этапы и всей линзы формирования пузырьков 20, присутствующие в соседних регионах плакод, но отсутствует в neuroectoder м. Используя выражение Клонирование и протокол отбора родство выше и инъекционных пулы библиотеки транскриптов, ген способен производить foxe3 выражение в крышках животных был выделен (таблица 2). После выделения клона, 179 дополнительных анализов животных шапка, используя ооциты инъецированные библиотеки транскриптов были обследованы на выражение foxe3; 50 были положительными (28%). Из 140 животных капитализации части размещенных на неинъецированных ооцитов, 0 были положительными (Рисунок 3).
Рисунок 1. ооцитов животного крышка анализа и экспрессия Клонирование Схематический обзор протокола:. Транскрипты получают из библиотеки клонов и вводили в ооциты, животное колпачок эктодерма культивировали с ооцитов, а затем анализировали на экспрессию гена, индуцированного в гибридизация. д / 53518 / 53518fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Типичные результаты животных Кап анализе следующие мРНК инъекций и в гибридизация для Otx2. (AB) представитель следствием индуктивной ответ на dorsalized этап 14 поли (А) + РНК в шапках животных, анализировали на Otx2 выражения по всей горе на месте гибридизации. (A) животных шапки, размещенные на неинъецированных ооцитов на стадии 10.5 и культивировали до стадии 25. (B) Стадия 10.5 шапки животных, размещенные на ооциты вводят 10 нг РНК и культивировали в стадии 25. Otx2 выражение наблюдаемой в 6/7 случаев и, указанном наконечники стрел. Bar = 500 мкм. "Целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Типичные результаты анализа животных Кап следующее гибридизация для Foxe3. (AC) Типичные шапки животных от капитализации анализов ооцитов и животных, протестированных на выражение foxe3 по гибридизация. (А) Стадия 11-11,5 животных шапки, размещенные на ldb1 впрыском ооцитов и культивировали до стадии 23. foxe3 выражения обозначается стрелками. (Б) Стадия 11-11,5 животных шапки, размещенные на неинъецированных ооцитов и культивировали до стадии 23; ни одно выражение foxe3 не обнаружено. (С) Разрез foxe3 -положительным индуцированной животных колпачок с указанием экспрессии в внутреннего и наружного слоев эктодермы. Бары = 500 мкм.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Введенный РНК | Положительные случаи | Ген | % |
| Стадия 14 dorsalized мРНК, 10 нг | 12/24 | Otx2 | 50 |
| Библиотека бассейны 10 5 клонов, 20 нг | 3/9 | Otx2 | 33 |
| Библиотека бассейны 10 5 до 10 0 Клон ES, 20 нг | 50/179 | foxe3 | 28 |
| Никто | 0/140 | foxe3 | 0 |
Таблица 1. Яйцеклетка-Кап животных Анализ результатов Результаты животное колпачок анализа оценивается в гибридизация с Otx2 и foxe3, используя ооциты инъецированные мРНК или транскриптов, синтезированных из кДНК библиотеки бассейнов. или неинъецированных ооциты.
| Введенный РНК | Бассейн обозначение / выбор | Положительный выражение foxe3 |
| 2/4 | ||
| B * | 4/28 | |
| С | 4/44 | |
| Библиотека бассейны 10 4 клонов, 20 нг | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3/14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 1/20 | |
| 7 | 3/23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5/20 | |
| Библиотека бассейны 5000 клонов, 20 нг | 1 | 0/7 |
| 2 * | 5/16 | |
| 3 | 1/7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| Библиотека бассейны 70-200 колоний, 20 нг | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1/10 | |
| 4 * | 1/10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| Библиотека бассейны 20 колоний, 20 нг | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7/21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, М7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1/10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| К2, К5, L2, L5, М8, М11 | 0/10 | |
| К3, К6, L3, L6, М9, М12 | 0/9 | |
| К4, L1, L4, М7, М10, N7, N8 | 1/9 | |
| Библиотека РНК, 20 нг | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3/10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| Библиотека РНК, 20 нг | L1 (ldb1) подтверждение | 50/179 |
| * Указывает выбранный бассейн |
Таблица 2. Сиб Выбор и Expression Клонирование Результаты. Бассейн с самым высоким уровнем ответа у каждого животного крышки анализа (в диапазоне от 10% до 36% положительного для выражения foxe3) был выбран для использования в следующем эксперименте сузить деятельность на одного клона. Звездочка указывает выбранный бассейн.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Способ, описанный здесь, для функционального клонирования генов, способных индуцировать ответ в компетентный эктодермы может быть использован, чтобы идентифицировать широкий спектр продуктов генов. Этот метод расширяет прошлой работе путем объединения ткани вызывающие анализы методов с выражением клонирования. Мы используем метаболических путей ооцита Xenopus в качестве источника производства индуцировать факторы, прямо или косвенно, после инъекции РНК. Это, в сочетании с использованием известных методов для клонирования гена интереса 6,7 с помощью экспрессии транскриптов, полученных из библиотеки кДНК или другого сбора клонов, представляет собой ценный подход для тех, кто для идентификации генов, участвующих нового интереса в эмбриональных индукция. Широкой применимости этого метода к функциональной идентификации новых генов является полезным дополнением к захватывающих новых подходов обратного генетических, а также может быть использована для функционального тестирования транскрипты идентифицированы с использованием высокого Throughput методы (такие как РНК-SEQ) 21.
Управление важны при мониторинге метаболическую функцию ооцитов, использованных в тесте крышки. И для обеспечения здоровья каждой партии ооцитов и установить полезность этой системы для выявления низкого обилия транскриптов, различной концентрации мРНК мезодермы индуктора INHBB были протестированы; этот ген не связан с объектив индукции пути и хорошо документированы независимый контроль 14. Мышцы-индуцирующей активности, анализировали с помощью экспрессии мышечных антигенов в животное колпачок эктодермы с антителом 12/101, наблюдалось с 2 - 200 мкг мРНК INHBB, даже в присутствии 500-кратного избытка этап 14 поли (А) + РНК. Система, таким образом, полезны в очень широком диапазоне количества впрыскиваемого РНК, и ооциты могут стабильно производить белок и остаются жизнеспособными следующие цитоплазматической инъекции объемах 50 нл и выше.
Одним из факторов для USE библиотеки кДНК в этом протоколе является необходимость полной длины или почти клонов полной длины. Перед использованием в протоколе, библиотека должна быть рассмотрена Нозерн-анализа, чтобы определить размер транскриптов известных в библиотеке и, следовательно, уменьшить вероятность того, что доминантно-негативного воздействия получены из потенциально усеченных вводили транскриптов. Так бассейн полнометражный кДНК важно, использование EST клонов 22 или оптимально, то у Xenopus ORFeome 23 (который предоставляет полный набор проверенных полнометражных клонов) предпочтительнее традиционного библиотеки кДНК не если только этап- и ткане Специфическим источником кДНК ищутся и используются для строительства библиотеки. Другим аспектом является наличие бета-глобина и поли (А) последовательностей в библиотеке вектора, предназначенного для увеличения стабильности мРНК в инъекции транскриптов. Хотя это желательно увеличить количество белка, полученного из синтетического впрыскиваемого мРНК, это также повышает Возможность поисканость производить доминантно-негативный эффект от мРНК, которая выше, в стабильности и активности, чем в естественных условиях. Низкий-копия номер мРНК может не оказывает тот же эффект, как его эндогенного коллегой на фоне большого бассейна транскриптов; который стабилизирован в процессе клонирования и транскрипции может сохраняться, чтобы обнаружить в крышке анализа. Третья проблема заключается размер пула; значительное сокращение размера пула (10 клонов или меньше) была продемонстрирована быть выгодно в последние усиления в-функции скрининга эмбрионов проектов в 24 и, скорее всего, для обеспечения более четкие результаты и легче идентифицировать гены-кандидаты. Меньший размер пула, чем 10 3 - 10 4 рекомендуется в данном протоколе достижимо, если общая сложность сбора клонов составляет менее 10 4, как и в случае с ORFeome 23; можно экранировать ~ 9000 клонов, начиная с 10 бассейнами 900, хотя это может быть слишком трудоемкимобрабатывать более 10 бассейнов в качестве эксперимента.
Определение типа генного продукта (с помощью анализа последовательности), сделанного гена, идентифицированного в экране определяет характер испытаний своей функции. Поскольку ядерная транскрипции кофактором был выявлен в нашем экране 8, нужно было подтвердить роль ядра в процессе индуктивного вызванного введением ldb1. Энуклеированным ооциты есть полностью функционирующий белок синтетический оборудование и жизнеспособны и способны производить секретируемые факторы от введенных транскриптов. Тем не менее, отсутствие ядра отменит функционирование транскрипционных факторов, кофакторов или других косвенно действующих генных продуктов. Последующие анализы генов, идентифицированных на экране включают в себя определение развития паттерна экспрессии по гибридизация и получить-из-функции и с потерей функции-тестов. Избыточная экспрессия путем инъекции РНК в зигот или путем ограничения инъекции Specific бластомеры ограничить его воздействие на отдельных регионах эмбриона может дать представление, а также нокдаун функции гена с помощью инъекции морфолино олигонуклеотидов, направленных против ин виво транскрипта.
Прямая визуализация индуктивного эффекта в отвечающего животных крышки эктодермы с использованием трансгенной линии с геном-репортером (например, GFP) может в значительной степени ускорить процесс скрининга, и устранить необходимость в анализе экспрессии РНК в гибридизация. Аналогично, использование антител в качестве более быстрого скрининга средства желательно, если соответствующий антитела (например, 12/101 для мышечной реакции выше) имеется. Альбино эмбрионы могут быть использованы для крышек животных, которые, хотя и более сложно этапе точно на гаструлы, упорядочить процесс на месте гибридизации, устраняя необходимость для любого отбеливания дикого типа пигментации, чтобы лучше визуализировать цвет реакции ПродЕТТ.
Наконец, важно учитывать, что в силу ряда причин, большое количество исследований, возможно, потребуется проводится с целью выявления данного гена. С одной стороны, число случаев можно обоснованно процесс в данном суде ограничивается развития (и в конечном итоге потери компетенции), что происходит с течением времени даже при большой партии эмбрионов и диапазон температур, при котором к культуре их, как а также потери, которые могут возникнуть из маленьких кусочков эктодермы в обработке. С другой стороны, уровень успеха экспрессии выбранного маркера в эктодермы может быть очень низкой и требуют много случаев для наблюдения статистически значимого эффекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
- Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
- Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
- Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243 (12), 1606-1618 (2014).
- Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
- Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
- Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
- Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1 (5), 673-683 (1998).
- Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
- Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
- Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
- Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
- Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
- Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
- Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. , e79469 (2013).
