Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Функциональная Клонирование Использование doi: 10.3791/53518 Published: January 30, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все экспериментальные процедуры были одобрены Университета Вирджинии Уходу за животными и использованию комитета.

Примечание: на фиг.1 показан схематический обзор экспериментальных процедур.

1. Подготовка ооцитов

  1. Предварительно премьер Х. Laevis самок с 150 U беременных Маре Сыворотка гонадотропин (PMSG) примерно за одну неделю до начала изоляции ооцитов. Вводите 1 мл 150 U / мл PMSG в спинной лимфатический мешок с 1 см стерильного шприца с иглой 29 G.
  2. Готовят растворы для инъекций ооцитов и ооцитов животного крышки анализа.
    1. Подготовка Ca ++ / Mg ++ -бесплатный OR 2 (OR2-): 82 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, 50 мМ HEPES рН 7,2.
    2. Подготовка OR 2: OR2- плюс 1 мМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2.
    3. Подготовьте OCM: 60% Лейбовиц L15, 0,4 мг / мл BSA, 100 мкг / мл гентамицина, рН 7,8.
    4. Заранеечистить 1x MBS: 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 5 мМ HEPES (рН 7,8), 2,5 мМ NaHCO 3.
    5. Подготовьте 3% Ficoll в 1x MBS.
    6. Приготовьте 1х NAM: 110 мм NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ Са (NO 3) 2, 1 мМ MgSO 4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ NaHCO 3, Na 2 мМ 3 PO 4, рН 7,4.
  3. Обезболить самку в 0,03% раствора этил 3-аминобензойной кислоты соли метансульфокислоты (MS222) в 0.1x MBS (первый растворить 0,3 г MS222 в 10 мл 95% -ного этанола, а затем разбавленной в 1 л 0,1 x MBS), поместив лягушки в растворе для 10 - 15 мин или до отвечать на запросы.
    1. Убедитесь, что анестезия является полным поворотом наркозом лягушку на спину, чтобы убедиться, что он не реагирует (полностью анестезию лягушки двигаться конечности или повернуть тело на).
  4. Хирургическим изолировать яичников фрагменты, сделав надрез в животе через кожу и стенки тела с лезвие скальпеля, изолируя ткани яичника с щипцамии ножницы. Поместите яичников фрагменты в OR2-. Закройте стенки тела с 3-0 шелковой нити на 24 мм изогнутой иглы и закрыть кожу отдельно с теми же швами. Разрешить восстановление женского в 1 г / л аквариумной соли в воде.
  5. Использование тонких щипцов, слезоточивый ткани яичника в малых (10 - 20 ооцитов) штук и передачи свежей OR2-.
  6. Defolliculate яичников фрагменты в 2,0 мг / мл коллагеназы А в OR2- перемешиванием осторожно шейкере в течение 1 ч, перенос на свежий коллагеназы и перемешивания в течение одного часа.
  7. Вымойте ооцитов в 10 раз OR2 [содержащие Са ++ / Mg ++], отбрасывая мелкие ооциты.
  8. Вымойте ооцитов в ОПК в два раза и перенести на свежий ОПК. Изолировать Стадия VI ооциты по размеру при визуальном осмотре и отбросить незрелых (меньше) ооцитов: Стадия VI ооциты больше незрелых ооцитов с еще пигментации в животном полушарии и примерно 1,2-1,4 мм в диаметре.
  9. Поддержание ооцитов на 18 - 20 ° C Iн ОЦМ перед инъекцией. Примечание: в агарозном покрытием чашки Петри могут быть использованы для минимизации прилипания ооцитов блюдо.

2. Инъекции библиотечных стенограммы

  1. Подготовьте направленного библиотека кДНК 15, используя РНК извлеченного на соответствующем этапе развития (например, нервная пластинка этап 14 10). Покупка библиотеки кДНК или построить одну использованием коммерческого набора в соответствии с информацией в четыре этапа ниже.
    1. Изолировать примерно 5 мкг мРНК, используя продукт для обогащения поли (А) + РНК (табл материалов) и в соответствии с инструкциями изготовителя. Примечание: транскрипты, которые будут использоваться для получения библиотеки кДНК могут быть ограничены индуцирующего ткани (например, нервной пластинки, после микродиссекции желаемой ткани), или может быть из цельного эмбрионов на определенной стадии.
    2. Продукция кДНК с коммерческого набора, следуя указаниям изготовителя.
    3. Перевязывать примерно 20 нг кДНК в VectoR входит в коммерческого набора или другого подходящего вектора. Соответствующий плазмидный вектор включает последовательности мРНК для стабильности, такие как 5 'бета-глобина и 3 поли (А) последовательностей (шт.2 +, pTnT, pCS105).
    4. Transform перевязка в компетентные бактериальных клеток с использованием рекомендованный протокол поставщика для преобразования теплового шока.
      Примечание: В качестве альтернативы, сборник открытой рамки считывания (ORFeome) клонов коммерчески доступен и может быть использован для создания транскриптов для инъекций.
  2. Подготовьте 10 бассейнов плазмид от 10 3 до 10 4 сложности (10 4 до 10 5 Общий сложности). Это представляет 10 пластин с 1000 - 10000 колоний каждого.
    1. Тарелка библиотека культуры на 10 15 см LB-ампициллин пластинах, растут 12 - 18 ч при 37 ° С, и собирать колонии друг от нежным давлением со стеклянной разбрасыватель в 7 мл LB.
    2. Подготовьте глицерине от 0,5 мл (добавить в 0,2 мл стерильной глицерина и хранят при -20 &# 730; С), и использовать оставшиеся 6,5 мл подготовить ДНК со стандартной коммерчески доступной ДНК минипрепаративную комплект следующим направлениям производителя.
  3. Линеаризации объединенного плазмидной ДНК (1,0 - 2,0 мкг) с соответствующим ферментом рестрикции переварить 16 при 37 ° С в течение 1 - 1,5 ч. Изолировать линеаризованной ДНК с экстракцией фенолом / хлороформом с последующим осаждением этанолом и ресуспендирования в воде согласно спецификациям набора РНК-полимеразы, используемой. Обобщить смысл РНК с коммерческого набора РНК-полимеразы следующим направлениям производителя.
  4. Подготовка иглы для микроинъекции (используя иглы съемник с стеклянной капиллярной трубки) приблизительно 20 мкм диаметром; измерения иглы советы по сложным микроскопом с калиброванной окулярного микрометра. Примечание: Настройки съемник иглы должны быть определены эмпирически для получения иглу с помощью тоненького кончика, что, когда порвал с тонким пинцетом дает нужный размер наконечника.
  5. Приготовьтесь (нажать глину вравномерным слоем на дне тарелки) глины выстроились 35 х 10 мм чашки Петри с параллельными канавками, чтобы держать ооцитов в месте во время микроинъекции; производить канавки с молл зонда или пипетки Пастера плавленого на кончике в пламени. В качестве альтернативы глины, подготовки агарозном блюда делает углубления с эластомерной плесени 17. Передача ооцитов с широким отверстием пипетки до 3% Ficoll в 1X MBS (примерно 2 мл) в строках в глиняных картонных блюд.
  6. Использование microinjector, заполните иглу с 1 нг / нл РНК и настроить баланс, чтобы произвести небольшое положительное давление (для предотвращения составления цитоплазме ооцита).
  7. Вводите ооциты с примерно 20 нл РНК в экваториальной области. Разрешить 1 час для инъекции ооцитов, чтобы остаться в Ficoll-MBS, а затем перенести мягко 1x MBS. Инкубировать в течение 8 - 24 часов при 20 ° С до животного крышки анализа.

3. Животное Кап Анализ

  1. Подготовьте 3 / 4x NAM и получить тонкий пинцет, цикл волос, изогнутые фрагменты покровное, глиняные картонных DISГЭС с чашеобразных углублений провести ооцитов. Сделать изогнутые фрагменты покровного по разваливается покровные стекла на мелкие фрагменты (примерно 1 - 2 мм х 2 - 4 мм) и не проходя через пламя до краев ногтей и свисать, создавая изогнутую часть.
  2. Оплодотворите X. Laevis яйца 18 через в пробирке или природного спаривания и культуры гаструлы (10 - 11 ч после оплодотворения при комнатной температуре) в 0.1x MBS до сортировать по сцене; собирать середине гаструла (этап 11 - 11,5) 10 эмбрионов.
  3. Эмбрионы перевод в чашке Петри примерно наполовину с 3/4-кратным ДН. Использование двух пар тонких щипцов, удалить оплодотворения (желточный) мембрану из гаструлы.
  4. Передача ооцитов 3 / 4x ДН (примерно 2 мл) в глиняных картонных блюд и иммобилизации в отдельных впечатлений в глине, производя впечатления для размещения индивидуальных эмбрионов в канавки были описаны выше.
  5. Эмбрионы передачи в глиняных картонных блюд и сократить шапки животных от гastrulae с помощью двух пар тонких щипцов. Позаботьтесь, чтобы изолировать животное колпачок эктодермы только и не экваториальный ткани 18.
  6. Поместите животное колпачок на животных полушарии каждого ооцита с внутренней поверхностью, контактирующей животного крышкой ооцит. Удержание рекомбинантов вместе с применением изогнутого стекла покровное фрагмент и применения понижающее давление на стекло, уплощение эктодермы, как покровное контактов глину (колпачки животное может оставаться открытой с внутренним слоем воздействию поверхности ооцита на 6 - 8 ч или больше ).
    Примечание: В качестве альтернативы, поместите животное колпачок в глиняном отступа с его внутренней поверхности вверх и разместить яйцеклетки на крышке; обеспечить рекомбинантный с небольшими расширениями глины.
  7. Культура в 20 ° С до контрольных эмбрионов не достигают желаемого почву для анализа.
  8. Отдельная рекомбинантный путем удаления покровное / глины и выделения эктодермы щипцами и петлей для волос.
  9. Fix эктодермальные фрагменты в течение 1 часа в MEMFA (3,8%формальдегида в MEM [М MOPS 0,1 рН 7,4, 2 мМ EGTA, 1 мМ и MgSO 4]).
  10. Фрагменты передачи (и эмбрионы управления) от MEMFA в этаноле и хранят при -20 ° С.

4. Анализ ответов в эктодермы по гибридизация (ISH)

  1. Готовят растворы для ISH.
    1. Подготовка 1X PBS: 0,01 М фосфатный буферный солевой раствор NaCl, 0,138 М, рН 7,4
    2. Подготовьте PBS-Tween (PTW): 1X PBS, 0,1% Tween-20
    3. Приготовьте раствор 100X Денхарта: 2% BSA, 2% поливинилпирролидон, 2% фиколл
    4. Подготовка гибридизации буфер: 50% формамида, 5x SSC, 1 мг / мл РНК дрожжей Torula, 1 мкг / мл гепарина, раствора 1x Денхарта, 0,1% Твин-20, 0,1% CHAPS, 10 мМ ЭДТА, DEPC-H 2 O
    5. Подготовьте малеиновой кислоты буфера (МАВ): 100 мм малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, рН 7,5
    6. Подготовка МАБ + блок: МАБ, 2% блокирующий реагент (тепла до 60 ° С, чтобы растворить)
    7. Подготовка щелочной фосфатазы (AP) буфера: 100 мМ ТрисрН 9,5, 50 мМ MgCl 2, 100 мМ NaCl, 0,1% Твин, дН 2 O
  2. Подготовка РНК зонд.
    1. Использование коммерческого набора РНК-полимеразы и рыть-NTP смесь, добавить 1,5 мл трубки (50 мкл реакции): 25,5 мкл DEPC-H 2 O, 10 мкл 5X транскрипции буфера, 2,5 мкл 10х DIG-NTP смесь, 5 мкл 100 мМ ДТТ, 2 мкл Rnasin, 2 мкл ДНК-матрице линеаризованной (~ 1 мкг / мкл), 3 мкл РНК-полимеразы и инкубируют 37 ° С в течение 90 мин.
    2. Добавить 2 мкл РНК-полимеразы и инкубировать 37 ° C в течение 60 мин.
    3. Проверка 2 мкл реакции на 1% агарозном геле.
    4. Добавить 1 мкл RQ1 РНКазы ДНКазы и инкубировать 37 ° C в течение 20 мин.
    5. Осадок зонд путем добавления 50 мкл DEPC-H 2 O, 25 мкл 10 М ацетата аммония и 313 мкл этанола. Хранить при -20 ° С в течение ночи (O / N) затем восстановить РНК центрифугированием при 13800 х г в течение 20 мин. Промыть 500 мкл 75% этанола, кратко спина, удалитьэтанол и позволяют гранулы высохнуть на воздухе. Добавить 50 мкл DEPC-H 2 O.
    6. Добавить гибридизации буфер до конечной концентрации ~ 0,5 мкг / мкл.
  3. Подготовка ткани для гибридизации. Если не указано иное, заполнения флаконов на вершину с каждым изменением Решение, описанное (приблизительно 4 мл).
    1. Удалить этанола из флаконов и эмбрионов передачи в 75% этанола / PTW, то 50% этанол / PTW в течение 10 мин каждый, горизонтально на качалке.
    2. Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
    3. Трансфер до 10 мкг / мкл протеиназы К лечения в PTW; рок трубки вертикально 15 мин.
    4. Промыть два раза 10 минут каждый в 0,1 М триэтаноламин рН 7,8 - рок труб по вертикали.
    5. Добавить 12,5 мкл уксусного ангидрида в пробирки и рок вертикально 5 мин. Повторите с дополнительной уксусного ангидрида 12,5 мкл в течение 5 мин.
    6. Стирать в PTW 5 мин на рокера вертикально.
    7. Refix в 4% параформальдегид 20 мин на качалке. Тепло Гибридизация буфера60 ° C.
    8. Вымойте три раза в PTW в течение 5 мин каждый на качалке.
    9. Удалить все, но ~ 1 мл PTW из каждой пробирки и добавить 250 мкл Hyb буфера; нежно вихревой трубы, чтобы перемешать. Рок трубы вертикально 5 мин.
    10. Замените 60 ° Hyb буфера (0,5 мл) и перемешивают осторожно в 60 ˚C 10 мин. Замените свежим Hyb буфера и агитировать на 60 ˚C два 4 ч.
    11. Тепло зонд (1 мл на 0,5 мкг / мкл в буфере Hyb) до 60 ° С (3 мин). Удалить Hyb буфера и добавить зонд труб. Перемешайте осторожно O / N на 60 ° C.
  4. Подготовка ткани для антитела.
    1. Теплый Hyb буфера и 2x SSC + 0,1% Tween-20 решения 60 °.
    2. Заменить зонд решение с Hyb буфера (сохранить зондов при -20 ° С в течение 2 - 3 раза повторного). Мыть в 60 ° С в течение 10 мин.
    3. Вымойте три раза при 60 ° С в 2х SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
    4. Вымойте три раза при 60 ° С в 0,2 x SSC-Tween (20 мин каждый при перемешивании).
    5. Вымойте два раза в МАБ (RT) в течение 15 мин каждый горизонтально на качалке.
    6. Добавить 1 мл МАБ + блок. Вымойте 2 ч вертикально на качалке.
    7. Трансфер в 1 мл МАБ + блока, содержащего 1/2000 Anti-дигоксигенин-AP. Rock вертикально в 4 CO / N.
  5. Подготовка ткани для цвета реагента.
    1. Заменить раствор антител с МАБ; мыть три раза в МАБ 5 мин каждый горизонтально на качалке.
    2. Вымойте три раза в МАБ 1 час каждый горизонтально на качалке.
    3. Вымойте два раза в AP буфера 10 мин каждый горизонтально на качалке.
    4. Передача ткани многократного а пластиковый лоток, удалить AP буфером и BM Фиолетовый реагента (~ 1 мл). Разрешить протекания реакции в темно-5 мин до O / N.
    5. При необходимости окрашивания достигается, трансфер ткани флаконов PTW. Вымойте два раза 10 минут в каждом PTW на качалке.
    6. Fix в растворе Буэна в 4 CO / N на качалке.
    7. Промойте Буэна с тремя 70% этанола / 30% PTW моет при комнатной температуре. Действуйте тО захвата изображения с помощью эпи-освещение и микроскопа монтажа камеры, отбеливание, при необходимости, 18 лет.

5. Сиб Выбор и клонирование

  1. Выберите бассейн с высокой активностью (наибольший резонанс в ткани эктодермы).
  2. Титрование (разбавить LB для соответствующей плотности) в глицерине для бассейна с высокой активностью и пластины из десяти новых пластин с примерно одной десятой колонии от предыдущей стадии (с использованием раздел 2 в протоколе выше).
  3. Уменьшить размер пула, пока деятельность не прослеживается в одной колонии.
  4. Получение ДНК-последовательность, с использованием стандартных праймеров в векторе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В ответ на экспрессию мРНК введенного в ооцитах, отвечая животных колпачок ткань анализировали на экспрессию Otx2 от гибридизация (рисунок 2 и таблица 1); Otx2 выражается в предполагаемый линзы эктодермы (PLE) от закрытия нервной трубки через объектив плакоде утолщение 19. Однако, поскольку Otx2 выражается также в передней части нервной эктодермы, а также не-нервной головной эктодермы вне PLE, это связано как с нервной и плакод ответов. Использование foxe3 для скрининга библиотеки для генного продукта, способного продуцировать ответ объектива-индуктивный объективом компетентных животных крышки эктодермы позволило более конкретный подход к цели экспрессионного клонирования, так foxe3 выражается в PLE от нервной пластинки этапы и всей линзы формирования пузырьков 20, присутствующие в соседних регионах плакод, но отсутствует в neuroectoder м. Используя выражение Клонирование и протокол отбора родство выше и инъекционных пулы библиотеки транскриптов, ген способен производить foxe3 выражение в крышках животных был выделен (таблица 2). После выделения клона, 179 дополнительных анализов животных шапка, используя ооциты инъецированные библиотеки транскриптов были обследованы на выражение foxe3; 50 были положительными (28%). Из 140 животных капитализации части размещенных на неинъецированных ооцитов, 0 были положительными (Рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. ооцитов животного крышка анализа и экспрессия Клонирование Схематический обзор протокола:. Транскрипты получают из библиотеки клонов и вводили в ооциты, животное колпачок эктодерма культивировали с ооцитов, а затем анализировали на экспрессию гена, индуцированного в гибридизация. д / 53518 / 53518fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Типичные результаты животных Кап анализе следующие мРНК инъекций и в гибридизация для Otx2. (AB) представитель следствием индуктивной ответ на dorsalized этап 14 поли (А) + РНК в шапках животных, анализировали на Otx2 выражения по всей горе на месте гибридизации. (A) животных шапки, размещенные на неинъецированных ооцитов на стадии 10.5 и культивировали до стадии 25. (B) Стадия 10.5 шапки животных, размещенные на ооциты вводят 10 нг РНК и культивировали в стадии 25. Otx2 выражение наблюдаемой в 6/7 случаев и, указанном наконечники стрел. Bar = 500 мкм. "Целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Типичные результаты анализа животных Кап следующее гибридизация для Foxe3. (AC) Типичные шапки животных от капитализации анализов ооцитов и животных, протестированных на выражение foxe3 по гибридизация. (А) Стадия 11-11,5 животных шапки, размещенные на ldb1 впрыском ооцитов и культивировали до стадии 23. foxe3 выражения обозначается стрелками. (Б) Стадия 11-11,5 животных шапки, размещенные на неинъецированных ооцитов и культивировали до стадии 23; ни одно выражение foxe3 не обнаружено. (С) Разрез foxe3 -положительным индуцированной животных колпачок с указанием экспрессии в внутреннего и наружного слоев эктодермы. Бары = 500 мкм.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Введенный РНК Положительные случаи Ген %
Стадия 14 dorsalized мРНК, 10 нг 12/24 Otx2 50
Библиотека бассейны 10 5 клонов, 20 нг 3/9 Otx2 33
Библиотека бассейны 10 5 до 10 0 Клон ES, 20 нг 50/179 foxe3 28
Никто 0/140 foxe3 0

Таблица 1. Яйцеклетка-Кап животных Анализ результатов Результаты животное колпачок анализа оценивается в гибридизация с Otx2 и foxe3, используя ооциты инъецированные мРНК или транскриптов, синтезированных из кДНК библиотеки бассейнов. или неинъецированных ооциты.

восемь: 24px; "> Библиотека бассейны 10 5 клонов, 20 нг HT: 21px; "> Библиотека бассейны 400 клонов, 20 нг высота = "21" стиль = "высота: 21px;"> Библиотека бассейны 6 - 7 колоний, 20 нг 1px; ">
Введенный РНК Бассейн обозначение / выбор Положительный выражение foxe3
2/4
B * 4/28
С 4/44
Библиотека бассейны 10 4 клонов, 20 нг 1 0/11
2 0/10
3 3/14
4 0/12
5 0/15
6 1/20
7 3/23
8 0/16
9 0/16
10 * 5/20
Библиотека бассейны 5000 клонов, 20 нг 1 0/7
2 * 5/16
3 1/7
4 0/7
5 0/7
1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 0/10
5 * 8/26
6 0/11
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/8
Библиотека бассейны 70-200 колоний, 20 нг 1 0/8
2 0/10
3 * 1/10
4 * 1/10
5 0/10
6 0/9
7 0/10
8 0/10
Библиотека бассейны 20 колоний, 20 нг 1 0/10
2 0/10
3 0/10
4 * 7/21
5 0/10
6 0/10
7 0/10
8 0/10
9 0/10
10 0/10
K2-6, L1 0/10
L2-6, М7 0/10
M8-12, N7-8 0/10
K5-6, L1-4 1/10
L5-6, M7-10 0/10
M11-12, N7-8, K2-4 0/10
К2, К5, L2, L5, М8, М11 0/10
К3, К6, L3, L6, М9, М12 0/9
К4, L1, L4, М7, М10, N7, N8 1/9
Библиотека РНК, 20 нг K6 0/10
L1 * 3/10
L3 0/10
L4 0/10
Библиотека РНК, 20 нг L1 (ldb1) подтверждение 50/179
* Указывает выбранный бассейн

Таблица 2. Сиб Выбор и Expression Клонирование Результаты. Бассейн с самым высоким уровнем ответа у каждого животного крышки анализа (в диапазоне от 10% до 36% положительного для выражения foxe3) был выбран для использования в следующем эксперименте сузить деятельность на одного клона. Звездочка указывает выбранный бассейн.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Способ, описанный здесь, для функционального клонирования генов, способных индуцировать ответ в компетентный эктодермы может быть использован, чтобы идентифицировать широкий спектр продуктов генов. Этот метод расширяет прошлой работе путем объединения ткани вызывающие анализы методов с выражением клонирования. Мы используем метаболических путей ооцита Xenopus в качестве источника производства индуцировать факторы, прямо или косвенно, после инъекции РНК. Это, в сочетании с использованием известных методов для клонирования гена интереса 6,7 с помощью экспрессии транскриптов, полученных из библиотеки кДНК или другого сбора клонов, представляет собой ценный подход для тех, кто для идентификации генов, участвующих нового интереса в эмбриональных индукция. Широкой применимости этого метода к функциональной идентификации новых генов является полезным дополнением к захватывающих новых подходов обратного генетических, а также может быть использована для функционального тестирования транскрипты идентифицированы с использованием высокого Throughput методы (такие как РНК-SEQ) 21.

Управление важны при мониторинге метаболическую функцию ооцитов, использованных в тесте крышки. И для обеспечения здоровья каждой партии ооцитов и установить полезность этой системы для выявления низкого обилия транскриптов, различной концентрации мРНК мезодермы индуктора INHBB были протестированы; этот ген не связан с объектив индукции пути и хорошо документированы независимый контроль 14. Мышцы-индуцирующей активности, анализировали с помощью экспрессии мышечных антигенов в животное колпачок эктодермы с антителом 12/101, наблюдалось с 2 - 200 мкг мРНК INHBB, даже в присутствии 500-кратного избытка этап 14 поли (А) + РНК. Система, таким образом, полезны в очень широком диапазоне количества впрыскиваемого РНК, и ооциты могут стабильно производить белок и остаются жизнеспособными следующие цитоплазматической инъекции объемах 50 нл и выше.

Одним из факторов для USE библиотеки кДНК в этом протоколе является необходимость полной длины или почти клонов полной длины. Перед использованием в протоколе, библиотека должна быть рассмотрена Нозерн-анализа, чтобы определить размер транскриптов известных в библиотеке и, следовательно, уменьшить вероятность того, что доминантно-негативного воздействия получены из потенциально усеченных вводили транскриптов. Так бассейн полнометражный кДНК важно, использование EST клонов 22 или оптимально, то у Xenopus ORFeome 23 (который предоставляет полный набор проверенных полнометражных клонов) предпочтительнее традиционного библиотеки кДНК не если только этап- и ткане Специфическим источником кДНК ищутся и используются для строительства библиотеки. Другим аспектом является наличие бета-глобина и поли (А) последовательностей в библиотеке вектора, предназначенного для увеличения стабильности мРНК в инъекции транскриптов. Хотя это желательно увеличить количество белка, полученного из синтетического впрыскиваемого мРНК, это также повышает Возможность поисканость производить доминантно-негативный эффект от мРНК, которая выше, в стабильности и активности, чем в естественных условиях. Низкий-копия номер мРНК может не оказывает тот же эффект, как его эндогенного коллегой на фоне большого бассейна транскриптов; который стабилизирован в процессе клонирования и транскрипции может сохраняться, чтобы обнаружить в крышке анализа. Третья проблема заключается размер пула; значительное сокращение размера пула (10 клонов или меньше) была продемонстрирована быть выгодно в последние усиления в-функции скрининга эмбрионов проектов в 24 и, скорее всего, для обеспечения более четкие результаты и легче идентифицировать гены-кандидаты. Меньший размер пула, чем 10 3 - 10 4 рекомендуется в данном протоколе достижимо, если общая сложность сбора клонов составляет менее 10 4, как и в случае с ORFeome 23; можно экранировать ~ 9000 клонов, начиная с 10 бассейнами 900, хотя это может быть слишком трудоемкимобрабатывать более 10 бассейнов в качестве эксперимента.

Определение типа генного продукта (с помощью анализа последовательности), сделанного гена, идентифицированного в экране определяет характер испытаний своей функции. Поскольку ядерная транскрипции кофактором был выявлен в нашем экране 8, нужно было подтвердить роль ядра в процессе индуктивного вызванного введением ldb1. Энуклеированным ооциты есть полностью функционирующий белок синтетический оборудование и жизнеспособны и способны производить секретируемые факторы от введенных транскриптов. Тем не менее, отсутствие ядра отменит функционирование транскрипционных факторов, кофакторов или других косвенно действующих генных продуктов. Последующие анализы генов, идентифицированных на экране включают в себя определение развития паттерна экспрессии по гибридизация и получить-из-функции и с потерей функции-тестов. Избыточная экспрессия путем инъекции РНК в зигот или путем ограничения инъекции Specific бластомеры ограничить его воздействие на отдельных регионах эмбриона может дать представление, а также нокдаун функции гена с помощью инъекции морфолино олигонуклеотидов, направленных против ин виво транскрипта.

Прямая визуализация индуктивного эффекта в отвечающего животных крышки эктодермы с использованием трансгенной линии с геном-репортером (например, GFP) может в значительной степени ускорить процесс скрининга, и устранить необходимость в анализе экспрессии РНК в гибридизация. Аналогично, использование антител в качестве более быстрого скрининга средства желательно, если соответствующий антитела (например, 12/101 для мышечной реакции выше) имеется. Альбино эмбрионы могут быть использованы для крышек животных, которые, хотя и более сложно этапе точно на гаструлы, упорядочить процесс на месте гибридизации, устраняя необходимость для любого отбеливания дикого типа пигментации, чтобы лучше визуализировать цвет реакции ПродЕТТ.

Наконец, важно учитывать, что в силу ряда причин, большое количество исследований, возможно, потребуется проводится с целью выявления данного гена. С одной стороны, число случаев можно обоснованно процесс в данном суде ограничивается развития (и в конечном итоге потери компетенции), что происходит с течением времени даже при большой партии эмбрионов и диапазон температур, при котором к культуре их, как а также потери, которые могут возникнуть из маленьких кусочков эктодермы в обработке. С другой стороны, уровень успеха экспрессии выбранного маркера в эктодермы может быть очень низкой и требуют много случаев для наблюдения статистически значимого эффекта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12/101 Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 12/101 Monoclonal antibody for detection of muscle tissue
20x SSC Buffer Sigma S6639 for ISH
Acetic anhydride Sigma A6404 for ISH
Anti-Dig-AP Roche 11093274910 for ISH
Aurum Plasmid Mini Kit Bio-Rad 732-6400 Plasmid DNA purification
Blocking Reagent Roche 11096176001 for ISH
BM Purple Roche 11442074001 for ISH
Boekel Hybridization Oven Fisher Scientific 13-245-121 for ISH
Bouin's Solution Sigma HT10132 for ISH
BSA Sigma A9647 for OCM
CHAPS Sigma C3023 for ISH
Collagenase A Roche 10103578001 Defolliculation of oocytes
Cysteine Sigma C121800 Dejelly embryos
DEPC-H2O Fisher Scientific BP5611 for ISH
Dig-RNA Labeling Mix Roche 11277073910 for ISH probes
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 500233 for Vitelline envelope removal
Ethyl 3-aminobenzoate Sigma A5040 MS222 anesthetic
Ficoll PM 400 Sigma F4375 for Injection media
Formamide Sigma F9037 for ISH
Gentamicin sulfate Sigma G1914 for OCM
Glass capillaries World Precision Instruments 4878 3.5" long, I,D, 0.530 mm
Glass sample vials Fisher Scientific 06-408B for ISH
Hair loop Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation
Heparin sodium salt Sigma H4784 for ISH
Injector Nanoliter 2010 World Precision Instruments Nanoliter 2010 Microprocessor-controlled microinjector
Instant Ocean Carolina 972433 Aquarium Salt for frog recovery
IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA Source Bioscience 989_IRBG cDNA library 
LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin Teknova L5004 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection
LB Luria Broth Teknova L8650 LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures
Magnetic mRNA Isolation Kit New England BioLabs S1550S for isolation of poly(A)-enriched RNA
Maleic Acid Sigma M0375 for ISH
Manual Microfil Micromanipulator World Precision Instruments M3310R Manual micromanipulator
Nutating Mixer Fisher Scientific 22-363-152 Rocker for ISH
Permoplast Nasco SB33495M Clay for injection and dissection dishes
Phosphate Buffered Saline Sigma P5368 for ISH
PMSG Sigma G4877 to stimulate oocyte development
Polyvinylpyrrolidone Sigma PVP40 for ISH
Programmable Puller World Precision Instruments PUL-1000 Micropipette needle puller
Proteinase K Sigma P6556 for ISH
pTnT Vector Promega L5610 cDNA library construction
Riboprobe Combination System Promega P1450 in vitro transcription
Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit Life Technologies 18248013 kit for cDNA library construction
Sutures, 3-0 silk Fisher Scientific 19-037-516 Suture thread and needle for post-oocyte removal
Torula RNA Sigma R3629 for ISH
Triethanolamine Sigma T1502 for ISH
Tween 20 Sigma P9416 for ISH
Universal RiboClone cDNA Synthesis System Promega C4360 alternative kit for cDNA library construction
Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration Source Bioscience 5055_XenORFeome ORFeome Clones
XL2-Blue Ultracompetent Cells Agilent Technologies 200150 cells for transformation of cDNA library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
  2. Grainger, R. Xenopus tropicalis. as a Model Organism for Genetics and Genomics: Past, Present and Future. Methods in Molecular Biology. 917, 3-15 (2012).
  3. Nakayama, T., Fish, M., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G., Grainger, R. Simple and Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51, 835-843 (2013).
  4. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1, (12), 1273-1276 (2012).
  5. Zhao, Y., Ishibashi, S., Amaya, E. Reverse Genetic Studies Using Antisense Morpholino Oligonucleotides. Methods in Molecular Biology. 917, 143-154 (2012).
  6. Smith, W., Harland, R. Injected Xwnt-8. RNA acts early in Xenopus. embryos to promote formation of a vegetal dorsalizing center. Cell. 67, 753-765 (1991).
  7. Smith, W., Harland, R. Expression cloning of noggin., a new dorsalizing factor localized in the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  8. Plautz, C., Zirkle, B., Deshote, M., Grainger, R. Early stages of induction of anterior head ectodermal properties in Xenopus. embryos are mediated by transcriptional cofactor ldb1. Developmental Dynamics. 243, (12), 1606-1618 (2014).
  9. Servetnick, M., Grainger, R. Changes in neural and lens competence in Xenopus. ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Development. 112, 177-188 (1991).
  10. Nieuwkoop, P., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
  11. Lemaire, P., Garrett, N., Gurdon, J. Expression cloning of Siamois., a Xenopus. homeobox gene expressed in dorsal-vegetal cells of blastulae and able to induce a complete secondary axis. Cell. 81, 85-94 (1995).
  12. Lustig, K., Kroll, K., Sun, E., Kirschner, M. Expression cloning of a Xenopus T.-related gene (Xombi.) involved in mesodermal patterning and blastopore lip formation. Development. 122, 4001-4012 (1996).
  13. Hsu, D., Economides, A., Wang, X., Eimon, P., Harland, R. The Xenopus. dorsalizing factor Gremlin identifies a novel family of secreted proteins that antagonize BMP activities. Molecular Cell. 1, (5), 673-683 (1998).
  14. Lustig, K., Kirschner, M. Use of an oocyte expression assay to reconstitute inductive signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 6234-6238 (1995).
  15. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. (2015).
  16. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. JoVE Science Education Database. (2015).
  17. Viczian, A., Zuber, M. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932 (2010).
  18. Sive, H., Grainger, R., Harland, R. Early development of.Xenopus laevis.: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor. New York. (2000).
  19. Zygar, C., Cook, T., Grainger, R. Gene activation during early stages of lens induction in Xenopus. Development. 125, 3509-3519 (1998).
  20. Medina-Martinez, O., Jamrich, M. Foxe view of lens development and disease. Development. 134, 1455-1463 (2007).
  21. Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism. Methods. 66, 398-409 (2014).
  22. Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project. Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).
  23. Karpinka, J., et al. Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).
  24. Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PLoS ONE. e79469 (2013).
Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).More

Plautz, C. Z., Williams, H. C., Grainger, R. M. Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System. J. Vis. Exp. (107), e53518, doi:10.3791/53518 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter