Protocol
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Universidad de Virginia Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
Nota: La figura 1 muestra una vista general esquemática de los procedimientos experimentales.
1. Preparación de ovocitos
- X. Pre-prime laevis hembras con 150 U de Mare embarazada suero de gonadotropina (PMSG) aproximadamente una semana antes de que el aislamiento de los ovocitos. Inyectar 1 ml 150 U / ml PMSG en dorsal linfático salida con 1 cc jeringa estéril con 29 G aguja.
- Preparar soluciones para inyección de ovocitos y ensayo casquillo ovocito-animal.
- Preparar Ca ++ / Mg ++ exento de OR2 (OR2-): NaCl 82 mM, KCl 2,5 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2.
- Preparar OR2: OR2- más 1 mM CaCl2 y MgCl2 1 mM.
- Preparar OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 mg / ml de gentamicina, pH 7,8.
- Prepare MBS 1x: NaCl 88 mM, 1 mM de KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO 3.
- Preparar 3% de Ficoll en 1X MBS.
- Preparar NAM 1x: NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4.
- Anestesiar la hembra en una solución al 0,03% de acetato de sal metanosulfonato 3-aminobenzoato (MS222) en 0,1x MBS (primero disolver 0,3 g MS222 en etanol 10 ml de 95%, luego se diluye en 1 litro MBS 0,1x) mediante la colocación de rana en solución para 10-15 minutos o hasta que no responde.
- Compruebe que la anestesia es completa girando rana anestesiado sobre su espalda para asegurarse de que no responde (incompletamente ranas anestesiados mover las extremidades o girar el cuerpo más).
- Quirúrgicamente aislar fragmentos de ovario haciendo una incisión abdominal a través de la piel y la pared del cuerpo con hoja de bisturí, aislando tejido ovárico con pinzasy tijeras. Coloque fragmentos de ovario en OR2-. Cierre la pared del cuerpo con una sutura de seda 3-0 en una aguja curva de 24 mm y cierre la piel por separado con los mismos puntos de sutura. Permitir la recuperación de la hembra en 1 g / l de sal de acuario en el agua.
- Con unas pinzas finas, tejido ovárico lágrima en pequeños (10 - 20 ovocitos) piezas y traslado al OR2- fresco.
- Fragmentos de ovario Defolliculate en 2,0 mg / ml de colagenasa A en OR2- agitando suavemente en un agitador durante 1 hora, la transferencia a colagenasa fresco y agitar durante una hora adicional.
- Lavar ovocitos 10 veces en OR2 [que contienen Ca ++ / Mg ++], descartando ovocitos pequeños.
- Lave ovocitos en OCM dos veces y traslado al fresco OCM. Aislar ovocitos Etapa VI por tamaño después de una inspección visual y desechar ovocitos inmaduros (más pequeñas): Etapa VI ovocitos son más grandes que los ovocitos inmaduros con pigmentación incluso en el hemisferio animales y son de aproximadamente 1,2-1,4 mm de diámetro.
- Mantener ovocitos a 18-20 ° C in OCM antes de la inyección. Nota: placas de Petri recubiertas de agarosa se pueden utilizar para minimizar la adherencia de los ovocitos a plato.
2. La inyección de transcripciones Library
- Preparar una biblioteca de cDNA direccional 15 usando ARN extraído en una etapa apropiada de desarrollo (por ejemplo, la etapa placa neural 14 10). Compra una biblioteca de ADNc o construir uno usando un kit comercial por la visión general en los cuatro pasos siguientes.
- Aislar aproximadamente 5 g de ARNm mediante el uso de un producto para enriquecer en poli (A) + RNA (Ver Tabla de Materiales) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Las transcripciones que se utilizarán para producir la biblioteca de cDNA puede ser restringido a un tejido induciendo (tal como la placa neural, después de microdisección del tejido deseado), o pueden ser a partir de embriones enteros en una etapa particular.
- Producir ADNc con un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Ligar aproximadamente 20 ng de ADNc en un vector incluido con el kit comercial u otro vector adecuado. Un vector de plásmido apropiado incluye secuencias para la estabilidad del ARNm tales como 5 'β-globina y 3 de poli (A) secuencias (pCS2 +, pTnT, pCS105).
- Transformar ligación en células bacterianas competentes utilizando el protocolo recomendado por proveedor para la transformación de choque térmico.
Nota: Alternativamente, una colección de (ORFeome) clones marco de lectura abierto está comercialmente disponible y puede ser usado para generar las transcripciones de inyección.
- Preparar 10 piscinas de plásmidos de desde 3 10 hasta abril 10 complejidad (desde abril 10 hasta 05 10 complejidad total). Esto representa 10 placas con 1.000 - 10.000 colonias cada una.
- Biblioteca placa de cultivo en 10 placas de 15 cm LB-ampicilina, crecer 12 - 18 horas a 37 ° C, y recoger colonias de cada por una suave presión con un esparcidor de vidrio en 7 ml LB.
- Preparar un stock de glicerol a partir de 0,5 ml (añadir a 0,2 ml de glicerol estéril y se almacena a -20 y# 730; C), y el uso de los restantes 6,5 ml para preparar ADN con un estándar comercialmente disponible kit de ADN miniprep siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Linealizar el ADN plásmido agrupada (1.0 - 2.0 g) con enzima de restricción apropiada digerir 16 a 37 C durante 1 - 1,5 h. Aislar el DNA linealizado con extracción con fenol / cloroformo seguido de precipitación con etanol y resuspensión en agua por las especificaciones del kit RNA polimerasa utilizada. Sintetizar ARN sentido con un kit de ARN polimerasa comercial siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Preparar agujas de microinyección (utilizando un extractor de aguja con un tubo capilar de vidrio) de aproximadamente 20 m de diámetro; medir puntas de aguja en un microscopio compuesto con un micrómetro ocular calibrado. Nota: La configuración del extractor de agujas deben determinarse empíricamente para producir una aguja con una punta fina de tal manera que cuando se rompen con unas pinzas finas produce el tamaño de la punta deseada.
- Prepárese (empujar arcilla encapa uniforme sobre el fondo del plato) arcilla forrada 35 x 10 mm placas de Petri con ranuras paralelas para mantener ovocitos en su lugar durante la microinyección; producir ranuras con una sonda centro comercial o pipeta Pasteur fundido en la punta de la llama. Como una alternativa a la arcilla, preparar platos de agarosa haciendo muescas con un molde de elastómero 17. Ovocitos Transferir con una pipeta de gran calibre a un 3% de Ficoll en 1X MBS (aproximadamente 2 ml) en las filas de los platos de barro forradas.
- Usando microinyector, llenar la aguja con 1 ng / nl ARN y ajustar el balance para producir ligera presión positiva (para evitar la elaboración de citoplasma del ovocito).
- Inyectar ovocitos con aproximadamente 20 nl ARN en la región ecuatorial. Permitir 1 h para los ovocitos inyectados a permanecer en Ficoll-MBS, a continuación, transferir suavemente para 1x MBS. Incubar durante 8-24 horas a 20 ° C antes del ensayo casquillo animal.
3. Cap Ensayo Animal
- Preparar 3 / 4x NAM y obtener unas pinzas finas, bucle de cabello, fragmentos cubreobjetos curvas, dis barro forradashes con hendiduras en forma de copa para mantener ovocitos. Haga fragmentos cubreobjetos curvas rompiendo aparte cubreobjetos de vidrio en fragmentos pequeños (aproximadamente 1 - 2 mm x 2-4 mm) y que pasa por la llama hasta que los bordes pulir y caerse, produciendo una pieza curva.
- Fertilizar X. laevis huevos 18 a través in vitro o el apareamiento natural y la cultura a la gástrula etapas (10 - 11 horas después de la fertilización a RT) en 0,1x MBS antes de la clasificación por etapas; recoger mediados de gástrula (etapa 11 - 11,5) 10 embriones.
- Embriones de transferencia a una placa de Petri, aproximadamente la mitad con 3 / 4x NAM. El uso de dos pares de pinzas finas, retire la fertilización (vitelina) membrana desde gastrulae.
- Transferencia de ovocitos a 3 / 4x NAM (aproximadamente 2 ml) en platos de barro forradas e inmovilizar en impresiones individuales en la arcilla, que produce impresiones para dar cabida a los embriones individuales como ranuras fueron descritos anteriormente.
- Embriones de traslado hasta los platos de barro forradas y cortar las tapas animales de gastrulae usando dos pares de pinzas finas. Tenga cuidado de aislar casquillo ectodermo animales y no tejido ecuatorial 18.
- Colocar un casquillo animal en el hemisferio animales de cada ovocito con la superficie interior de la tapa de los animales en contacto con el ovocito. Mantenga recombinantes juntos mediante la aplicación de fragmento de cubreobjetos de vidrio curvada y aplicando presión hacia abajo al vidrio, aplanando el ectodermo como los contactos cubreobjetos la arcilla (CAPS animal puede permanecer abierta con la capa interior expuesta a la superficie del ovocito para 6 - 8 horas o más largo ).
Nota: Como alternativa, coloque la tapa del animal en una hendidura de la arcilla con su superficie interna orientada hacia arriba y coloque un ovocito en la tapa; asegurar el recombinante con pequeñas extensiones de arcilla. - Cultura a 20 ° C hasta el control de los embriones llegan a la etapa deseada para el ensayo.
- Recombinante separada mediante la eliminación de cubreobjetos / arcilla y aislar ectodermo con unas pinzas y un bucle de pelo.
- Fijar fragmentos ectodérmicas durante 1 hora en MEMFA (3,8%formaldehído en MEM [0.1 M MOPS pH 7.4, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO y 4]).
- Fragmentos de transferencia (y embriones de control) de MEMFA en etanol y se almacena a -20 ° C.
4. Análisis de la Respuesta en ectodermo por hibridación in situ (ISH)
- Preparar soluciones para ISH.
- Preparar 1x PBS: 0,01 M tampón fosfato salino, NaCl 0,138 M, pH 7,4
- Preparar PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% de Tween-20
- Preparar la solución de 100x Denhart: 2% de BSA, 2% de polivinilpirrolidona, 2% de Ficoll
- Preparar Tampón de Hibridación: 50% formamida, 5x SSC, 1 mg / ml de ARN de levadura torula, 1 mg / ml de heparina, solución de Denhart 1x, 0,1% de Tween-20, 0,1% de CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H 2 O
- Preparar maleico Acid Buffer (MAB): ácido maleico 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5
- Preparar MAB + bloque: MAB, 2% reactivo de bloqueo (calor a 60 ° C para disolver)
- Preparar fosfatasa alcalina (AP) Tampón: Tris 100 mMpH 9,5, 50 mM de MgCl 2, NaCl 100 mM, 0,1% de Tween, dH 2 O
- Prepare la sonda de ARN.
- El uso de un kit RNA polimerasa comercial y DIG-NTP mezcla, añadir a un tubo de 1,5 ml (50 l de reacción): 25,5 l DEPC-H 2 O, 10 l 5X Transcription Buffer, 2,5 l de mezcla 10x dig-NTP, 5 l 100 mM TDT, 2 l ARNsin, 2 l plantilla de ADN linealizado (~ 1 g / l), 3 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 90 minutos.
- Añadir 2 l ARN polimerasa e incubar 37 ° C durante 60 minutos.
- Compruebe 2 l de reacción en un 1% en gel de agarosa.
- Añadir 1 l RQ1 RNasa libre de DNasa e incubar 37 ° C durante 20 minutos.
- Precipitar la sonda mediante la adición de 50 l DEPC-H 2 O, 25 l 10 M acetato de amonio y 313 l de etanol. Almacenar a -20 C durante la noche (O / N) a continuación, recuperar el ARN por centrifugación a 13.800 xg durante 20 min. Lavar con 500 l 75% de etanol, girar brevemente, retireetanol y permitir pellet se seque al aire. Añadir 50 l DEPC-H 2 O.
- Añadir Tampón de Hibridación a una concentración final de ~ 0,5 g / l.
- Preparar de tejidos para la hibridación. A menos que se indique lo contrario, llenar viales a la cima con cada cambio de solución descritos (aproximadamente 4 ml).
- Retire etanol a partir de viales y embriones de transferencia en 75% de etanol / PTW, entonces 50% de etanol / PTW durante 10 minutos cada uno, en posición horizontal sobre rockero.
- Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín.
- Transferencia a 10 mg / l tratamiento de proteinasa K en PTW; tubos de roca vertical 15 min.
- Enjuague dos veces 10 minutos cada uno en 0,1 M trietanolamina pH 7.8 - tubos de roca vertical.
- Añadir 12,5 l anhídrido acético para tubos y el rock verticalmente 5 min. Repita el procedimiento con anhídrido acético 12,5 l adicional durante 5 min.
- Lave en PTW 5 min verticalmente en eje de balancín.
- REFIX en 4% de paraformaldehído 20 min en eje de balancín. Heat Tampón de Hibridacióna 60 ° C.
- Lavar tres veces en PTW durante 5 minutos cada uno en eje de balancín.
- Retire todos pero ~ 1 ml de PTW de cada tubo y añadir 250 l Hyb Buffer; agitar suavemente los tubos para mezclar. Tubos de roca vertical 5 min.
- Reemplazar con 60 ˚C Hyb Buffer (0,5 ml) y agitar suavemente a 60 ° C 10 min. Reemplazar con frescos Hyb Buffer y agitar a 60 ° C de dos a 4 horas.
- Sonda de calor (1 ml a 0,5 mg / l en Hyb Buffer) a 60 ° C (3 min). Retire Hyb Buffer y añadir sonda para tubos. Agitar suavemente O / N a 60 ° C.
- Preparar tejidos para anticuerpos.
- Cálido Hyb Buffer y 2x SSC + 0,1% de Tween-20 soluciones a 60 ° C.
- Reemplace solución sonda con Hyb Buffer (salvo sondas a -20 ° C durante 2 - 3 veces reutilización). Lavar a 60 ° C durante 10 minutos.
- Lavar tres veces a 60ºC en 2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación).
- Lavar tres veces a 60 ° C en 0,2x SSC-Tween (20 minutos cada uno con agitación).
- Lavar dos veces en MAB (RT) durante 15 min cada uno horizontalmente en eje de balancín.
- Añadir 1 ml MAB + bloque. Lávese las 2 horas verticalmente en eje de balancín.
- Traslado a 1 ml MAB + bloque que contiene un anti-digoxigenina-AP 1/2000. Roca verticalmente en 4 CO / N.
- Preparar Tejidos para Color reactivo.
- Reemplace la solución de anticuerpo con MAB; lavar tres veces en el MAB 5 minutos cada uno horizontalmente en eje de balancín.
- Lavar tres veces en el MAB de 1 hora cada uno horizontal en eje de balancín.
- Lavar dos veces en AP Buffer 10 minutos cada uno en posición horizontal sobre rockero.
- Traslado tejido para pozos múltiples bandeja de plástico, retire AP Buffer y añadir BM reactivo Púrpura (~ 1 ml). Permita reacción tenga lugar en la oscuridad 5 min de O / N.
- Cuando se logra tinción apropiada, traslado de tejidos a viales de PTW. Lavar dos veces 10 minutos en cada una PTW en eje de balancín.
- Fijar en solución de Bouin en 4 CO / N en eje de balancín.
- Lave Bouin con tres 70% de etanol / 30% PTW lavados a TA. Proceda to captura de imagen usando epi-iluminación y una cámara montada en el microscopio, el blanqueado, si es necesario 18.
5. Selección Sib y clonación
- Seleccione la piscina con la mayor actividad (mayor respuesta en el tejido ectodérmico).
- Valorar (diluir con LB a la densidad apropiada) el stock de glicerol de la piscina con la mayor actividad y la placa a cabo diez nuevas placas con aproximadamente una décima parte de las colonias de la etapa previa (usando la sección 2 en el protocolo anterior).
- Reducir el tamaño de la piscina hasta que la actividad se remonta a una sola colonia.
- Obtener secuencia de ADN usando cebadores estándar en el vector.
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Representative Results
En respuesta a la expresión del ARNm inyectado en oocitos, respondiendo tejido casquillo animal se sometió a ensayo para la expresión de Otx2 mediante hibridación in situ (Figura 2 y Tabla 1); Otx2 se expresa en el ectodermo lente presuntiva (PLE) a partir de cierre del tubo neural a través de placoda del cristalino engrosamiento 19. Sin embargo, desde Otx2 se expresa también en el ectodermo neural anterior, así como la cabeza ectodermo neural no fuera de la PLE, se asocia tanto con neural y las respuestas placodal. El uso de Foxe3 a la pantalla de la biblioteca de un producto capaz de producir una respuesta de objetivo inductivo-lente competente casquillo animal ectodermo gen permitido un enfoque más específico para el objetivo de la clonación de expresión, ya que Foxe3 se expresa en el PLE de placa neural etapas y en toda la formación de vesículas lente 20, presentes en las regiones adyacentes placodal pero ausentes de neuroectoder metro. Utilizando la clonación de expresión y protocolo de selección sib arriba y la inyección de piscinas de las transcripciones de la biblioteca, un gen capaz de producir la expresión Foxe3 en las tapas de los animales se aisló (Tabla 2). Tras el aislamiento del clon, 179 ensayos adicionales animales tapa utilizando ovocitos inyectados con transcripciones de la biblioteca fueron seleccionados para la expresión de Foxe3; 50 fueron positivos (28%). De 140 piezas animales tapa colocados en oocitos no inyectados, 0 fueron positivos (Figura 3).
Figura 1. ovocitos-Cap animales de ensayo y de clonación de expresión visión general esquemática del protocolo:. Transcripciones se preparan a partir de la biblioteca de clones y se inyectaron en oocitos, ectodermo casquillo animal se cultivaron con oocitos y luego se ensayaron para la expresión génica inducida por hibridación in situ. d / 53518 / 53518fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Resultados típicos de Cap Ensayo Animal siguientes mRNA de inyección e hibridación in situ para Otx2. (AB) resultado Representante de la respuesta inductiva a dorsalized etapa 14 de poli (A) + ARN en las tapas de los animales, se ensayó la Otx2 expresión por todo el montaje in situ hibridación. (A) tapas de animales colocados en oocitos no inyectados en la etapa de 10,5 y cultos a la etapa 25. (B) Etapa 10.5 gorras de animales colocados en oocitos inyectados con 10 ng de ARN y culto a la etapa 25. Otx2 expresión observó en 6/7 de los casos y se indica mediante puntas de flecha. Bar = 500 micras. "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resultados típicos de Cap Ensayo Animal siguiente en hibridación in situ para Foxe3. (AC) tapas de animales representativos de los ensayos de capitalización de oocitos de animales, probados para la expresión de Foxe3 por hibridación in situ. (A) Etapa 11-11.5 tapas de animales colocados en ovocitos LDB1-inyectado y cultivadas a la etapa 23. Foxe3 expresión se indica mediante flechas. (B) Etapa 11-11.5 tapas de animales colocados en oocitos no inyectados y culta a la etapa 23; ninguna expresión Foxe3 detectado. (C) Sección a través de Foxe3 -positivo inducida casquillo animal de una expresión que muestra en las capas interior y exterior del ectodermo. Bares = 500 micras.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53518/53518fig3large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| ARN inyectado | Los casos positivos | Gene | % |
| Etapa 14 mRNA dorsalized, 10 ng | 12/24 | Otx2 | 50 |
| Piscinas Biblioteca de 10 5 clones, 20 ng | 3/9 | Otx2 | 33 |
| Piscinas Biblioteca de octubre 05 al 10 0 clon es, 20 ng | 50/179 | Foxe3 | 28 |
| Ninguna | 0/140 | Foxe3 | 0 |
Tabla 1. Ensayo de ovocitos Cap-Animal Resultados Los resultados de ensayo de tapón de animales evaluadas mediante hibridación in situ con Otx2 y Foxe3, utilizando ovocitos inyectados con ARNm o con transcritos sintetizados a partir de piscinas biblioteca de ADNc.; o oocitos no inyectados.
| ARN inyectado | Designación Piscina / selección | Positivo expresión Foxe3 |
| LA | 2/4 | |
| SEGUNDO* | 4/28 | |
| do | 4/44 | |
| Piscinas Biblioteca de 10 4 clones, 20 ng | 1 | 0/11 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 3.14 | |
| 4 | 0/12 | |
| 5 | 0/15 | |
| 6 | 20.01 | |
| 7 | 3.23 | |
| 8 | 0/16 | |
| 9 | 0/16 | |
| 10 * | 5.20 | |
| Piscinas Biblioteca de 5.000 clones, 20 ng | 1 | 0/7 |
| 2 * | 05.16 | |
| 3 | 1.7 | |
| 4 | 0/7 | |
| 5 | 0/7 | |
| 1 | 0/10 | |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 | 0/10 | |
| 5 * | 8/26 | |
| 6 | 0/11 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 0/8 | ||
| Piscinas Biblioteca de 70-200 colonias, 20 ng | 1 | 0/8 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 * | 1.10 | |
| 4 * | 1.10 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/9 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| Piscinas Biblioteca de 20 colonias, 20 ng | 1 | 0/10 |
| 2 | 0/10 | |
| 3 | 0/10 | |
| 4 * | 7.21 | |
| 5 | 0/10 | |
| 6 | 0/10 | |
| 7 | 0/10 | |
| 8 | 0/10 | |
| 9 | 0/10 | |
| 10 | 0/10 | |
| K2-6, L1 | 0/10 | |
| L2-6, M7 | 0/10 | |
| M8-12, N7-8 | 0/10 | |
| K5-6, L1-4 | 1.10 | |
| L5-6, M7-10 | 0/10 | |
| M11-12, N7-8, K2-4 | 0/10 | |
| K2, K5, L2, L5, M8, M11 | 0/10 | |
| K3, K6, L3, L6, M9, M12 | 0/9 | |
| K4, L1, L4, M7, M10, N7, N8 | 1/9 | |
| RNAs Library, 20 ng | K6 | 0/10 |
| L1 * | 3.10 | |
| L3 | 0/10 | |
| L4 | 0/10 | |
| RNA Biblioteca, 20 ng | L1 (LDB1) confirmación | 50/179 |
| * Indica piscina seleccionado |
Tabla 2. Selección y Sib ExpreResultados Clonación fisión. La piscina con el más alto nivel de respuesta en cada ensayo casquillo animal (que oscila entre 10% y 36% positivas para la expresión Foxe3) fue seleccionado para su uso en el siguiente experimento para reducir la actividad de un clon. El asterisco indica piscina seleccionado.
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Discussion
El método descrito aquí para la clonación funcional de genes capaces de inducir una respuesta en ectodermo competente puede ser usado para identificar una amplia gama de productos génicos. Este método se expande al trabajo anterior mediante la combinación de los ensayos de inducción de tejido con técnicas de clonación de expresión. Utilizamos las vías metabólicas de Xenopus el ovocito como una fuente de producción de factores de inducción de, directa o indirectamente, después de la inyección de ARN. Esto, en combinación con el uso de métodos establecidos para la clonación de un gen de interés utilizando 6,7 expresión de los transcritos generados a partir de una biblioteca de ADNc o de otra colección de clones, ofrece un enfoque valioso para aquellos que buscan para identificar los genes de nuevo interés involucrados en embrionario inducción. La amplia aplicabilidad de este método para la identificación funcional de nuevos genes es un complemento útil a nuevas e interesantes enfoques de genética inversa, y también se podría utilizar para funcionalmente transcripciones de ensayo identificados utilizando alta throughput métodos (como el ARN-ss) 21.
Los controles son crítico en el control de la función metabólica de los ovocitos utilizados en el ensayo de tapa. Tanto para garantizar la salud de cada lote de ovocitos y establecer la utilidad de este sistema para detectar transcripciones de baja abundancia, variando las concentraciones de ARNm del inductor mesodermo INHBB fueron examinados; este gen no está relacionado con la vía de la inducción de la lente y es un control independiente bien documentada 14. La actividad muscular que induce, se ensayó mediante la expresión de antígenos específicos de músculo en ectodermo casquillo animal con el anticuerpo 12/101, se observó con 2 - 200 pg INHBB ARNm, incluso en la presencia de 500 veces el exceso etapa 14 de poli (A) + RNA. El sistema es por lo tanto útil en una gama muy amplia de la cantidad de ARN inyectado, y ovocitos son capaces de producir de forma estable la proteína y permanecer viables después de la inyección citoplásmica de volúmenes de 50 nl y superior.
Una consideración para la use de una biblioteca de cDNA en este protocolo es la necesidad de de longitud completa o casi clones de longitud completa. Antes de su uso en el protocolo, la biblioteca debe ser examinado por el análisis del Norte para determinar el tamaño de las transcripciones conocidas en la biblioteca y, por tanto, reducir la posibilidad de que los efectos dominantes negativos se obtienen de las transcripciones inyectados potencialmente truncados. Desde una piscina de ADNc de longitud completa es importante, el uso de clones EST 22 o de manera óptima, la Xenopus ORFeome 23 (que proporciona un conjunto completo de clones de longitud completa validados) se prefieren a una biblioteca de ADNc tradicional a menos que una etapa- y tejido- fuente específica de cDNA se buscan y se utiliza para la construcción de la biblioteca. Otra consideración es la presencia de secuencias en el vector de biblioteca destinada a aumentar la estabilidad del mRNA en las transcripciones inyectados β-globina y de poli (A). Si bien esto es deseable aumentar la cantidad de proteína producida a partir de ARNm sintético inyectado, también plantea el posibilidad de producir un efecto dominante negativo a partir de ARNm que es más alto en estabilidad y actividad que en vivo. Un bajo número de copias de ARNm no puede ejercer los mismos efectos que su homólogo endógeno en el fondo de un gran número de transcripciones; uno que se estabiliza en el proceso de clonación y la transcripción puede persistir para permitir la detección en el ensayo de tapa. Un tercer problema es el tamaño de la piscina; considerable reducción del tamaño de la piscina (10 clones o menos) se ha demostrado que es ventajoso en proyectos recientes de ganancia de función de selección de embriones 24 y es probable que proporcione resultados más claros y más fácil la identificación de genes candidatos. Un tamaño más pequeño que el de la piscina 10 3 - 10 4 recomendada en este protocolo se puede lograr si la complejidad total de la colección de clones es inferior a 10 4, como es el caso con el ORFeome 23; uno podría pantalla de los ~ 9.000 clones comenzando con 10 piscinas de 900, aunque puede ser mano de obra intensiva prohibitivo paraprocesar más de 10 piscinas en un experimento.
Determinación del tipo de producto génico (por análisis de secuencia) producida por el gen identificado en la pantalla determina la naturaleza de las pruebas de su función. Puesto que un cofactor transcripcional nuclear fue identificado en nuestra pantalla 8, fue necesario confirmar el papel de núcleo en el proceso inductivo desencadenada por introducción de LDB1. Ovocitos enucleados tienen maquinaria de síntesis de proteínas en pleno funcionamiento y son viables y capaces de producir factores secretados por las transcripciones inyectados. Sin embargo, la ausencia del núcleo será abolir el funcionamiento de factores de transcripción, cofactores, u otros productos génicos que actúan indirectamente. Análisis posteriores de los genes identificados en la pantalla incluyen la determinación del patrón de expresión del desarrollo mediante hibridación in situ y la ganancia de la función y las pruebas de pérdida de función. La sobreexpresión mediante la inyección de ARN en cigotos o mediante la limitación de la inyección al SPblastómeras ecific para restringir sus efectos a regiones particulares del embrión puede proporcionar información, así como desmontables de la función de genes a través de la inyección de oligonucleótidos de morfolino dirigidos contra la transcripción in vivo.
La visualización directa de un efecto inductivo en el ectodermo responder casquillo animal usando una línea transgénica con un gen reportero (tal como GFP) puede acelerar enormemente el proceso de selección y eliminar la necesidad para el análisis de la expresión de ARN mediante hibridación in situ. Del mismo modo, el uso de anticuerpos como medios más rápidos de detección es deseable si un anticuerpo apropiado (tal como el 12/101 para la respuesta muscular se discutió anteriormente) está disponible. Embriones albinos pueden ser utilizados para las tapas de animales, que aunque más difícil de poner en escena con precisión en las etapas gástrula, agilizar el proceso de hibridación in situ, eliminando la necesidad de blanqueo de tipo salvaje pigmentación para visualizar mejor la prod reacción de colorUCT.
Por último, es importante considerar que, por varias razones, puede necesitar ser llevado a cabo un gran número de ensayos para identificar un gen dado. Por un lado, el número de casos uno puede proceso razonablemente en un ensayo dado está limitado por el desarrollo (y la eventual pérdida de competencia) que se produce con el tiempo incluso teniendo en cuenta un gran lote de embriones y una gama de temperaturas a las que a la cultura ellos, como así como la pérdida que puede ocurrir de pequeñas piezas de ectodermo en el procesamiento. Por otra parte, las tasas de éxito de la expresión de un marcador elegido en el ectodermo pueden ser muy bajo y requieren muchos casos para observar un efecto estadísticamente significativo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12/101 Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12/101 | Monoclonal antibody for detection of muscle tissue |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | for ISH |
| Acetic anhydride | Sigma | A6404 | for ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | for ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Plasmid DNA purification |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | for ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | for ISH |
| Boekel Hybridization Oven | Fisher Scientific | 13-245-121 | for ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | for ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | for OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | for ISH |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Defolliculation of oocytes |
| Cysteine | Sigma | C121800 | Dejelly embryos |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | for ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | for ISH probes |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 500233 | for Vitelline envelope removal |
| Ethyl 3-aminobenzoate | Sigma | A5040 | MS222 anesthetic |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | for Injection media |
| Formamide | Sigma | F9037 | for ISH |
| Gentamicin sulfate | Sigma | G1914 | for OCM |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | 3.5" long, I,D, 0.530 mm |
| Glass sample vials | Fisher Scientific | 06-408B | for ISH |
| Hair loop | Hair affixed in pasteur pipette for tissue manipulation | ||
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | for ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microprocessor-controlled microinjector |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt for frog recovery |
| IRBG XGC Xenopus verified full-length cam cDNA | Source Bioscience | 989_IRBG | cDNA library |
| LB Agar plates with 100 µg/ml Ampicillin | Teknova | L5004 | 150 mm pre-poured LB-Amp plates for sib selection |
| LB Luria Broth | Teknova | L8650 | LB for collecting colonies in sib selection from plates and dilution of cultures |
| Magnetic mRNA Isolation Kit | New England BioLabs | S1550S | for isolation of poly(A)-enriched RNA |
| Maleic Acid | Sigma | M0375 | for ISH |
| Manual Microfil Micromanipulator | World Precision Instruments | M3310R | Manual micromanipulator |
| Nutating Mixer | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker for ISH |
| Permoplast | Nasco | SB33495M | Clay for injection and dissection dishes |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P5368 | for ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | to stimulate oocyte development |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | PVP40 | for ISH |
| Programmable Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Micropipette needle puller |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | for ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | cDNA library construction |
| Riboprobe Combination System | Promega | P1450 | in vitro transcription |
| Superscript Full Length cDNA Library Construction Kit | Life Technologies | 18248013 | kit for cDNA library construction |
| Sutures, 3-0 silk | Fisher Scientific | 19-037-516 | Suture thread and needle for post-oocyte removal |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | for ISH |
| Triethanolamine | Sigma | T1502 | for ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | for ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | alternative kit for cDNA library construction |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cells for transformation of cDNA library |
References
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