Introduction
이광자 현미경 살고 동물 행동에서 뇌 활동의 관찰 혁명. 1990 년 출시 이후 빠르게 인기를 얻고 지금은 생체 내 1,2에서 뇌 활동의 다양한 측면의 검토를 향해 가장 흥미롭고 혁신적인 접근 방법의 하나로서 구현된다. 이러한 애플리케이션 및 신경 세포의 형태 (칼슘 수준 지표 또는 즉각적인 초기 유전자의 발현을 사용하여, 예), 혈류 측정, 신경 활성을 포함한다. 실험실의 증가는 생체 뇌 영상을위한 새로운 표준으로 과학 세계 기술을 구현, 두 광자 현미경을 사용합니다.
표준 접근법은 뇌 창 주입 배럴 또는 마우스 뇌의 시각 피질 3 이상 (커버 유리 피복 두개의 원형 구멍)를 포함한다. 다음으로, 실험 프로토콜에 따라 각서SE 시간 걸쳐 4,5- 뇌 신경 활성 및 형태의 변화를 모니터링 할 수 있도록 시각화 행동 훈련 일련 겪는다. 두 경우 모두 개두술은 봉합을 횡단하지 않고 정수리 뼈에 영향을 미친다. 주로 기술의 주요 단점은 배럴 또는 시각 피질로 쉽게 접근 대뇌 피질에 제한된 응용 프로그램입니다 것으로 생각된다. 다른 지역에 걸쳐 두개골 창 주입으로 인해 과도한 출혈 및 / 또는 공간 방해로 어려움을 많이 포즈.
본 논문에서는 생체 현미경 (6)의 두 광자에 대한 관심의 또 다른 가능한 영역과 retrosplenial 피질 (RSC) 위의 두개골 윈도우의 주입을 제안한다. RSC는 공간 기억 형성을 담당 뇌 회로의 중요한 소자이다. 해부학, RSC는 대뇌 피질, 해마, 시상 영역 (7)를 연결하는 신경 네트워크의 일부입니다. 그것은이다주로 이러한 공간 학습 및 소등과 탐색 공간 (6)과 같은 행동의 범위에 포함했다.
신경 세포의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해 우리는 thy1 발기인에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 마우스 라인을 사용합니다. 이러한 쥐, GFP는 이광자 현미경 8을 사용 피질 축삭 돌기 명확한 시각화를 허용 뇌 신경 세포의 약 10 %에서 발현된다. 우리가 제안하는 또 다른 혁신은 RSC로 돌출 된 뇌의 깊은 구조로 신경 세포 특이 camkii 프로모터 (9)에서 적색 형광 단백질 (mCherry)를 코딩하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청 형 2/1 (/ 1 rAAV2)의 주입입니다 해마 등. Thy1-GFP 마우스의 해마에서 rAAV2 / 1 mCherry의 발현은 hippocampo-cortica의 사전 및 시냅스 요소를 동시에 시각화 할 수 있습니다난 10 시냅스. 단백질이 축삭 터미널에 충분한 수준에 도달 할 mCherry의 rAAV 중심의 표현은 2~3주이 필요합니다. 이 기간은 개두술 회복에 필요한 통상의 시간과 일치한다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 실험 절차는 실험 생물학의 Nencki 연구소, 과학 폴란드어 아카데미에서 현지 윤리위원회에 의해 승인되었다.
참고 : 관련 동영상의 장면 중 일부는 가속된다. 속도 계수는이 장면에 표시됩니다.
1. 수술 준비
- 오토 클레이브에 액체와 면봉을위한 모든 도구, 유리 용기를 소독. 비용 소비 장갑을 사용합니다. 수술 테이블, 정위 프레임과 70 % 에탄올 모든 주변 지역을 청소합니다. 모든 살균 장비에 대한 멸균 공간을 만들기 위해 무균 수술 패드를 사용합니다. 작은 조각으로 gelfoam을 잘라 및 멸균 식염수를 흡수.
참고 : 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따르면, 에탄올 멸균이나 높은 수준의 소독제도 아니다. 그것은 단지 이전에 멸균 표면 세정 / 탈지 화제로서 사용되어야한다. - 일에 동물을 넣어전자 유도 챔버 / 분 2 L의 5 % 이소 플루 란 레벨 및 산소의 흐름을 설정한다. 이 절차는 약 3 분 정도 소요됩니다.
- 유도 챔버에서 동물을 가져 가라. 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 또는 발가락 핀치를 사용합니다.
- 정밀 트리머가 눈까지 (귀 사이) 머리의 뒤쪽에서 머리를 면도 사용.
- 정위 프레임에 동물을 배치하고 귀 막대 머리를 안정.
- 1.5 %의 이소 플루 란과 0.3 L / 분 산소 마취 수준을 설정합니다.
- 눈 연고를 적용합니다.
- 각각, 염증, 통증 및 감염을 예방하기 Tolfedine (4 ㎎ / ㎏) Butomidor (2 밀리그램 / kg) 및 Baytril (5 ㎎ / ㎏)을 동물에 피하 주입한다.
- 뇌 부종을 방지하기 위해 덱사메타손과 동물의 근육 (0.2 ㎎ / ㎏)을 주입한다.
주 : 덱사메타손 피하 주사 또는 복강 내 근육의 손상을 방지 할 수있다. - (S)를 이용하여 피부를 닦아Betadine와 terile 면봉은 70 % 에탄올 하였다.
- 장갑을 변경하고 70 % 에탄올로 스프레이.
참고 : 멸균 필드를 터치하지 않는 일회용 장갑을 사용하는 동안. 단지 무균 수술기구 및 멸균 면봉의 팁 동물을 터치합니다.
2. 두개골 창 외과
- 집게로 피부를 들어 올려 마이크로 가위가 눈의 앞 지점에 비스듬히 다음 머리의 기본을 따라 수평으로 피부를 절개하고 사용. 피부 플랩을 제거합니다.
- 과도한 출혈과 통증을 방지하기 위해 골막에 멸균 면봉으로 리도카인 연고를 적용합니다.
- 골막을 제거하기 위해 멸균 면봉이나 메스를 사용합니다. 멸균 면봉와 두개골을 건조.
- 멸균 된 바늘을 사용하여 그들을 고정하고 치과 용 시멘트와의 접촉을 방지하기 위해 피부의 가장자리에 밀도 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.
- t 이상 멸균 3mm의 커브 글라스를하다lambdoid 봉합에 전방 그는 두개골. RSC에서 커버 슬립을 중심 좌표 : AP, 브레 그마 -2.8; ML은 멸균 된 바늘로 두개골 표면을 긁어서 0 표 커버 슬립의 가장자리를 정수리. 70 % 에탄올로 멸균 용기에 다시 커브 글라스를 넣습니다.
- 3mm 직경의 원형 윤곽을 소경으로 버어 고속 치과 드릴을 사용한다. 멸균 식염수에 담근 면봉와 뼈 먼지 드릴링 사이트를 청소합니다. 가끔 출혈을 중지하고 뼈를 청소 gelfoam을하고 면봉을 사용합니다.
- 드릴링 사이에서 부드럽게 뼈 원을 터치하고 이동성을 확인하여 미세 집게로 뼈의 두께를 확인합니다. 뼈 봉합의 지역에 두꺼운 있음을 알아 두셔야합니다. 뼈 원 모바일이며 뼈의에도 얇은 층 주상에 남아있는 경우 드릴링 중지. 식염수 담근 면봉에 남아있는 모든 뼈 먼지의 작동 필드를 청소합니다.
- 드릴 CIR을 포함, 시추 지역에 멸균 생리 식염수를 삭제CLE. 조심스럽게 부드럽게 한 다음 미세 집게와 함께 뼈 원을 올립니다 단단히 위쪽으로 들어 올려 뼈를 제거합니다. 경질의 손상을 방지하기 위해 그것을 해제하는 동안 뼈 원을 왜곡하지 않도록주의하십시오.
- 조심스럽게 출혈을 멈추게하기 위해 경질에 멸균 생리 식염수에 담가 gelfoam을 적용 할 수 있습니다. 모든 출혈이 완전히 중지 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 응고 과정을 방해하지 gelfoam을 제거합니다.
참고 :이 시점에서 출혈이 깊은 것을 입증 할 수 있도록 봉합 영역이 매우 혈관이다. 출혈이 완전히 중지하는 것은 충분한 시간 동안 기다릴 필요하다. 얼음에 배치하여 냉각 식염수 젖은 gelfoam을 유지하는 것이 도움이된다.
3. 바이러스 감염
- 정위 타워에 주입 펌프를 부착하고 컨트롤러를 연결합니다.
- 주사기에 35G 바늘을 삽입합니다. 그것을 소독 에탄올로 주사기 10 번 세척 및 멸균 식염수 10 회 전자의 흔적을 제거하는thanol. 주사기에서 공기 방울을 제거합니다. 펌프에 주사기를 삽입합니다.
참고 : 다른 소독제를 사용하는 것이 좋습니다. - (10 ~ 12 PFU 권장) rAAV2 / 1 mCherry 준비의 단일 투여 량을 해동 얼음에 보관하십시오. 바이러스 솔루션과 주사기를 입력합니다.
- 브레 그마에 바늘을 중앙에 다음 조심스럽게 다음 좌표를 사용하여 해마에 삽입 : AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. 이 좌표는 개두술의 가장자리 근처에 위치한다. 조직 안정화를 위해 5 분 동안 기다립니다.
- 50 NL / 분의 속도로 rAAV2 / 1 mCherry 용액 0.7 μl를 주입한다. 바이러스가 완전히 흡착하는 10 분을 기다립니다. 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 출혈이 발생하는 경우 gelfoam을 함께시킨다. 반대측 사이트와 반복합니다.
4. 두개골 창 주입
- 드릴 원 프레임의 경질의 상단에 살균, 건조 커브 글라스를 놓습니다. forc와 커브 글라스를 잡고분기 EPS 부드럽게 경질을 평평하고 커브 글라스을 가지고 '두개골 표면에 가까운 가장자리.
참고 : 커브 글라스가 응고와 출혈이 다시 시작을 방해하는 것이 가능하다. 이런 경우, 커브 글라스를 올려 알코올, 건조에 배치 2.9 단계로 복귀. - 멸균 된 바늘이 커브 글라스 가장자리에 짙은 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용 사용하면 두개골에 첨부합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.
- 두개골의 앞 부분에있는 고정 바 (M2 너트 또는 사용자 정의 만든 디자인)을 놓습니다. 바의 가장자리에 걸쳐 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.
- 세션 이미징 동안 두개골 윈도우의 수평 위치를 사용하는 위치에 고정 줄을 놓습니다. 창에서 가능한 한 멀리 떨어져 배치합니다. 이 윈도우에 너무 가깝게 배치되는 경우, 맞춤형 홀더를 연결 바 나사 촬상 과정 대물위한 걸림돌 포즈 것이다.
- 두개골 창 주위의 분화구를 강화, 운영 영역, 피부 가장자리, 고정 줄의 나머지 부분을 덮고, 치과 아크릴과 모자를 만듭니다. 치과 시멘트가 경화 될 때까지 기다립니다.
- 정위 프레임에서 동물을 제거하고 회수 챔버에 넣어.
- 생리 기능을 관찰하면서 동물이 수술에서 회복까지 기다립니다.
- 48 시간 동안 수술 후 진통제 (카프로 펜, 10 ㎎ / ㎏) 및 항생제 치료 (baytril, 5 ㎎ / ㎏)을 적용합니다.
5. 이미지
- 전원을 현미경, 사파이어 레이저 : 티를 시작합니다. 이 실험에 사용 된 시스템은 두 개의 광자 레이저, OPO 시스템과 이중 하나로 이루어질의 PMT를 구비한다.
- induc에서 동물을 넣어기 챔버 마취를 유도한다.
- 현미경 가스 마취 마스크 유도 챔버와 장소에서 동물을 제거합니다. 0.3 L / 분의 산소 유량과 1.5 %의 이소 플루 란 농도를 감소시킨다.
- M2 나사 (또는 다른 사용자 정의 시스템)와 사용자 정의 현미경 프레임에 동물을 고정합니다. 두개골 창을 수준.
주 : 특정 맞춤 프레임 나은 결과 (개선 된 헤드 안정성 만성 실험 기간 동안 다수의 세션에서 일정한 위치)를 제공하지만 현미경 제조업체 헤드 고정 시스템을 사용하는 것이 가능하다. - retrosplenial 피질의 측면 중 하나에 위드 현미경 설정 및 낮은 배율 목표 중심 뷰를 사용하고, 커버 슬립의 표면에 초점을 맞 춥니 다.
- 분화구 모양의 아크릴 우물에 물 방울을 적용합니다. 장거리 침수 목표로 전환합니다. 물 메 니스 커스 콘 때까지 두개골 창으로 목표를 이동시편과 목표를 nects.
- 두 광자 설정으로 전환하고 가장 낮은 줌을 사용하여 바닥에 시편 위로를 스캔 시작합니다. 뇌경막의 교차점 높은 비 특정 신호의 섬광으로 볼 수 있습니다.
- 전체 동적 범위를 커버하기 위해 형광 세포에서의 신호 강도에 따라 두 채널 (GFP 및 mCherry)의 현미경 취득 설정을 조정한다.
- (다른 세포로부터 분리 된 수지상 나무) 적절한 신경을 찾은 후 가장 낮은 줌과 5 미크론의 Z-거리 만 GFP의 filterset를 사용하여 초기 검사를 수행합니다.
- 스캔 한 스택의 최대 투사를 구하여 (반전 색상을 사용하여) 주석을 위해 그것을 인쇄 할 수 있습니다.
- 원하는 형태 세부 이미지에 수의 값으로 줌을 설정합니다. 이미지 기준으로 최대 투사를 사용하여 GFP 및 mCherry 채널의 전체 수지상 나무.
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Representative Results
Thy1-GFP 기자 마우스에서 신경 세포의 일부에서 GFP의 발현은 대뇌 피질의 수상 돌기 및 RSC에서 지역 축삭 돌기의 생체 내 이미징에 있습니다. 그림 1a는 눈에 보이는 여러 GFP 양성 수상 돌기 이미지의 스택의 최대 투사를 보여줍니다. 세포체는 동맥에 의해 가려한다.도 1b는도 1a에 표시된 수지상 분기의 단일면 확대 이미지 (디지털 줌 3 배)를 보여줍니다. 수지상 형태 (쪽, filopodia)의 세부 사항은 명확하게 볼 수 있습니다. GFP 채널 대역 방출 500-550 nm의 필터를 사용하여 획득된다.
지느러미 해마에 rAAV2 / 1 mCherry의 주입은 RSC에 종료 해마 축삭과 시냅스 부 튼스의 시각화 할 수 있습니다. 이러한 단자 mCherry 채널 (대역 방출 570-610 nm의 필터)로 검출 할 수있다.
그림 1. RSC 신경과 RSC에 해마 돌기의 생체 내 두 광자 영상에서 두 채널입니다. (A) RSC의 단편 (반전 된 색상에 표시된 이미지)에서 GFP 발현 세포의 개요. 낮은 배율 (0.7 배 디지털 줌)에서 찍은 100 μm의 두께 스택의 도시 최대 투영합니다. GFP 채널에서 높은 배율 (배 디지털 줌)에서 취득한 (B) (A)에 나타낸 단편의 단일 광학면. mCherry 취득 설정을 사용하여 (C) (A)에 나타낸 싱글 광학면 단편. 검출 필터에 대한 자세한 내용은 프로토콜을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재 논문에서 우리는 두개골 창을 통해 RSC에서 시냅스 입력과 시냅스 대상의 생체 내 이미징에서 동시에 두 광자를위한 프로토콜을 제시한다. 주입 절차는 몇 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 동물 깊이 마취 및 정위 프레임에 고정되어, 다음 RSC를 통해 두개골이 표시된 원형 라인을 따라 드릴 원형 뼈를 제거하여 얇게된다. 출혈이 중지되면 rAAV2 / 1 mCherry는 해마에 주입하고, 커버 유리 천공 영역 위에 두개골에 고정된다. 마지막 고정 막대가 헤드에 고정되며, 동물은 48 시간 동안 회수 챔버에 배치된다. 약 2~3주 바이러스 발현에 필요한 후, RSC는 가시화 될 수있다. 촬상 프로토콜은 다음과 같은 단계를 포함한다. 첫째, 동물은 마취 현미경으로 고정된다. 다음 위드 현미경을 사용하여 설정되어 초점 시스템이다 SWI이광자 모드 tched 관심있는 채널 (GFP 및 mCherry)이 가시화된다.
발표 기술은 앞에서 설명한 프로토콜을 통해 주요 개선을 제공합니다. 표준 방법에서, 라벨의 한 종류가 검출 될 수있다. 그것은 이미지 지역 축삭 돌기 및 수지상 나무에 사용될 수 있지만 장거리 연결을 연구 할 수 없었다. 두 형광 단백질을 결합함으로써 우리는 사전 및 시냅스 요소를 동시에 추적 할 수있었습니다. 이 추정 시냅스 연결의 생체 모니터링에서 장기를 할 수 있습니다.
설명 된 절차에 최적의 결과를 얻기 위해서는, 여러 중요 단계에 주목하는 것이 중요하다. 염증의 원인과 두개골 윈도우의 투명성을 손상시킬 수 단계 2.8에서 경질에 손상을 뼈 원을 해제하는 동안. 단계 2.9 또는 절차의 다른 단계에서의 출혈 부족 정지 혈액 accumulat 초래창 아래 이온 크게 시야를 감소시킨다. 바이러스를 주입 한 후에는 주사 부위에서 조직 내로 주입하는 바이러스 위해 바늘을 제거하기 전에 적어도 10 분 동안 기다리는 것이 중요하다. 이 바늘 제거시 바이러스의 외피 불필요한 감염의 가능성을 제한한다. 바이러스 성 형질의 영역은 뇌 조직의 사후 조직 학적 분석을 조사해야한다. 니들 트레이스를 따라 임의의 셀 mCherry 발현은 피해야한다. 표준 복구 시간 3 주입니다. 바이러스가 시냅스 돌기 안정 표현에 도달하고 두개골 윈도우 완전히 치유와 안정을 위해이 기간은 충분하다. 동물은 단일 케이지 메이트로 두개 창 임플란트의 제거를 방지하기 위해 보관되어야한다. 확대 케이지의 사용은 금속 바아를 쳐서 두개 창 우연한 손상을 방지하기 위해 고려 될 수있다. 양해 각서 (MOU)의 안정적 정착현미경 자체는 필수적이다. 호흡 운동을 포함한 모든 머리의 움직임은, 얻어진 이미지의 품질에 상당한 감소의 원인이 될 수 있습니다. 또한, 대물 수평 두개 창을 배치 윈도우의 전체면에 대해 동일한 포커스를 취득 가능 문제를 제한하는 것도 유용하다. 해결 등뼈와 튼스에 대한 명확한 기준이 적용되어야한다. 일반적 튼스은 선행 섬유 7보다 적어도 3 배 더 큰 직경의 축삭 부종으로 정의된다. 등뼈는 주먹코 머리를 포함하는 수지상 축에서 명확하게 구별 돌출부로 정의됩니다. 얇고, 짧고, 버섯, 분기 쪽의 인구에 또한 부문은 3 수있다. 인해 이광자 현미경 비교적 불량한 축 해상도, 광축을 따라 돌출 쪽의 분석은 3을 피해야한다. 분명히 사후 immunolabeling 기능 튼스 및 등뼈를 구별하기 위해,사전 및 시냅스 마커 7을 식별하기 위해 수행 될 수있다.
제시된 프로토콜은 우리의 실험의 설계에서 가장 유리한 것으로 입증되었지만, 상이한 실험 목적에 맞게하기 위해 수정할 수있다. 때로는 대신 이소 플루 란의 (예 케타민-xylasine 등) 주사 마취를 사용하는 것이 더 적합하지만, 적절히 다른 균주, 나이 및 성별 생쥐 사이 약물 감수성에 유의 차에두고 용량을 조절하는 것이 중요하다. 이 버 대신 드릴링 구면 하나 책략가를 사용할 수 있지만, 경질의 손상의 위험을 증가시킬 수있다. 멸균 식염수 성공적 인공 뇌척수액 (ACSF)로 대체하지만, 제조 및 동작 동안 항상 살균을 유지하는 것이 중요 할 수있다. ACSF는 준비 후 3-4주 안정이고, 어떤 오염이 시간 이전에 발생하는 경우 즉시 폐기해야합니다. 다른 머리 fixati기기 이광자 현미경 웨이크 마우스를 관찰 할 가능성을 포함하여, 실험 설계에 따라 적용될 수있다.
다른 방법으로,이 또한 한계가있다. 이광자 현미경 경질 표면으로부터 500 ㎛의 깊이에 뇌 조직의 시각화를위한 최대 허용한다. 깊은 뇌 구조의 검사에 대한 추가 수정을 적용해야합니다. 우리 프로토콜 RSC 점유율에 접근 할 수 있지만, 우수한 시상 동 아래 숨겨진 구조의 일부가 여전히 액세스 할 수 없습니다. 이광자 현미경의 분해능은 특정 시냅스의 식별뿐만 아니라 돌기 쪽의 상세한 형태 학적 분석을 위해 충분하지 않다. 이러한 상호 전자 현미경과 같은 추가 방법은 의심 구조의 존재를 확인하기 위해 적용되어야한다. 비교적 어려운 수술 기법이라고 언급하는 것이 중요하며 RECO 아니다미경 운영자 mmended.
제시된 기법은 실험의 넓은 범위에서 적용 할 수있다. 이것은 이광자 현미경 액세스 다른 뇌 영역의 조사를 위해 변형 될 수있다. 그것은 생리 학적 및 병리학 적 상태인지 과정을 포함하고 노화 또는 신경 및 정신 상태의 진행의 다양한 동안 축삭과 수상 돌기 변경을 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 그것은 정확하게 정의의 연결 부분 집합에서 발생하는 예측을 시각화하는 세포 특이 적 프로모터의 사용을 할 수 있습니다. 또한, 깨어 동물 행동 실험 프로토콜에 맞게 조정될 수있다. 또한, 칼슘 또는 pH- 민감성 단백질뿐만 아니라 신경 세포 형태를 가시화하기 위해 뇌에서 발현 될 수 있지만, 또한 세포 활성 및 기능의 변화. 방법의 다른 가능한 변형 mCherry 발현 다른 rAAV 혈청의 사용이다. 키메라 2/1 혈청 형 홍보ovides 충분히 빠른 시작 (2-3 주)와 주사 부위에서 강력한 식입니다. mCherry 수준은 초기 발병 후 최소 12 주 동안 안정적으로 유지하고 더 역행 라벨은 우리의 실험에서 검출되지 않았다. 역행 표시를 얻기 위해, 상이한 혈청 형은 예 rAAV9로서 사용될 수있다. 촬상 세션은 적어도 24 시간의 간격을 마취 후 동물의 적절한 회복을 허용하기 위해 권장하지만에서 임의의 주파수에서 수행 될 수있다. 적절하게 적용하는 경우,이 기술은 수 개월에 걸쳐 동일 영역의 복수의 촬상 세션을 수행 할 수 있습니다. 장기간 실험 (6 개월 이상)의 경우, Cre 호텔 /에 loxP 시스템 floxed GFP 마우스 라인에 AAV 벡터로 전달되는 재조합 효소와 함께 사용할 수있다.
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Disclosures
저자 (KL, MR, KR)은 특허에 대한 권리를이 조에서 사용되는 홀더 프레임 (PL410001을) 보류가 있습니다.
Acknowledgments
저자는 촬영에 도움을 음성 녹음, 그림에 대한 M. Borczyk, 바이러스 생산을위한 A. Trąbczyńska, 유전자형에 대한 M. Ziókowska 및 A. Mirgos에 대한 M. Steczkowski에게 감사의 말씀을 전합니다. KR은 K. Deisseroth에서 CaMK 프로모터의 제어하에 형광 단백질 mCherry을 표현하는 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 종류 선물을 인정합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합 (EU)에 의해 재정 CEPT 인프라를 사용하여, 조직의 구조와 기능, 신경 생물학, 실험 생물학의 Nencki 연구소의 센터의 동물 모델 및 연구소의 실험실의 핵심 시설에서 수행 한 - 유럽 지역 개발 기금 내를 2,007에서 2,013 사이의 운영 프로그램 "혁신 경제". 이 작품은 국립 과학 센터에서 보조금에 의해 지원되었다 : 소나타 비스 2012 / 05 / E / NZ4 / 02996, 하모니아 2013 / 08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013 / 08 / W / KR과 소나타 비스 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC에
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
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