Introduction
microscopia de dois fótons revolucionou a observação de atividade cerebral em viver e se comportar animais. Desde a sua introdução, em 1990, rapidamente ganhou popularidade e agora é implementado como uma das abordagens mais interessantes e inovadores no sentido de exame dos vários aspectos da atividade do cérebro in vivo 1,2. Estas aplicações incluem medições de fluxo de sangue, ativação neuronal (por exemplo, usando indicadores de nível de cálcio ou genes precoces imediatos de expressão) e a morfologia das células neuronais. Um número crescente de laboratórios usam microscópios de dois fótons, implementando a técnica em todo o mundo científico como um novo padrão para in vivo de imagens do cérebro.
A abordagem padrão envolve o implante da janela cranial (um buraco redondo no crânio coberto com uma tampa de vidro) sobre o tambor ou córtex visual do cérebro do rato 3. Em seguida, dependendo do protocolo experimental, o mouse sofre uma série de visualização e sessões de treinamento comportamental, permitindo monitorar as mudanças na atividade cerebral e morfologia neuronal ao longo do tempo 4,5. Em ambos os casos, a craniotomia só afecta o osso parietal, sem atravessar as suturas. Acredita-se largamente que a principal desvantagem da técnica é a sua aplicação limitada a córtices facilmente acessíveis, tais como o barril ou córtex visual. Implantação da janela craniana sobre outras regiões levanta uma série de dificuldades, devido a hemorragia excessiva e / ou impedimento espacial.
Neste trabalho, propomos a implantação da janela do crânio acima do córtex retrospl�ico (RSC) como outra possível região de interesse para dois fótons em microscopia vivo 6. RSC é um elemento importante do circuito do cérebro responsável pela formação da memória espacial. Anatomicamente, CER é uma parte de uma rede neuronal cortical de ligação, do hipocampo, do tálamo e as regiões 7. Isto éfortemente envolvido em uma série de comportamentos, tais como a aprendizagem e extinção espacial, bem como navegação espacial 6.
Para visualizar as alterações morfológicas dos neurônios usamos uma linha de rato transgénico expressando a proteína fluorescente verde (GFP) sob o promotor Thy1. Nestes ratos, GFP é expressa em aproximadamente 10% dos neurônios no cérebro que permitem a visualização clara dos axônios e dendritos corticais por meio de microscopia de dois fótons 8. Uma outra inovação que propomos consiste na injecção de um adeno-associado recombinante de vírus de serotipo 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica uma proteína fluorescente vermelha (mCherry) sob um promotor específico de neurónios CaMKII 9 nas estruturas mais profundas do cérebro que se projectam para RSC , tal como o hipocampo. A expressão de rAAV2 / 1 mCherry no hipocampo de rato Thy1-GFP permite a visualização simultânea de elementos pré- e pós-sinápticos do Hippocampo-Cortical sinapses 10. A expressão de rAAV-driven de mCherry requer duas a três semanas para a proteína para alcançar um nível suficiente nos terminais axonais. Este período é consistente com o tempo habitual necessário para a recuperação de craniotomia.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Nencki of Experimental Biology, da Academia Polonesa de Ciências.
Nota: Algumas das cenas do vídeo associado são acelerados. fator de velocidade é indicado nestas cenas.
1. Cirurgia Preparação
- Esterilizar todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas dispensáveis. Limpar a mesa cirúrgica, o quadro estereotáxico e toda a área circundante com 70% de etanol. Usar uma almofada cirúrgica estéril para criar um espaço estéril para todo o equipamento esterilizado. Corte gelfoam em pedaços pequenos e mergulhe-os em solução salina estéril.
Nota: De acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o etanol não é nem um esterilizante nem um desinfectante de alto nível. Ele só deve ser usado como um agente de limpeza / desengorduramento em superfícies previamente esterilizados. - Coloque o animal em thcâmara de indução e e definir o nível de isoflurano a 5% e fluxo de oxigênio a 2 L / min. Este procedimento deve demorar cerca de 3 min.
- Levar o animal para fora da câmara de indução. Use cauda ou dedo do pé pitadas, a fim de assegurar que o animal é completamente sedado.
- Usando um aparador preciso raspar o cabelo a partir da parte de trás da cabeça (entre as orelhas) até os olhos.
- Colocar o animal na moldura estereotáxica e estabilizar a cabeça com barras de ouvido.
- Definir níveis de anestesia para 1,5-2% isoflurano e 0,3 L / min de oxigênio.
- Aplicar a pomada.
- Injectar o animal com Tolfedine subcutaneamente (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) para prevenir a inflamação, dor e infecção, respectivamente.
- Injectar a intramuscularmente animal com Dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar inchaço cérebro.
Nota: É possível injectar dexametasona por via subcutânea ou por via intraperitoneal, para evitar danos do músculo. - Limpe a pele com scotonetes terile com Betadine seguido por 70% de etanol.
- Alterar as luvas e pulverizá-los com 70% de etanol.
Nota: Enquanto estiver usando luvas descartáveis não toque no campo estéril. Toque o animal apenas com as pontas dos instrumentos cirúrgicos estéreis e compressas estéreis.
Cirurgia 2. Cranial Janela
- Levantar a pele com fórceps e tesouras utilizando micro incisar a pele horizontalmente ao longo da base da cabeça e, em seguida, obliquamente para a frente ponto entre os olhos. Remova o retalho de pele.
- Aplicar lidocaína pomada com uma zaragatoa estéril no periósteo para evitar sangramento excessivo e dor.
- Use cotonetes estéreis ou um bisturi para remover o periósteo. Seque o crânio com compressas estéreis.
- Usando uma agulha estéril aplicar cola de cianoacrilato densa sobre as bordas da pele para os imobilizar e para evitar o contacto com cimento dental. Aguarde até que a cola secar.
- Coloque uma lamela 3 milímetros estéril sobre tele crânio anteriormente à sutura lambdoid. Centralizar a lamela na RSC coordenadas: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark as bordas lamela arranhando a superfície do crânio com uma agulha estéril. Coloque a lamela de volta para o recipiente esterilizado com 70% de etanol.
- Use uma broca dental de alta velocidade com pequenas rebarbas diâmetro para delinear um círculo 3 mm de diâmetro. Limpe o local de perfuração a partir do pó de osso com solução salina estéril cotonetes mergulhados. Use o gelfoam e cotonetes para parar o sangramento ocasional e limpar o osso.
- No meio de perfuração verificar a espessura do osso com uma pinça fina, tocando suavemente o círculo óssea e verificar sua mobilidade. Tenha em atenção que o osso é mais espesso na área da sutura. Pare a perfuração quando o círculo osso é móvel e só um mesmo, fina camada de osso é deixado sobre a circunferência. Limpar o campo operacional de todos os pó de osso restante com compressas de soro fisiológico mergulhado.
- Largue a solução salina estéril na área de perfuração, cobrindo o cir perfuradocle. Cuidadosamente retire o círculo osso com uma pinça fina e, em seguida, delicadamente mas com firmeza remover o osso, levantando-o para cima. Tenha cuidado para não distorcer o círculo de osso ao levantar-lo para evitar possíveis danos ao dura.
- Gentilmente aplicar o gelfoam embebido em soro fisiológico estéril sobre a dura para ajudar a parar o sangramento. Espere até que todos sangramento está totalmente parado. Retire cuidadosamente o gelfoam para não perturbar o processo de coagulação.
Nota: A área de sutura é altamente vascularizado, de modo que o sangramento neste momento pode vir a ser profundo. É essencial para esperar o tempo suficiente para que o sangramento parar completamente. É útil para manter o Gelfoam embebido em solução salina arrefecido colocando-o sobre gelo.
Injeção 3. Virus
- Fixe a bomba de infusão para a torre estereotáxica e ligar o controlador.
- Inserir a agulha 35G para a seringa. Lave a seringa 10 vezes com etanol para esterilizar e 10 vezes com solução salina estéril para remover vestígios de eThanol. Retirar as bolhas de ar a partir da seringa. Inserir a seringa para dentro da bomba.
Nota: Considere o uso de outros desinfectantes. - Descongelar uma dose única de rAAV2 / 1 Preparação mCherry (10 12 pfu é recomendado) e mantê-lo em gelo. Encher a seringa com a solução de vírus.
- Centralizar a agulha na bregma e insira suavemente no hipocampo utilizando as seguintes coordenadas: AP -2, ML +/- 1.0, DV-1. Estas coordenadas será localizada perto da borda da craniotomia. Espera durante 5 min para o tecido para estabilizar.
- Injectar 0,7 mL da solução rAAV2 / 1 mCherry à taxa de 50 nl / min. Esperar 10 minutos para que o vírus adsorver totalmente. Remova cuidadosamente a agulha. Seque com gelfoam se o sangramento ocorre. Repita com o site contralateral.
4. Cranial Janela Implantação
- Colocar a lamela esterilizada, secou-se sobre a parte superior da dura-máter no quadro do círculo perfurado. Segure a lamela com a forceps para achatar suavemente a dura e trazer lamela 'bordas mais perto da superfície do crânio.
Nota: É possível que a lamela perturba o coágulo e os currículos sangramento. Se for esse o caso, levantar a lamela, coloque-o em álcool, seco e volte para o passo 2.9. - Usando uma agulha estéril aplicar a cola de cianoacrilato densa nas bordas lamela para anexá-los ao crânio. Aguarde até que a cola secar.
- Coloque uma barra de fixação (porca M2 ou um projeto feito sob encomenda) na parte frontal do crânio. Aplicar a cola de cianoacrilato sobre as bordas da barra. Aguarde até que a cola secar.
- Coloque a barra de fixação numa posição que permita o posicionamento horizontal da janela craniana durante a imagem sessão. Coloque-o tão distante quanto possível a partir da janela. Se for colocado muito perto da janela, o bar e o parafuso conectando-o com o porta-feito sob medida pode representar um obstáculo para o objectivo, durante o processo de imagem.
- Criar um tampão com o acrílico dental, cobrindo o resto da área operacional, bordas da pele, barra de fixação, o que reforça a cratera em torno da janela craniana. Aguarde até que o cimento dental para endurecer.
- Remover o animal a partir do quadro estereotáxico e colocá-lo na câmara de recuperação.
- Aguarde até que o animal se recuperar da cirurgia, respeitando as funções fisiológicas.
- Aplicar analgesia pós-operatória (carprofeno, 10 mg / kg) e tratamento antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas.
5. Imagiologia
- Comece o laser de Ti: safira, poder-se o microscópio. O sistema utilizado nesta experiência é equipado com um laser de dois fotões, sistema OPO e PMT GaAsP dupla.
- Coloque o animal no Induccâmara ção e induzir a anestesia.
- Remover o animal a partir da câmara de indução e em lugar da máscara de anestesia de gás sob o microscópio. Diminuir o fluxo de oxigênio para 0,3 L / min ea concentração de isoflurano a 1,5-2%.
- Corrigir o animal ao corpo do microscópio personalizado com um parafuso M2 (ou outro sistema personalizado). Nivelar o janela craniana.
Nota: É possível usar o sistema de fixação de cabeça do fabricante do microscópio, embora a custom frame específica dá melhores resultados (maior estabilidade cabeça, posicionamento constante em várias sessões durante uma experiência crônica). - Usando as configurações de microscópio e uma ampliação widefield centro objectiva de baixa o ponto de vista de um dos lados do córtex retroesplenial e concentrá-la sobre a superfície da lamela.
- Aplicar uma gotícula de água para dentro do poço acrílico tipo cratera. Mudar para uma objectiva de imersão em água de longa distância. Mova o objectivo para a janela do crânio até o menisco de água conNECTS o espécime e objetiva.
- Mudar para as definições de dois fótons e começar a digitalizar o topo da amostra para baixo usando menor zoom. O cruzamento de dura-máter será visível como um brilho elevado de sinal não específico.
- Ajustar as configurações de aquisição de microscópio em ambos os canais (GFP e mCherry) de acordo com a intensidade do sinal a partir de células fluorescentes, a fim de cobrir toda a gama dinâmica.
- Depois de encontrar um neurônio adequado (com a árvore dendrítica separada de outras células) realizar uma verificação inicial usando apenas o filterset GFP com menor zoom e z-distância de 5 microns.
- Obter uma projeção máxima da pilha digitalizado e imprimi-lo para anotações (usando cores invertidas).
- Ajuste de zoom para um valor que irá permitir à imagem os detalhes morfológicos desejados. Imagem toda a árvore dendrítica nos canais GFP e mCherry usando projeção máxima como guia.
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Representative Results
A expressão de GFP em um subconjunto de neurónios no ratinho repórter Thy1-GFP permite a imagem in vivo dos dendritos corticais e projecções axonais locais no RSC. A Figura 1A mostra a projecção máxima de uma pilha de imagens múltiplas com dendrites GFP positivas visíveis. O corpo da célula é obscurecida por uma artéria. A Figura 1B mostra uma imagem ampliada único plano (zoom digital de 3x) do ramo dendríticas indicado no 1A. Detalhes da morfologia dendrítica (espinhas, filopódios) são claramente visíveis. O canal de GFP é adquirido utilizando o filtro de emissão de passagem de banda 500-550 nm.
Uma injeção do rAAV2 / 1 mCherry no hipocampo dorsal permite a visualização dos axônios do hipocampo e boutons sináptica terminando em RSC. Estes terminais podem ser detectadas no canal mCherry (a emissão de passagem de banda filtrar 570-610 nm).
Figura 1. De dois canais in vivo de imagens de dois fótons de neurônios RSC e projeções do hipocampo para RSC. (A) Uma visão geral das células que expressam GFP em um fragmento de RSC (imagem mostrada em cores invertidas). projeção máxima indicada de uma pilha de espessura 100 mm tomada em baixa ampliação (0,7x zoom digital). (B) plano óptico Única do fragmento indicado no (A) adquiriu em grandes ampliações (3x zoom digital) no canal de GFP. (C) fragmento plano óptico único indicada em (A), utilizando as configurações de aquisição mCherry. Ver Protocolo para obter detalhes sobre os filtros de detecção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No presente trabalho apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de dois fótons de imagem in vivo das entradas sinápticas e metas pós-sinápticos em RSC através de uma janela craniana. O procedimento de implantação consistem em vários passos-chave. Em primeiro lugar, o animal é anestesiado profundamente e fixada na moldura estereotáxica, em seguida, o crânio sobre RSC é diluído com uma broca ao longo das linhas circulares marcados e o osso circular é removido. Após a hemorragia é parada, o rAAV2 / 1 mCherry é injectado no hipocampo, e o vidro de cobertura é fixada ao crânio sobre a área perfurada. Finalmente a barra de fixação é fixada sobre a cabeça e o animal é colocado na câmara de recuperação durante 48 horas. Após aproximadamente 2-3 semanas necessárias para a expressão do vírus, o CER pode ser visualizado. O protocolo de imagens compreende os seguintes passos. Em primeiro lugar, o animal é anestesiado e fixado sob o microscópio. O foco é então definida usando o microscópio de campo amplo, o sistema é switched para o modo de dois fótons e os canais de interesse (GFP e mCherry) são visualizados.
A técnica apresentada oferece uma grande melhoria sobre os protocolos anteriormente descritos. Na abordagem padrão, apenas um tipo de um rótulo pode ser detectada. Pode ser utilizado para imagem local projecções axonais e árvores dendriticas, mas não há estudos de ligação de longo alcance fosse possível. Ao combinar duas proteínas fluorescentes que permitiu o rastreamento simultâneo de elementos pré e pós-sinápticos. Isto permite que a longo prazo monitorização in vivo das conexões sinápticas putativos.
A fim de obter os melhores resultados com o procedimento descrito, é importante prestar atenção a vários passos críticos. Durante a elevação do círculo osso no passo 2.8 qualquer dano à dura-máter pode causar inflamação e prejudicar a transparência da janela craniana. paralisação insuficiente de sangramento no passo 2.9 ou em qualquer outra etapa do procedimento resulta em accumulat sangueião positivo sob a janela e reduz significativamente o campo de visão. Depois de injectar o vírus é vital para aguardar durante pelo menos 10 min antes de remover a agulha, a fim de que o vírus para infundir para o tecido em apenas o local da injecção. Isto limita a possibilidade de infecção indesejável do córtex com o vírus durante a remoção da agulha. A área da transfecção viral deve ser examinado com uma análise histológica post hoc do tecido cerebral. Qualquer expressão mCherry nas células ao longo do traço agulha deve ser evitada. O tempo de recuperação padrão é de 3 semanas. Este período é suficiente para o vírus de alcançar uma expressão estável nas projecções sinápticas e para a janela craniana para curar totalmente e estabilize. Os animais devem ser alojados único, a fim de impedir a remoção do implante janela craniana pelos companheiros de gaiola. A utilização de uma gaiola alargada pode ser considerado a fim de evitar danos acidentais da janela craniana batendo as barras de metal. fixação estável do mouSE sob o microscópio é essencial. Qualquer movimento da cabeça, incluindo os movimentos respiratórios, pode causar diminuição significativa da qualidade das imagens obtidas. É também útil para posicionar a janela craniana horizontalmente para o objectivo, para limitar possíveis problemas com a aquisição de foco igual para a totalidade do plano da janela. critérios claros para a resolução de espinhos e boutons deve ser aplicada. Geralmente, boutons são definidos como inchaços axonais tendo um diâmetro, pelo menos, 3 vezes maior do que a fibra de sete anterior. Espinhas são definidos como saliências claramente distinguíveis do eixo dendrite que contêm uma cabeça bulbosa. Além disso divisão em populações de fino, curto e grosso, cogumelo e espinhas ramificada é possível 3. Devido à resolução axial relativamente pobre da microscopia de dois fótons, a análise dos espinhos que se projetam ao longo do eixo óptico devem ser evitados 3. A fim de distinguir claramente boutons e espinhas funcionais, um post hoc imunomarcaçãopode ser realizada a fim de identificar marcadores pré e pós-sinápticos 7.
Embora o protocolo apresentado provou ser a mais favorável em nossos projetos experimentais, é possível modificá-lo, a fim de se ajustar diferentes objetivos experimentais. Às vezes é mais adequado para uso de anestesia injetável (como cetamina-xilazina) em vez de isoflurano, mas é importante para ajustar adequadamente a dosagem, tendo em mente as diferenças na sensibilidade às drogas entre camundongos de diferentes linhagens, idade e sexo. É possível utilizar um trépano broca em vez de uma esfera para a perfuração, mas poderia aumentar o risco de danos para a dura-máter. solução salina estéril pode ser substituído com sucesso com fluido cerebrospinal artificial (ACSF), mas é importante para manter estéril em todos os momentos durante a preparação e operação. ACSF é estável durante 3-4 semanas após a preparação, e se qualquer contaminação ocorre antes desta vez deve ser imediatamente descartado. FIXAÇÃO cabeça diferentesem dispositivos podem ser aplicados, dependendo do desenho experimental, incluindo a possibilidade de observar o rato desperto sob o microscópio de dois fotões.
Como qualquer outra técnica, este também tem suas limitações. O microscópio de dois fotões permite a visualização do tecido cerebral de até 500 mm de profundidade a partir da superfície da dura-máter. Para exame das estruturas cerebrais profundas modificações adicionais devem ser aplicadas. Nosso protocolo permite o acesso a mais de RSC, mas a parte da estrutura escondido sob o seio sagital superior ainda não está acessível. A resolução do microscópio de dois fotões não é suficiente para a identificação de uma sinapse específico, bem como a análise morfológica detalhada das espinhas dendriticas. Outras técnicas, tais como microscopia electrónica de correlação deve ser aplicada a fim de confirmar a existência de uma estrutura presumida. Também é importante mencionar que esta é uma técnica cirúrgica relativamente difícil e não é recommended para um operador inexperiente.
A técnica apresentada pode ser aplicada em uma ampla gama de experiências. Pode ser modificado para pesquisa de diferentes regiões do cérebro acessíveis com o microscópio de dois fotões. Ele permite o monitoramento simultâneo de axonal e alterações dendríticas durante a variedade de estados fisiológicos e patológicos, incluindo processos cognitivos e envelhecimento ou progressão de neurológicas e psiquiátricas. Ele permite a utilização de promotores específicos de células para visualizar projecções neuronais provenientes de subconjuntos definidos com precisão. Ele também pode ser ajustado de acordo com os protocolos de experimentos em animais acordados e se comportar. Além disso, proteínas sensíveis ao pH ou em cálcio pode ser expressa no cérebro, a fim de visualizar não só a morfologia neuronal, mas também alterações na actividade e a função da célula. Uma outra possível modificação da abordagem é o uso de um serotipo diferente de rAAV para expressão mCherry. O quimérico PR 01/02 serotipoovides expressão robusta no local da injecção com início suficientemente rápida (2-3 semanas). Os níveis mCherry manteve-se estável durante pelo menos 12 semanas após o aparecimento inicial e qualquer marcação retrógrada foi detectado nas nossas experiências. A fim de obter marcação retrógrada, um serotipo diferente pode ser utilizado, tal como rAAV9. As sessões de imagem pode ser realizada em qualquer frequência, no entanto, pelo menos, 24 horas de intervalo é recomendado, a fim de permitir a recuperação adequada do animal após a anestesia. Se aplicado corretamente, esta técnica permite a execução de várias sessões de imagem da mesma região ao longo de vários meses. Para as experiências de longa duração (superior a 6 meses), um sistema Cre / LoxP pode ser usado com a recombinase entregue com o vector de AAV em uma linha de floxed rato GFP.
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Disclosures
Os autores (KL, MR, KR) têm direitos de patente pendentes (PL410001) para o chassis de suporte usado neste artigo.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a M. Steczkowski para gravações de voz, M. Borczyk para desenhos, A. Trąbczyńska para a produção de vírus, M. Ziókowska para genotipagem e A. Mirgos de assistência com as filmagens. KR reconhece o presente tipo do vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressam a proteína fluorescente mCherry sob o controlo do promotor de CaMK K. Deisseroth. Este projeto foi realizado nas instalações centrais do Laboratório de modelos animais e Laboratório de Estrutura do tecido e função, Centro de Neurobiologia, Nencki Instituto de Biologia Experimental, com a utilização da infra-estrutura da CEPT, financiado pela União Europeia - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional "Economia inovadora" para o período 2007-2013. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 para KR e Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 a RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
