Summary
流式细胞仪可用于T细胞内的染色质评估的状态。该协议允许科学家在T细胞活化的增加的荧光组蛋白H3的抗体的平均荧光强度（MFI）证明解释染色质解聚的证据
Abstract
在一个适当的免疫应答，静止T细胞成为经抗原呈递到其抗原特异性T细胞受体激活。这导致只有那些T细胞而承受的受体识别抗原的克隆增殖。染色质解聚是T细胞活化的标志并且对于T细胞获得抗原接合之后增殖的能力是必需的。可以使用针对组蛋白抗体来检测这种变化中染色质凝聚。这些抗体不能绑定到他们的幼稚T细胞表位，以及他们可以在活化的T细胞。我们描述了如何同时染色T细胞特异性表面标记，跟踪生存能力有可以解决的死细胞染色，并通过组蛋白H3蛋白的细胞内染色质测量状态。染色的细胞通过流式细胞仪分析和染色质凝聚状态测量为组蛋白H3染色的平均荧光强度（MFI）。 Chromat在过程中的T细胞激活解聚是表现为增加的MFI
Introduction
流式细胞术是用于在细胞群的多个物理和荧光参数的分析开发出一种基于激光的技术。这种技术可以作为悬浮细胞中的流体相遇流的激光器，令人兴奋的荧光标记上或在细胞内。这些标记然后发出被检测到并且通过光电倍增管定量的光。虽然流式细胞历来用于鉴定细胞群，它已被证明研究细胞的性能，包括细胞膜完整性，蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质运输1-3的阵列时是一种有用的技术。我们已经开发出一种协议，它允许这种技术也可以用于检测染色质在T细胞的状态，因为它们是在体外 4激活。我们也使用该协议来研究T细胞5的活化诱导染色质解聚的机制。
T细胞活化法制n和扩散是一个适当的免疫反应的关键。 T细胞，免疫系统内淋巴细胞的特定子集，需要进行适当的免疫应答和免疫记忆的发展。当抗原呈现在主要兼容性复杂的T细胞受体（TCR）位于静止的T细胞的细胞外表面（6中综述）的上下文激活被启动。这触发了一系列的T细胞内为最终结果的增加细胞内钙离子浓度7和所需的活化（以8-10中综述）转录因子的核转位的动态和高度有序分子事件。一旦被激活，T细胞获得对以白细胞介素-2（IL-2），利用所述JAK（JAK激酶）/ STAT一个有效的生长因子作出反应的能力（信号转导及转录激活因子的）途径，以驱动激活的T克隆增殖细胞11。简言之，将IL-2的刺激结果在STAT蛋白，一个家庭的潜胞质转录因子的磷酸化。一旦磷酸化，STAT蛋白二聚化，转位到细胞核并驱动的基因，包括那些涉及细胞周期进程的表达。在T细胞中，经由STAT5，这是需要的T细胞增殖12,13的IL-2的信号。
为了实现活化的T细胞的克隆扩增，那些没有经历抗原的TCR接合（幼稚T细胞）细胞，必须有一种机制来忽略的IL-2的强效作用。这是通过染色质状态的调节来实现的。幼稚T细胞具有稠染色质，禁止STAT5-DNA的接合应答IL-2刺激。在激活时，染色质decondenses和STAT5的可以访问的靶基因的启动子，允许克隆增殖4。有趣的是，这种变化在染色质状态是不依赖于组蛋白protei的表观遗传修饰NS（综述见14），我们观察到在T细胞活化4组蛋白修饰没有全球变化。
在执行这些研究中，我们发现，提出对组蛋白抗体也很难进入在幼稚细胞表位的，但在活化时能更容易地结合它们的表位4。因此，抗体结合到组蛋白用作读出为染色质凝聚状态。这里，我们提出的方法使用流式细胞术来检测荧光缀合组蛋白H3的抗体，以在T细胞评估染色质状态。在细胞群体染色质缩合测量为组蛋白H3染色的平均荧光强度（MFI）。在T细胞活化，对组蛋白H3染色的增加的MFI，表示染色质的解聚的上下文。除了通过细胞内的组蛋白H3的染色质检测情况，该协议还incorporaTES表面染色和可修复染色的活细胞，允许细胞亚群的分析。
Protocol
这项研究进行了严格按照指南中的美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用的建议。动物方案得到批准弗曼大学机构动物护理和使用委员会（许可证号：A3242-01）。所有材料在这个协议中使用的设备能材料和设备的表中找到，而使用的缓冲器可缓冲和解决方案的表中找到。
1.单细胞悬液的淋巴细胞从小鼠脾脏
- 通过二氧化碳窒息牺牲老鼠。确认安乐死颈椎脱位。
注意：使用脾脏从同一性别两个6-8周龄同基因小鼠（例如，C57B / 6）。通常情况下，二脾脏被处理。 - 喷动物大汗，用70％的乙醇溶液和定向，使得头朝左。
- 使用镊子，提起动物的皮肤向上和远离吨他的身体。使用剪刀，通过附近的动物的腹部皮肤切开一个小切口。用手指，拉出槽口的每一侧，以从颈部腹膜暴露于后腿的开头。脾应可见直接腹膜下方。
- 使用镊子，提起腹膜，并做一个小切口，显露脾。用钳子取出脾并用剪刀戏弄离开任何脂肪和结缔组织。
- 将脾脏到50毫升锥形管中含有10毫升的PBS补充有2％胎牛血清（以下简称为PBS + 2％）。保持管在冰上直至准备开始单细胞悬浮液。
注意：典型的恢复是每脾之间60-90百万个细胞，并且通常，需要2百万细胞，每个样品。执行所有以下步骤在组织培养罩。 - 滗脾脏进入无菌100mm组织培养皿。
- 获得两个磨砂显微镜载玻片和保持牛逼他滑动，使得两个粗糙磨砂表面面对向内朝向彼此。湿润PBS + 2％的溶液中的幻灯片倒入培养皿。
- 保持幻灯片的磨砂表面之间的脾，与仍然淹没的边缘，并通过移动来回滑动相互对抗（ 图1A）轻轻研磨脾脏。这些细胞会落入培养皿。继续打磨，直到所有的细胞已被释放，脾的遗骸出现白色（ 图1B）。
- 绘制出的细胞悬浮液在吸管，并通过70微米的过滤器过滤它慢慢倒入一个新的无菌50ml锥形管中。需要注意的是小件红髓将存在于过滤器（图2A）。
- 如果过滤器上升，轻轻将其提起略微以允许流体排出，通过与将过滤器放回50ml锥形管中并继续，根据需要重复这个过程。如果在处理超过5 spleENS，可能有必要分成两批，并使用一个新的过滤器的每个。
- 用3毫升注射器的止动部轻轻按压穿过滤网（ 图2B）含有剩余细胞红髓。一定要按下两个过滤器底部和侧面，以确保所有的红髓已通过过滤器（图2C）通过。
- 添加10 mlof PBS + 2％的组织培养皿中，并用它来洗幻灯片，注射器限位装置，菜以回收剩余的细胞。通过相同的70微米的细胞过滤到50毫升锥形管传递此。这个步骤需要重复。
- 离心过滤的细胞悬浮液在300×g离心5分钟，在4℃。
- 轻轻倒出并弃去上清液，注意不要打扰颗粒。的PBS + 2％一丝金额将留在管。帽管和轻弹沉淀，直到沉淀完全重悬。
- 裂解红细胞按广告丁2毫升的ACK裂解缓冲液（0.15M的氯化铵 ，1mM的KHCO 3，0.1mM的EDTA，pH为7.2，保存于4℃）每脾到锥形管并旋转和反转管，以确保所有的细胞接触到该ACK缓冲器接触。轻轻旋转管在室温1分钟。
- 通过加入PBS + 2％管以中和该ACK缓冲器使细胞悬浮液的体积至50ml。倒置该管的10倍，离心5分钟，在300×g离心在4℃下。离心完成后，将沉淀应该是白色的（图3）。
- 轻轻倒出并弃去上清液，注意不要打扰颗粒。离开的PBS + 2％的微量在管，帽管，并轻弹颗粒重悬了。
- 加入10 mL的T细胞培养基[10％FBS的10mM HEPES（pH 7.0）中，2毫含有GlutaMAX，1mM丙酮酸钠，1×非必需氨基酸，1×青霉素/链霉素和50mMβ巯基乙醇〕，和进一步的轻轻悬浮颗粒上下吹打。然后通过一个新的70微米的过滤器过滤该悬浮液到一个新的50ml锥形管中。
- 使用另一个5-10毫升的T细胞培养基冲洗原管，并通过70微米的过滤器通过该入含有过滤细胞的其余部分的管。如果在处理两个以上的脾脏，T细胞培养基的体积可增加到最大限度回收。
- 保持细胞在冰上，直到准备染色。细胞应该算和可行性进行访问。
- 计数细胞，结合3 ml的细胞用24毫升的PBS + 2％和3 ml的0.4％台盼蓝。负载10毫升到这一种改进的Neubauer血细胞计数器的每个腔室。可行性的评估，台盼蓝染色，通常为85-95％。
2.活力和表面染色
- 沉淀细胞，在300×g离心离心10分钟，在4℃。重悬的细胞在T细胞培养基至1×10 7个细胞/ ml的浓度。 TRANSF器2百万细胞（100毫升）中成U形底96孔组织培养板的孔中。
- 离心96孔板10分钟，300×g离心在4℃下。
- 井由孔板进水槽内轻弹除去液体从每个上清液（细胞沉淀将保留在孔）并在干净的纸巾涂抹在板。通过再悬浮他们在200μl的PBS洗涤细胞，然后离心以300×g离心在4℃下10分钟。除非另有说明执行所有洗涤这种方式。
注：请不要使用PBS + 2％，因为它会与定像PI染色干扰。 - 通过轻弹板除去上清液，加入100毫升新制备的商用染色剂（ 例如 ，可固定红死细胞染色）的各孔。
- 通过稀释在DMSO活性染料原液1点10分，随后用1:10稀释在PBS使污渍。孵育板在4℃下避光30分钟。
- 离心在p迟在300×g离心10分钟，在4℃。在这一点上前进，执行与该板与组织文化引擎盖光了所有的工作。
- 通过轻弹平板去除上清，再加入100毫升的Fc块解决方案。制作的Fc封闭液稀释的Fc块原液1：在PBS 100。
- 要使用的稀释抗体表面染色（例如，抗CD4或抗CD8）在PBS中，加入100 ml的每个孔中。孵育96孔板30分钟，在4℃下避光。
注意：表面染色的抗体应滴定以获得最佳性能。通常使用1：200和1：400稀释，根据制造商的协议。
3.细胞内染色的组蛋白H3
- 以下表面染色温育后，在PBS中洗细胞两次。
- 最后一次洗涤后，加入100μl的4％多聚甲醛的每个孔中。孵育96孔板5分钟，在RT。使4％多聚甲醛通过dilut荷兰国际集团在PBS 16％多聚甲醛。使这个新鲜的。
- 在PBS洗涤细胞两次。
- 使彼尔姆/砌块溶液（股票彼尔姆溶液是PBS + 2％+ 0.02％的Triton X-100，保存于4℃）用正常兔血清的每100毫升的库存彼尔姆溶液将2ml。做足够的60毫升/样本。
- 添加40毫升永久/块到每个样品孔拌匀轻轻吹打向上和向下，注意不要让泡沫。孵育板在室温在黑暗中45分钟。保存剩余的烫发/块步3.6。
- 稀荧光缀合的组蛋白H3K4me1抗体在步骤3.5保留彼尔姆/砌块溶液，并添加10微升该稀释的每个孔中。轻轻吹打向上和向下混合。孵育96孔板在黑暗中进行1小时，在4℃。
注意：使用的H3K4me1抗体使用R-藻红蛋白缀合试剂盒按照制造商的说明，缀合。 - 两次在PBS + 2％洗细胞。
- 悬浮细胞在200μLPBS + 2％和转移样本，以FACS管用于流式细胞术分析。样品可以储存在4℃下在黑暗中。为了达到最佳效果分析样品在两天之内。单独使用染色的样品可以用作流式细胞补偿控制。
Representative Results
从一个C57B / 6小鼠的淋巴细胞根据该协议处理成单细胞悬浮液，并用标准血细胞计数器计数。细胞接种在一式三份以2×10在T细胞培养基6 / ml的在15ml锥形管中，并加以治疗，或在刺激1毫克/毫升的可溶性抗CD3抗体（克隆4C11）3小时，在37℃一个标准的组织培养孵化器。死细胞染色，然后细胞然后进行表面使用的FITC的CD8和APC CD4抗体按照协议染色。组蛋白辅助经流式细胞术（ 图4）进行分析。在这两种幼稚CD4 +和CD8 + T细胞的平均荧光强度（MFI）为低，表示稠染色质状态。作为细胞用抗CD3抗体激活MFI的增加显著（P <0.001，学生t检验），表明已染色质解聚。
图1. 技术用于处理脾成使用磨砂显微镜载玻片单细胞悬浮液。（A）中的脾被压靠在两个显微镜载玻片的磨砂表面。 （ 二）幻灯片来回移动对对方释放淋巴细胞到100毫米的培养皿，直到脾脏的遗体是白色的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2.使用 注射器塞子按通过70mm的细胞过滤剩余的红髓。（A）脾脏后剩余的红色纸浆我 š加工成单细胞悬浮液，并通过70毫米细胞过滤通过。 （B）一种3毫升注射器的止动部分用于轻轻按通过细胞过滤剩余的红髓。 （ 三）用注射器之后，应该几乎没有红髓留在细胞过滤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. ACK裂解红血细胞。从至ACK裂解之前单个小鼠脾脏中产生的单细胞悬浮液（A）中离心。 （B）中的红血细胞ACK裂解后，将细胞沉淀为白色。获得=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图 协议的代表性 的成果 。（A）选通方案用于分析CD4 + T淋巴细胞的染色质状态。 （B和C）的T细胞不处理或用1毫克/毫升的可溶性抗CD3抗体3小时（一式三份）激活。然后将细胞通过流式细胞术分析，以确定在CD4 +细胞（B）和CD8 +细胞（C）的染色质凝聚。数据是平均值±H3K4me1染色的平均荧光强度的标准偏差。 * p <0.001（学生t-检验 ） 请点击ħERE查看该图的放大版本。
表1：故障排除指南的快速参考常见问题和可能的解决方案。
Discussion
我们开发了一个协议，允许染色质凝聚在T细胞的评估。它依赖于组蛋白H3抗体无法访问其表位易于在幼稚细胞的简单的观察，但在T细胞活化，这些相同的抗体能够结合其表位。通过比较MFI组蛋白H3的治疗组之间的染色，缩合或解聚的相对程度可被确定。我们已经使用该协议，以确定在胸腺细胞发育，并在T细胞活化4相对的结露状态。我们也使用该协议来研究用于控制解聚过程5所述的机制。
这个协议依赖于使用一个组蛋白H3抗体来检测染色质凝聚状态。由于是在T细胞活化4组蛋白修饰没有全球变化，我们能够使用H3K4me1抗体来评估染色质在本协议中的地位。我们已经使用了针对未修饰组蛋白H3抗体;然而，所产生的信号是弱得多的整体。根据我们的经验，提出对修饰的组蛋白H3抗体免疫工作更好，流式细胞仪检测，而抗未修改的组蛋白H3在Western印迹更好地工作。必须指出的是，也可以使用了针对其他组蛋白的抗体，尽管我们并没有试图它。
彼尔姆/砌块和组蛋白H3抗体步骤是在协议中最重要的步骤。需要使用的彼尔姆/砌块溶液量的库存彼尔姆溶液制成每次进行优化。这可以通过比较原液不同稀释度的性能来完成。一个典型的实验涉及幼稚T细胞的那些3小时（图4）激活的比较染色质状态。每个人都应该选择在产生变化最大的小额信贷机构的稀释的时间段进行分析。原液可以在PBS + 2％稀释由第一重悬细胞中高达100毫升的PBS + 2％步骤3.4之后，然后加入彼尔姆/砌块在步骤3.5以降低彼尔姆/砌块强度。类似的预试验应该使用新的批次的抗体被标记每次测试荧光缀合的组蛋白H3抗体的不同稀释。这些步骤是成功侦破凝结差异在T细胞活化早期尤为重要（ 例如，在3个小时的激活）。偶尔也有细胞没有得到透化，因而不会与组蛋白H3抗体染色。这可能是由于细胞没有悬浮以及加入烫发/块时，或者发生，如果烫发/块还不够强大。这些细胞会显示为可视化的组蛋白H3染色直方图时压在轴事件。由于这些事件将歪斜的整体MFI，这些事件可以从分析由gatin省略克组蛋白H3阳性细胞的正常分配。其他帮助可在故障排除指南（ 表1）中找到。
列入一个可固定死细胞染色允许对细胞活力在测定中评估。操作T细胞的活化，因为某些刺激可以诱导细胞死亡时，这绝对是至关重要的。在这样的情况下，该组蛋白H3抗体可以结合于死亡细胞组蛋白不同于活细胞，导致的结果的曲解。
这种协议被设计为在96孔板形式使用，允许的染色质状态的高通量分析。从6-8周龄雌性小鼠脾脏通常会产生使用的协议之间的60-90万个细胞。由于染色协议需要每个样品2百万细胞，人们可以很容易测定在单个96孔板中一式三份单个脾多个治疗组和时间点。有可能为perform每个样品更少细胞的协议;然而，由于离心步骤的数目和细胞的每个步骤的固有损耗，这是不可取的由多，以降低细胞的数目。我们已经成功地完成了每样品1百万个细胞的协议。
我们利用这个协议来检查CD4 + T辅助细胞和CD8 +细胞毒性T细胞染色质状态。这是可能的，因为该协议包括标准表面染色。该协议可以很容易地适合于染色质在其他淋巴细胞亚群通过使用抗人群特异性表面标志物的检查。该协议也很容易，只要适用于其他类型的细胞的抗体识别相关的表面标志是可用的，适当的固定/通透条件是已知的。
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这个项目是由卫生部（5 P20 RR016461和8 P20 GM103499）的国家机构的资金支持，美国国家科学基金会（EPS-0903795）。通过弗曼大学的研究和专业成长和弗曼优势奖项提供了进一步的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
| Precleaned frosted microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 3 ml syringe, Luer-Lok tip | BD | 309585 | |
| Falcon 50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352098 | |
| LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit | Life Technologies | L23102 | Life Technologies sells versions of this kit with different colors |
| Fc Block | BD Biosciences | 553142 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Normal rabbit serum | Sigma-Aldrich | R9133 | |
| Anti-H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| R-Phycoerythrin conjugation kit | Abcam | ab102919 | Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used |
References
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