Abstract
بسبب التماثل البنيوي والوظيفي لخلايا الشعر في الأذن الداخلية الثدييات والخلايا العصبية التي يعصب على ذبابة الفاكهة الحواس الخارجية توفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة mechanosensation. يصف هذا البروتوكول سلوك مسة بسيطة في ذباب الفاكهة التي يمكن استخدامها لتحديد الطفرات التي تتداخل مع mechanosensation. التحفيز عن طريق اللمس من macrochaete الخشن على الصدر من الذباب يثير رد فعل الاستمالة إما من المحطة الاولى أو الثالثة. الطفرات التي تتداخل مع mechanotransduction (مثل NOMPC)، أو مع غيرها من جوانب القوس الانعكاسي، يمكن أن تمنع استجابة الاستمالة. ومن شأن الشاشة التقليدية للسلوكيات الكبار قد غاب المسوخ التي لها أدوار أساسية خلال التنمية. بدلا من ذلك، هذا البروتوكول يجمع بين شاشة تعمل باللمس مع تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM) للسماح فقط مناطق محدودة من خلايا متحولة متماثل إلى أن تتولد والتي تمثلت في EXPRession من البروتين الفلوري الأخضر (GFP). عن طريق اختبار استنساخ MARCM عن الاستجابات السلوكية الشاذة، فمن الممكن أن يحجب مجموعة من الطفرات المميتة ف عنصرا للبحث عن جينات جديدة تشارك في mechanosensation التي كان غاب عن الأساليب الأكثر تقليدية.
Protocol
1. الصلبان لتوليد الذباب MARCM
- الحفاظ على الذباب على وسائل الإعلام الذرة الدبس (6.5 غرام / L أجار، 23.5 غرام / لتر خميرة، و 60 غرام / L دقيق الذرة، و 60 مل / لتر دبس؛ 4 مل / L مزيج حمض، 0.13٪ Tegosept) أو معيار وسائل الإعلام ذبابة الفاكهة في 22 درجة مئوية في ضوء 12 ساعة / دورة الظلام.
ملاحظة: يتم استخدام أقل من درجة حرارة قياسية للحفاظ على MARCM المخزونات صحية. ويمتد هذا الوقت التنموي بين البيض والبلوغ إلى 14 يوما. - استخدام الإناث البكر (حوالي 1-8 أيام من العمر) من الأسهم MARCM جاهزة تحتوي على العناصر الجينية اللازمة (GFP تحت سيطرة تسلسل تفعيل المنبع (UAS-GFP)، وبروتين كاظمة Gal80، عامل النسخ GAL4، ل الحرارة صدمة recombinase مدفوعة، وموقع إعادة التركيب FRT).
ملاحظة: لدينا مخزون MARCM الجاهزة تحتوي على المورثات التالية: elavGal4، UAS-CD8-GFP، HS-flipase. FRT40A، tubGal80 / CYO. tubGal4 / TM3Sb.
ملاحظة: سوف يتوقف الموقع FRT معين على موقع طفرةفي الجينوم. على سبيل المثال، يتم استخدام FRT40A لاختبار الطفرات على ذراعه اليسرى من كروموسوم 2، مثل NOMPC (انظر 10 لمزيد من التفاصيل حول بروتوكولات MARCM). - عبر MARCM استعداد الإناث البكر للذكور التي تحتوي على طفرة في المصالح وما يقابلها من موقع FRT (على سبيل المثال، W-؛ NOMPC3، FRT40A / CYO؛ + / +). للسيطرة على فعالية تحريض MARCM، تعيين عرضية الثاني باستخدام الذباب الذكور تحتوي على نفس الموقع FRT، ولكن من دون الطفرة. استخدام نسبة تقريبية من 5 إناث: 1 ذكر في الصلبان.
2. توقيت وضع البيض
- بعد السماح الذباب للتزاوج ليلة واحدة على الأقل، نقل البالغين في قوارير جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة. السماح الذباب لتضع بيضها في بيئة مظلمة لنحو 4 ساعات قبل نقل الصلبان مرة أخرى في قوارير جديدة. نلاحظ بداية ونهاية أوقات فترة وضع البيض.
ملاحظة: فترات أقصر مقبولة عندما يبدو أن هناك عددا كبيرا من البيض على وسائل الإعلام قبل نهاية interva 4 ساعةل.- الحفاظ على قارورة مع وجود عدد كاف من البيض (نحو أكبر من 20) وتخزينها في ضوء 12 ساعة / دورة الظلام في 22 درجة مئوية لتكون الحرارة صدمت في وقت لاحق.
ملاحظة: قوارير مع عدد قليل من البيض على وسائل الإعلام (أقل من حوالي 20) من غير المرجح أن تسفر عن أعداد كافية من الذباب الكبار لاختبار السلوك ولمصلحة من الكفاءة فمن المستحسن ألا يتم الاحتفاظ بها لإجراء مزيد من التجارب.
ملاحظة: يتم رفع الذباب لدينا مع أضواء على 08:00 حتي 08:00. لقد وجدت الوقت مساء تؤدي نقطة لكثافة البيض أعلى، وبالتالي تؤدي عادة الصلبان التوقيت بين 4-8 مساء و 8:00 منتصف الليل. الذباب تضع بيضها في RT في خزانة مظلمة ثم يتم إرجاعها إلى حاضنة في اليوم التالي حتى لا تعكر صفو دورة ضوء الظلام العادية في الحاضنة.
- الحفاظ على قارورة مع وجود عدد كاف من البيض (نحو أكبر من 20) وتخزينها في ضوء 12 ساعة / دورة الظلام في 22 درجة مئوية لتكون الحرارة صدمت في وقت لاحق.
3. تنفيذ صدمة الحرارة للحث على الميتوزى إعادة التركيب
- حوالي 85-100 ساعة بعد وضع البيض، المكان الخامسأمية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تأكد من أن مستوى المياه تصل إلى أعلى ذروة وسائل الإعلام في قارورة، ولكن لا تغرق بالكامل في قارورة لمنع اليرقات من الغرق.
- إزالة قارورة من الحمام المائي والسماح لفترة نقاهة 1 ساعة على RT.
- مكان قارورة مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 1 ساعة.
- إزالة قارورة من الحمام المائي وتخزينها في حاضنة على 12 ساعة ضوء / دورة الظلام في 22 درجة مئوية حتى eclosion.
4. التحضير لاختبار السلوكي
- بعد eclosion، تخدير الذباب على الجليد. حدد الذباب مع المورثات التي تحتوي على جميع العناصر الوراثية لMARCM وتشير من المرجح أن تكون لوحظ GFP استنساخ بعلامات التعبير استنادا إلى علامات النمط الظاهري ملاحظتها المستخدمة في مخزونات الأصل. قطع رأس الذباب مع مقص قطع القزحية.
ملاحظة: على سبيل المثال، اخترنا لالذباب دون علامات وراثية CYO (أجنحة مجعد) وبينالي الشارقة (الشعر الخشن قصبة) إلى هوية منذالذباب السنة المالية التي من شأنها أن تحتوي على جميع العناصر الوراثية اللازمة لإنشاء مناطق الفسيفساء التي تحمل علامة GFP.
ملاحظة: قطع الرأس ضروري لمنع الكبار من التحليق بعيدا عندما حفز. - وضع الذباب مقطوعة الرأس في بيئة رطبة المغلقة والسماح حوالي 10-20 ساعة من الانتعاش. استخدام الوحيد الذباب هذا الحق بأنفسهم عندما يستسلم لإجراء مزيد من التجارب. الذباب اختبار غضون 30 ساعة من قطع الرأس.
5. اختبار السلوكي
- من خلال مراقبة الذباب مقطوعة الرأس تحت المجهر مضان تشريح وتحديد استنساخ متماثل ملحوظ مع GFP في الشعر الخشن الحواس الخارجية. تسجيل اسم الشعر الخشن والجانب الأيسر أو الأيمن. للقضاء على أي تحيز محتمل، يجب على أعضاء المختبر أداء تحفيز الشعر الخشن يكون أعمى لوراثى من الشعر الخشن، من النوع البري أو متحولة.
- تثير رد فعل الاستمالة من خلال تشتيت GFP ملحوظ الشعر الخشن في اتجاه الجسم الطاير مع شعرة قاسية أو ملقط غرامة ومراقبة إعادة الساقاستجابته. إعطاء درجة واحدة إلى الذباب الذي رفع الساق في الاستجابة لتحفيز الشعر الخشن وعلى درجة من صفر إلى الذباب التي لا تتحرك أرجلهم.
ووصفت السابق الدراسات 6،7 الاستجابة الساق التي يتم استخلاصها من خلال تحفيز الشعر الخشن خاص: مذكرة. وهذا يشمل المحطة التي تستجيب لكل الشعر الخشن ونسبة الذباب التي تستجيب لتحفيز ذلك الشعر الخشن معين. سجلنا فقط عن تحركات المحطة التي كنا نتوقعها للرد على أساس تصنيف Vandervorst في 6. - إجراء خمس تجارب متباعدة 2 دقيقة بعيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نجاح هذا البروتوكول يعتمد إلى حد كبير على المحصول الكلي من الذباب قابلة للاختبار، فعالية الصدمة الحرارية للحث على إعادة التركيب الإنقسامية، والقدرة على الحصول على استجابة سلوكية قوية في الذباب حفز على فترات 2 دقيقة. وبالنظر إلى أن ما يقدر ب 12.5٪ من الأجنة تحتوي على عناصر MARCM الضرورية ويقدر 16.67٪ من البالغين أن eclose لديها القدرة على GFP التعبير، فمن الأهمية بمكان الحصول على عدد كبير من البيض خلال يضع في الوقت المناسب. مثال على توقيتها الناجح يكمن على مدى فترة 4 ساعات التي ستستخدم في باقي البروتوكول هو مبين في الشكل 1A.
عندما يتم تنفيذ الصدمة الحرارية 85-100 ساعة بعد وضع البيض، العائد من GFP المسمى الحواس الخارجية هو أعلى، مع معظم الذباب وجود واحد من macrochaetae المسمى. العديد من المجالات ذات الاهتمام قد تحتوي على خلايا متماثلة اللواقح في قواعد testablالبريد شعيرات عند إجراء صدمات الحرارة غضون هذه الفترة الزمنية، مع الظهرية المركزي وبعد الجناحية الشعر الخشن أن وجد وصفت في معظم الأحيان (الشكل 2A). نقاط الوقت خارج هذه النتيجة نافذة في بقع من GFP التعبير خارج مناطق الجسم من الفائدة أو أي تعبير GFP (الشكل 2B).
الذباب الاستجابة بشكل طبيعي إلى التحفيز التي تلوح في الأفق من خلال الشروع في استجابة هروب 19. من أجل منع الذباب من الهرب، ونحن مقطوعة الرأس الذباب. ولا تزال الدائرة استجابة الاستمالة سليمة في الحبل العصبي البطني 5. الذباب لا تسترد بشكل جيد إذا مقطوعة الرأس تحت التخدير ثاني أكسيد الكربون، إلا أنها تعود في غضون ساعات قليلة عندما مقطوعة الرأس مع التخدير الباردة على الجليد. بعد قطع الرأس، يجب أن يتم تخزين الذباب في بيئة رطبة المغلقة خلال فترة النقاهة لمنع جفاف. في حين أن بعض الذباب قد يجفف أو يكون غير قادر على الوقوف (الشكل 1B)،تستخدم فقط القادرين على الوقوف (الشكل 1C) للاختبار. قبل الاختبار، يتم التحقق من الذباب عن الاستجابة العامة من خلال مشاهدة للحركة بعد لمسة لnotum. لا تزال العديد من الذباب استجابة لعدة أيام، ولكن ينبغي أن تكتمل اختبار من قبل 24-36 ساعة بعد قطع الرأس. يطير فرط النشاط يمكن أن يكون مشكلة أثناء الاختبار السلوكي لمراقب قد يجدون صعوبة في التمييز بين تعتمد على تحفيز استجابة الاستمالة الحقيقية والحركات العامة للالطاير. في الحيوانات مع الحركة الزائدة لا التي تسببها التحفيز عن طريق اللمس، وحققت نتائج أكثر موثوقية من قبل انتظار الذباب مفرط لتصبح هادئة.
وجدنا أن 47٪ من البرية من نوع الذباب تستجيب مرة واحدة على الأقل عند لمسها على الشعر الخشن خمس مرات، متباعدة في 2 فترات دقيقة لمنع التعود. وقد أظهرت العديد من الجماعات التي التحفيز من شعيرات مختلفة يثير استجابة منقوشة من ساق معين 6،7 6. في تجاربنا، وردت من النوع البري الذباب التحكم للمسة خفيفة من 14٪ (الظهرية المركزي) إلى 86٪ (نوتو الجنبي) المحاكمات (الشكل 3). في شاشة القائم على MARCM مع طفرات غير معروفة، تلك الذباب تحتوي على طفرة لم يشارك في mechanosensation من المتوقع أن تظهر استجابة سلوكية موثوقة مماثلة لتلك التي لوحظت في البرية من نوع الحيوانات السيطرة.
متحولة mechanosensitive معروف، تعطلت NOMPC الاستجابة الاستمالة كما هو متوقع. وردت الذباب السيطرة على الشعر الخشن التحفيز في متماثل المستنسخة بعد الجناحية شعيرات 37٪ من الوقت (الشكل 4). في المقابل، حيوانات مع شعيرات التي كانت متماثلة اللواقح بالنسبة NOMPC ردت 2٪ من الوقت (الشكل 4). في حين البرية من نوع الذباب إعادةبشر تستجيب بشكل مختلف لتحفيز شعيرات مختلفة، وتشير هذه النتائج إلى أن طفرة mechanosensitive، مثل NOMPC، ويقضي على ما يقرب من الاستجابة الاستمالة. في الشاشة مع طفرات غير معروف، ويتوقع العديد من الطفرات تشارك في mechanosensation التي تحول دون استجابة الاستمالة.
الشكل 1. الظروف المناسبة تربية اللازمة لالأمثل السلوكية اختبار. (A) وهناك عدد كاف من الأجنة واحتاج أعقاب 2 - فترة وضع البيض 4 ساعة. عدد الأجنة بعد 4 ساعات يكمن توقيت غير المرجح أن تسفر عن وجود عدد كاف من الكبار الذباب لاختبار السلوك. (B) وخلال فترة النقاهة بعد قطع الرأس، وبعض الذباب لا البقاء على قيد الحياة والتي لا يمكن استخدامها في إجراء مزيد من التجارب. (C) ذبابة مقطوعة الرأس التي تم تخزينها بشكل صحيح في بيئة رطبة خلال فترة الانتعاش قابلة للاختبار في الفحص السلوكي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. MARCM النسخ في الشعر الخشن عند حرارة صدمت بين 85-100 هر بعد وضع البيض. (A) التعبير GFP في الكبار الذباب عندما صدمت حرارة 98-101 ساعة بعد وضع البيض. ما يصل الى 10 شعيرات macrochaete تحتوي متماثل متحولة الحواس الخارجية ومناسبة للاختبار في الاستجابة الفحص السلوكي الاستمالة (B) التعبير GFP في الكبار الذباب عندما صدمت حرارة 161 - 164 ساعة بعد وضع البيض. لاحظ عدم وجود GFP التعبير في الأسس التي قامت عليها شعيرات macrochaete، مما يدل على عدم بقع من الخلايا متماثل في الجهاز الحسي الخارجي قابلة للاختبار.arge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تردد الاستجابة لتحفيز اللمس تعتمد على الشعر الخشن الهوية، وتم تقسيم العدد الكلي للاستجابات ذبابة الفردية لتحفيز الشعر الخشن واحد من قبل عدد من المحفزات لإعطاء استجابة في المئة. وبلغ متوسط النسب المئوية لكل الخشن (N = # الذباب اختبارها، و22 آخر الجناحي، 21 الظهرية الوسطى 14، Scutellar، 7 Notopleural). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. المسوخ NOMPC لا تستجيب لتحفيز اللمس. تحفيز من عشعيرات معاهدة الفضاء الخارجي الجناحية يثير استجابة في البرية من نوع الحيوانات المستنسخة MARCM. ومع ذلك، والتحفيز من الحيوانات المستنسخة MARCM على شعيرات آخر الجناحية التي كانت NOMPC 3 - أدى (الشريط الأخضر) في عدد قليل من الردود (N = 23 من النوع البري، و 12 NOMPC - - / -) /. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يستخدم لفحص السلوكي الكبار للكشف عن الطفرات التي تؤثر mechanosensation في ذبابة الفاكهة. لأن مجموعة من المسوخ يحتوي قاتلة الطفرات ف العنصر من شأنه أن يحول دون فحص كبالغين، هذا البروتوكول يجعل من استخدام تقنية جينية معقدة وصف لأول مرة من قبل لي ولوه (1999) وتفصيلا كما بروتوكول وو ولوه، (2006) للتحايل على الفتك الكبار. MARCM يدفع إعادة التركيب الإنقسامية بين الكروموزومات المتماثلة لتوليد المناطق نسيلي من الخلايا متماثل. وتتميز هذه المناطق مع GFP بسبب فقدان البروتين كاظمة وحوض استحمام-GAL80 الذي يحدث خلال إعادة التركيب الإنقسامية. باستخدام MARCM لتوليد الخلايا التي هي متماثلة اللواقح في مكان وراثي معين، وظيفة الجين يمكن دراستها في الكبار الذباب باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك الفحص السلوكي وصفها في هذه الورقة.
العامل الأساسي الحد من عدد والجينات المحددة التي يمكن به اختبار هو وجود موقع FRT داخل جينوم الطاير. يجب أن يحتوي على مخزون ذبابة موقع FRT على الذراع الكروموسومات من تحور الفائدة. يجب أن يحتوي على MARCM الأسهم ذبابة مستعد موقع FRT متطابقة كما الكروموسوم متحولة للسماح لإعادة التركيب الإنقسامية. في مختبرنا، وضعنا الأسهم الطيران التي تحتوي على خلفيات MARCM مع مواقع FRT40A وFRT42D. وهذه الأسهم تسمح لنا أن يحجب أي شخص بالغ قاتلة ف عنصر مجتمعة بالفعل مع موقع FRT المقابلة على 2L و 2R كروموسوم الأسلحة، على التوالي. لتحقيق أقصى قدر من إمكانات MARCM في شاشات لالطفرات التي تؤثر mechanotransduction أو منعكس الاستمالة، وأسهم ذبابة إضافية مع الخلفيات MARCM قادرة على اختبار الجينات على ذراعيه من الكروموسوم الثالث وسيتم إنشاء الكروموزوم (اكس). مرة واحدة وضعت، وهذه الأسهم تسمح لمعظم البالغين الطفرات المميتة ف عنصر جنبا إلى جنب مع موقع FRT لفحصها للمشاركة في mechanosensation.
توقيت ش الحرارةوقد تم تطوير بروتوكول اوك لتحقيق أقصى قدر من عدد من المناطق خلية متماثل في الحواس الخارجية، مع ترك الكثير من بقية متخالف ذبابة في موضع الاهتمام. يمكن أن تكون علامة العديد من مجالات الاهتمام من قبل التعبير GFP بعد الصدمة الحرارية المزدوجة، مما يتيح للشعيرات متعددة لفحصها (الشكل 2). وينص البروتوكول MARCM فرصة ممتازة لخلق الطفرات المميتة متماثل في مناطق محددة من الفائدة، ولكن يعتمد بروتوكول MARCM لدينا على تحريض الصدمة الحرارية النشاط recombinase، مما يجعل من عملية عشوائية على النحو الذي شعيرات سوف يكون في نهاية المطاف قابلة للاختبار. لأن كل الشعر الخشن يثير الاستمالة محددة الساق منعكس 6،7، كان من المهم بالنسبة لنا أن نؤكد أن الردود في البرية من نوع الحيوانات المستنسخة MARCM هي مماثلة لتلك التي سبق وصفها. تحقيق أقصى قدر من الكفاءة من شاشة القائمة على MARCM يتطلب القدرة على اختبار أي من شعيرات macrochaete للاستجابة متحولة ومقارنة هذه داتومقابل سعر استجابة من الشعر الخشن المقابلة في الأسهم MARCM جاهزة. لقد أكدت نتائج Corfas وDudai 7 في شعيرات معربا عن GFP في الذباب MARCM.
القدرة على التمييز بسهولة بين ذبابة الاستجابات السلوكية العادية وغير العادية أمر حاسم لتحديد الطفرات تتداخل مع mechanotransduction. تحور في جين تشارك في mechanotransduction جانبا أو آخر من رد الفعل الاستمالة يجب أن تمنع استجابة الساق. ومن المتوقع معدل استجابة أقل من ذلك بكثير في الشعر الخشن المقابلة في الأسهم MARCM جاهزة. معدلات الاستجابة السلوكية في الفسيفساء NOMPC والبرية من نوع الذباب بمثابة دليل على مبدأ أن الشاشة السلوكية على أساس MARCM ويمكن استخدامها للتمييز بين المسوخ ميكانيكية حسية والذباب العادي. لقد أظهرنا أنه في NOMPC استنساخ الفسيفساء متحولة، وإلغاء منعكس الاستمالة ردا على الشعر الخشن التحفيز تقريبا. اثنين فقط من الذباب من أربعة عشر اختبار عرضهااستجابة الساق. كل من هذه الذباب وردت مرة واحدة فقط على مدار الاختبار، مما يدل على أن فحص السلوكي القائم على MARCM فعال في تحديد وجود خلل mechanosensation. الذباب مراقب أن نميز بين متحولة mechanosensitive والذباب دون طفرة أو مع الطفرة التي لا تشارك في الاستجابة الاستمالة. بسبب وجود درجة عالية من التباين في البرية من نوع الاستجابات، وشاشة تحديد الأليلات قوية، ولكن من المرجح أن يغيب التغييرات أكثر دهاء في السلوك بسبب الأليلات الأضعف. يتضمن مجموعة من المسوخ ليتم عرضه الأليلات المميتة متماثل فقط، لذلك فمن المرجح أن هذه الأليلات قوية أو فارغة ويرجح أن إلغاء وظيفة البروتين. ومع ذلك، فإن الشاشة تفوت الأليلات التي قد تكون قاتلة في التنمية، ولكن ينتج خلل ميكانيكية حسية أكثر دهاء عندما قام متماثل بطريقة أكثر محدودية من قبل MARCM.
اخترنا نظام التهديف كل شيء أو لا شيء عن البساطة. هذه الطريقة تعطي سخيةيسجل بالمقارنة مع النظام المستخدم من قبل Corfas وDudai 7 أن يعين على درجة من 0-4 تبعا لمدى حركة الساق. في نظام كل شيء أو لا شيء، وتعطى أي رد الائتمان الكامل مع افتراض أن أي رد على التحفيز يشير إلى أن الجهاز الحسي هو الكشف التحفيز وإشارات إلى الجهاز الحركي.
هذه الشاشة يمكن أن تحدد الطفرات التي تؤثر على أي خطوة في الدائرة السلوكية. مزيد من التجارب، مثل الكهربية (كما هو الحال في كيرنان وآخرون 5) أو التصوير الكالسيوم، سيتعين تستخدم لتحديد ما إذا كانت الطفرة تتأثر مباشرة mechanotransduction أو بعض جوانب أخرى من التطوير أو وظيفة الحسية والحركية المنعكس القوس.
الدروسوفيلاميلانوجاستر توفير نظام نموذجا ممتازا لدراسة mechanosensation. الحواس الخارجية تشترك في العديد من أوجه التشابه الهيكلية والوظيفية مع خلايا الشعر في الأذن الداخلية الثدييات20. استجلاء هذه الجزيئات تشارك في هذه العملية في ذبابة الفاكهة لديه القدرة على كشف homologs الثدييات وorthologs. شاشات يهدف إلى اكتشاف الطفرات التي تعطل mechanosensation سيمهد الطريق لخلية اللاحقة البيولوجية، الكهربية، والدراسات البيوكيميائية لزيادة تحديد وتوصيف هذه الجزيئات، وتعميق فهمنا لهذه العملية في كل من الذباب والثدييات. شاشة القائم على MARCM عن الطفرات التي تؤثر mechanosensation سوف تستخدم تقنية الوراثية راسخة يقترن استجابة الفحص السلوكي الاستمالة لكشف جينات جديدة تشارك في mechanotransduction والطيران الاستمالة المنعكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
الكتاب أود أشكر مركز بلومينغتون الأسهم، لى تشون لوه، تشارلز زوكر، والزنبق ويوه نانج يناير لتبادل سخي من الأسهم الطيران والتالية للتمويل: SOMAS-URM (دينار وSW)، وبكالوريوس فورد كلية زمالة الصيف (لSW)، BD مؤسسة زمالة البحوث الصيفية (لCL وDL)، ورينيه وانطوني M. مارلون، MD '63 زمالة البحوث الصيفية (لDL) جيمس C. '75 وجين Colihan زمالة أبحاث الصيف (TO) من خلال خريجي / الرئيسي صندوق أبحاث الصيفي للكلية الصليب المقدس وزمالة أبحاث الصيف مؤسسة Stransky (لTO). شكر خاص لقسم الأحياء ومكتب العميد في كلية الصليب المقدس لدعم كل عمل في المختبر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brewers Yeast (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Fly Food |
| Corn (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Fly Food |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Fly Food |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Fly Food |
| Molasses (1 Gallon) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Fly Food |
| Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Fly Food |
| Phosphoric acid | Fisher | A260-500 | Fly Food |
| Drosophila Vials, Narrow (PS) | Genesee | 32-109 | Fly Cultures |
| 6oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Plastic Fly Bottles | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayon Balls, Large | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 | Fly Food Preparation |
| Droso-Filler, Bottles | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparation |
| 8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount 1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | Fly Food Preparation |
| Water jacketed Kettle | Fly Food Preparation | ||
| Diurnal Growth Chamber | Forma Scientific | Temperature and light/dark cycle controlled | |
| Water bath | VWR | For heat shock | |
| MicroScissors | Fine Science Tools | 15000-08 | For removing heads |
| Fluroscence Dissecting Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter |
| Fluroscence Light Source | Zeiss | X-Cite 120 | Fiber optic light pipe makes this easy to configure |
| Camera for Scope | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Image acquistion software | Zeiss | ||
| Ice bucket | for cold anthesia | ||
| Homemade cold anthesia tray | for cold anthesia decapitation | ||
| Plastic boxes | for recovery of decaptitated flies in humid environment |
References
- Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
- Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
- Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
- Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
- Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
- Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012 (2010).
- Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
- Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).
