Abstract
בגלל ההומולוגיה המבנית ותפקודית של תאי שיער באוזן הפנימית היונקים, תאי העצב שמעצבבים את איברי חוש חיצוניים תסיסנית לספק מערכת מודל מצוינת ללימוד mechanosensation. פרוטוקול זה מתאר מגע התנהגות פשוטה בזבובי פירות שיכולים לשמש לזיהוי מוטציות שמפריעות mechanosensation. גירוי חוש המישוש של macrochaete זיפים על בית החזה של זבובים מעורר רפלקס טיפוח משתי הרגל הראשונה או שלישית. מוטציות שמפריעות mechanotransduction (כגון NOMPC), או בהיבטים אחרים של קשת רפלקס, יכולות לעכב את תגובת הטיפוח. מסך מסורתי של התנהגויות בוגרות הייתי מחמיץ מוטציות שיש תפקידים חיוניים בפיתוח. במקום זאת, פרוטוקול זה משלב מסך המגע עם ניתוח פסיפס עם סמן תא repressible (MARCM) כדי לאפשר רק לאזורים מוגבלים של תאים שעברו מוטציה הומוזיגוטים להיות שנוצר ומסומן על ידי expression של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). על ידי בדיקת השיבוטים MARCM לתגובות התנהגותיות חריגות, אפשר להקרין אוסף של מוטציות p-אלמנט קטלניים כדי לחפש גנים חדשים המעורבים בmechanosensation שהיה החמיצו בשיטות מסורתיות יותר.
Protocol
1. צלבים כדי ליצור זבובים MARCM
- לשמור על זבובים בתקשורת קמח תירס מולסה (אגר L / 6.5 G; 23.5 גר '/ שמרי L, 60 גר' / קמח תירס L, 60 מיליליטר מולסה / L, 4 מיליליטר / תערובת חומצת L; 0.13% Tegosept) או תקשורת תסיסנית סטנדרטית ב 22 מעלות צלזיוס בשעת 12 מחזור אור / חושך.
הערה: נמוך מהטמפרטורה סטנדרטית משמש כדי לשמור MARCM-מניות בריאים. זה מרחיב את הזמן התפתחותי בין הביצה והבגרות ל -14 ימים. - השתמש נקבות בתולה (כ 1 - 8 ימים ההם) ממניות MARCM מוכנה המכיל אלמנטים גנטיים הנחוצים (GFP תחת שליטתו של רצף הפעלה-במעלה הזרם (כטב"מ-GFP), חלבון Gal80 מדכאים, גורם שעתוק Gal4, חום-הלם recombinase מונע, ואתר רקומבינציה FRT).
הערה: מוכנות מניות MARCM מכילות גנוטיפים הבאים: elavGal4, כטב"מ-CD8-GFP, HS-flipase; FRT40A, tubGal80 / ארגון נוער קתולי; tubGal4 / TM3Sb.
הערה: אתר FRT הספציפי יהיה תלוי במיקום של המוטציהבגנום. לדוגמא, FRT40A משמש לבדיקת מוטציות בזרוע השמאלית של כרומוזום 2, כגון NOMPC (ראה 10 לפרטים נוספים על פרוטוקולי MARCM). - נקבות צלב MARCM מוכן בתולה לגברים המכילים מוטציה של עניין והאתר שלה המתאים FRT (לדוגמא, להתראות, ביל; NOMPC3, FRT40A / ארגון נוער קתולי; + / +). כדי לשלוט על האינדוקציה MARCM יעילה, להגדיר צלב שני באמצעות זבובי זכרים מכילים את אותו אתר FRT, אך ללא מוטציה. השתמש יחס משוער של 5 נקבות: זכר 1 בצלבים.
2. מתוזמן הטלת ביצים
- לאחר מאפשר זבובים להזדווג ללילה אחד לפחות, לעבור מבוגרים לתוך צלוחיות חדשות עם תקשורת טרי. לאפשר זבובים להטיל ביצים בסביבה חשוכה למשך כ 4 שעות לפני העברה שוב הצלבים לתוך צלוחיות חדשות. שים לב לזמני ההתחלה וסיום של תקופת הטלת ביצים.
הערה: מרווחים קצרים יותר מקובלים כאשר נראה שיש מספר גבוה של ביצים על התקשורת לפני סוף interva 4 HR-l.- שמור צלוחיות עם מספר מספיק של ביצים (כ יותר מ -20) וחנות בשעה 12 מחזור אור / חושך ב 22 מעלות צלזיוס להיות חום בהלם מאוחר יותר.
הערה: בקבוקים עם מספר נמוך של ביצים על התקשורת (פחות מכ -20) צפויים להניב כמות מספקת של מבוגר הזבובים לבדיקת התנהגות והאינטרס של יעילות מומלץ הם לא יישמרו לבדיקה נוספת.
הערה: הזבובים שלנו גדלים עם האורות ב08:00-20:00. מצאנו זמן ערב נקודות יובילו לצפיפות גבוהה יותר ביצה, ולכן בדרך כלל לבצע צלבי מתוזמן בין 4 - 8 בערב ושעה 8 בערב-חצות. הזבובים מטילים את ביציהם על RT בארון חשוך ולאחר מכן הם חזרו לחממה למחרת כדי לא להפריע למחזור אור-חושך הקבוע בחממה.
- שמור צלוחיות עם מספר מספיק של ביצים (כ יותר מ -20) וחנות בשעה 12 מחזור אור / חושך ב 22 מעלות צלזיוס להיות חום בהלם מאוחר יותר.
.3 בצע חום הלם כדי לגרום mitotic רקומבינציה
- כ 85-100 לאחר הטלת ביצי HR, נ 'המקוםials לתוך אמבט מים בחום של 37 מעלות במשך שעה 1. ודא כי מפלס המים מגיע מעל לגובה של התקשורת בבקבוקונים, אבל לא לצלול באופן מלא את הבקבוקונים כדי למנוע את זחלי מטביעה.
- הסר צלוחיות מאמבט מים ולאפשר תקופת החלמה שעה 1 ב RT.
- בקבוקוני מקום בחזרה ל37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעה 1.
- הסר צלוחיות מאמבט מים וחנות בחממה על מחזור אור / חושך של 12 שעות ב 22 מעלות צלזיוס עד eclosion.
4. הכנה לבחינות להתנהגות
- בעקבות eclosion, להרדים זבובים על קרח. בחר זבובים עם גנוטיפים המכילים את כל המרכיבים הגנטיים לMARCM ומצביעים על השיבוטים מסומנים ביטוי של GFP צפוי להיות נצפו מבוססים על סמני הפנוטיפ הנצפים משמשים במניות ההורה. לערוף זבובים עם המספריים iridectomy.
הערה: לדוגמא, בחרנו לזבובים ללא סמנים הגנטיים ארגון נוער קתולי (כנפיים מתולתלות) וSb (זיפי זיפים) לזיהה אתזבובי פ.י. שיכילו את כל המרכיבים הגנטיים הדרושים כדי ליצור אזורי פסיפס מסומנים עם GFP.
הערה: עריפת הראש הוא הכרחית כדי למנוע מהמבוגרים עפו משם כאשר מגורה. - הניחו זבובים חסרי ראש בסביבה סגורה, לחה ולאפשר כ 10 - 20 שעות של התאוששות. שימוש רק זבובים שזכות עצמם כאשר מוטרדים לבדיקה נוספת. מבחן זבובים בתוך 30 שעות של עריפת ראש.
5. בדיקות התנהגותיות
- על ידי התבוננות זבובים ערופים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח, לזהות שיבוטים הומוזיגוטים מסומנים עם GFP באיברי החישה החיצוניים זיפים. רשום את שם הזיפים וצד שמאל או ימין. לחסל את כל הטיה פוטנציאלית, חבר המעבדה מבצע את גירוי הזיפים צריך להיות עיוור לגנוטיפ של הזיפים, wild-type או מוטציה.
- לעורר רפלקס טיפוח על ידי הסטת GFP המסומנת זיפים כלפי גוף הזבוב עם שיער נוקשה או מלקחיים עדינים ולבחון את הרגל מחדשsponse. נותן ציון של אחד לזבובים שלהרים את רגלם בתגובה לגירוי וזיפי ציון אפס לזבובים שלא להזיז את הרגליים שלהם.
הערה: מחקרים קודם 6,7 אפיינו את תגובת הרגל שהושרה על ידי גירוי זיפים מסוימים. זה כולל את הרגל שמגיבה לכל זיפים ואת חלקם של זבובים שמגיבים לגירוי של זיפים מסוימים. אנחנו רק כבש עבור תנועות של הרגל שצפויה להגיב מבוססים על הסיווג של Vandervorst 6. - לנהל חמישה ניסויים במרווחים 2 דקות זה מזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההצלחה של פרוטוקול זה תלוי במידה רבה על התשואה הכוללת של זבובים הניתנים לבדיקה, את האפקטיביות של הלם החום כדי לגרום לרקומבינציה mitotic, ואת היכולת להשיג תגובה התנהגותית חזקה בזבובי מגורה ב -2 דקות במרווחים. בהתחשב בכך 12.5% משוערים של עוברים מכילים את האלמנטים ההכרחיים וMARCM 16.67% משוערים של מבוגרים שיש לי eclose הפוטנציאל לביטוי של GFP, זה הוא קריטי להשגת מספר גבוה של ביצים במהלך מתוזמן מניח. דוגמא לעיתוי מוצלח שכבה על מרווח 4 שעות שהיה בשימוש בשאר הפרוטוקול מוצג באיור 1 א.
כאשר הלם החום מבוצע 85-100 שעות לאחר הטלת ביצים, התשואה של ה- GFP שכותרתו אברים חישה חיצוני היא גבוהה ביותר, עם רוב הזבובים שיש אחד macrochaetae שכותרת. אזורים רבים של עניין עשויים להכיל תאים הומוזיגוטים בבסיסים של testablדואר זיפים כאשר זעזועי חום מבוצעים בתוך פרק זמן זה, עם זיפי הגב המרכזיים ופוסט-עלאר מצא שכותרתו בתדירות הגבוהה ביותר (איור 2 א) להיות. נקודות זמן מחוץ לתוצאת חלון זה בתיקוני ביטוי GFP מחוץ לאזורי הגוף של עניין או לא ביטוי של GFP (איור 2).
זבובים באופן טבעי להגיב לגירוי השחלה על ידי ייזום תגובת בריחת 19. כדי למנוע זבובים לברוח, אנחנו ערופים זבובים. מעגל תגובת הטיפוח נותר בשלמותה בחוט עצב הגחון 5. זבובים לא לשחזר גם אם ערופים בהרדמה פחמן דו חמצני, אך להתאושש בכמה שעות, כאשר ערוף עם הרדמה קרה על קרח. לאחר עריפת הראש, צריכים להיות מאוחסנים זבובים בסביבה סגורה, לחה במהלך תקופת ההתאוששות כדי למנוע התייבשות. בעוד כמה זבובים עשויים ליבש או להיות מסוגל לעמוד (איור 1),רק מי מסוגל לעמוד (איור 1 ג) משמשים לבדיקה. לפני הבדיקה, זבובים נבדקים להיענות כללית על ידי צפייה לתנועה לאחר מגע לnotum. זבובים רבים נותרו מגיבים לכמה ימים, אבל בדיקה צריכה להתבצע על ידי 24-36 שעות לאחר עריפת הראש. טוס היפראקטיביות יכולה להיות בעיה במהלך בדיקה התנהגותית כי משקיף עלול להתקשות להבחין בין תגובה אמיתית גירוי תלוי טיפוח ותנועות כלליות של הזבוב. בבעלי חיים עם תנועה עודפת לא הושרה על ידי גירוי חוש המישוש, תוצאות אמינות יותר מושגות על ידי מחכה לזבובים היפראקטיבי להפוך שקט.
מצאנו כי 47% מזבובים פרא-סוג להגיב לפחות פעם אחת כשנגעו בזיפים חמש פעמים, במרווחים של 2 דקות במרווחים כדי למנוע התרגלות. מספר קבוצות הראו שגירוי של זיפים שונים מעורר תגובה בדוגמת מרגל ספציפית 6,7 6. בניסויים שלנו, זבובי שליטה פראי סוג הגיבו למגע קל מ -14% (גב מרכזי) ל -86% (Noto-פלאורלי) של ניסויים (איור 3). במסך מבוסס MARCM עם מוטציות ידועות, ניתן לצפות אותם זבובים המכילים מוטציה אינה מעורבת בmechanosensation להפגין תגובה התנהגותית אמינה דומה לזה שנצפה בבעלי חיים שליטה wild-type.
המוטציה mechanosensitive הידועה, NOMPC שיבש את תגובת הטיפוח כצפוי. זבובי בקרה הגיבו לגירויי זיפים בהודעה עלאר-הומוזיגוטים משובט זיפי 37% מהזמן (איור 4). לעומת זאת, בעלי חיים עם זיפים שהיו הומוזיגוטים לNOMPC הגיבו 2% מהזמן (איור 4). בעוד זבובי wild-type מחדשspond שונה לגירוי של זיפים שונים, תוצאות אלו מצביעות על כך שמוטצית mechanosensitive, כגון NOMPC, כמעט מבטלת את תגובת הטיפוח. במסך עם מוטציות ידועות, כמה מוטציות מעורבות בmechanosensation המעכבות את תגובת הטיפוח צפויות.
איור 1. תנאי גידול נאותים נדרש להתנהגות אופטימלית בדיקה. (א) מספר מספיק של עוברים יש הצורך הבא 2 - תקופת הטלת ביצי 4 שעות. מספר העוברים לאחר שכב מתוזמן 4 שעות צפוי להניב מספר מספיק של מבוגרים טס לבדיקות התנהגותיות. (ב) בתקופת ההתאוששות לאחר עריפת הראש, כמה זבובים לא ישרדו ולא ניתן להשתמש בבדיקות נוספות. (ג) זבוב ערוף שמאוחסן כראוי בסביבה לחה בתקופת ההחלמה הוא ניתנת לבדיקה בassay התנהגות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. השיבוטים MARCM בזיפים כאשר החום המום בין 85-100 שעות לאחר הטלת ביצים. (א) ביטוי של GFP במבוגרי זבובים כאשר חום בהלם 98-101 שעות לאחר הטלת ביצים. רבים כמו 10 זיפים macrochaete מכילים איברי תחושה הומוזיגוטים מוטציה חיצוניות ומתאימים לבדיקה בassay התנהגות תגובת טיפוח ביטוי של GFP (ב ') במבוגרי זבובים כאשר חום בהלם 161 -. 164 שעות לאחר הטלת ביצים. שים לב לחוסר הביטוי של GFP בבסיסים של זיפי macrochaete, המציין אין תיקונים של תאים הומוזיגוטים באיבר חישה חיצוני הניתן לבדיקה."Target =" _ arge.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. התדר של תגובה לגירוי מגע תלוי בזיפי זהות. המספר הכולל של תגובות של זבוב בודד לגירוי של זיפים יחידים היה מחולק במספר הגירויים לתת מענה אחוזים. האחוזים בממוצע לכל זיפים (N = # של זבובים שנבדק, 22 ההודעה עלאר, 21 הגבי 14 מרכזי, Scutellar, 7 Notopleural). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מוטאנטים NOMPC לא מגיבים למגע גירוי. גירוי של pזיפי OST-עלאר מעוררים תגובה בשיבוטי MARCM wild-type. עם זאת, גירוי של שיבוטים MARCM על זיפי ההודעה עלאר שהיו NOMPC 3 - / - (פס ירוק) הביא כמה תגובות (N = 23 wild-type, ו -12 NOMPC - / -). לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מנצל assay התנהגות בוגר למסך למוטציות המשפיעות mechanosensation בדרוזופילה. בגלל האוסף של מוטציות מכיל מוטציות p-אלמנט קטלניים שימנע הקרנה כמבוגרים, פרוטוקול זה עושה שימוש בטכניקה גנטית מורכבת שתוארה לראשונה על ידי לי ולואו , (1999) וכמפורט בפרוטוקול על ידי וו ולואו, (2006) לעקוף קטלני מבוגר. MARCM גורם רקומבינציה mitotic בין כרומוזומים הומולוגיים ליצור אזורים משובטים של תאים הומוזיגוטים. אזורים אלה מסומנים עם GFP בגלל האובדן של החלבון המדכא, אמבטיה-GAL80 המתרחש במהלך רקומבינציה mitotic. באמצעות MARCM לייצר תאים שהם הומוזיגוטים במוקד גנטי מסוים, תפקוד גן ניתן ללמוד במבוגרי זבובים באמצעות מגוון של שיטות, כולל assay ההתנהגות מתואר במאמר זה.
הגורם העיקרי המגביל הן את המספר ואת הגנים הספציפיים שיכולים בדואר נבדק הוא הנוכחות של אתר FRT בתוך הגנום של הזבוב. מניות Fly חייבים לכלול אתר FRT על זרוע כרומוזומליות של המוטציה של עניין. מניות זבוב מוכן MARCM חייבת לכלול אתר FRT זהה כרומוזום המוטציה כדי לאפשר לרקומבינציה mitotic. במעבדה שלנו, פיתחנו מניות זבוב המכילות רקע MARCM עם אתרי FRT40A וFRT42D. מניות אלה יאפשרו לנו מסך כל p-אלמנט קטלני מבוגרים בשילוב עם אתר כבר FRT מתאים בזרועות כרומוזום 2L ו2R, בהתאמה. כדי למקסם את הפוטנציאל של MARCM במסכים למוטציות המשפיעות mechanotransduction או רפלקס הטיפוח, מניות לטוס נוספות עם רקע MARCM מסוגל בדיקות הגנים בשני זרועותיו של כרומוזום השלישי וכרומוזום X ייווצר. ברגע שפתח, מניות אלה יאפשרו למוטציות p-אלמנט הקטלני ביותר למבוגרים בשילוב עם אתר FRT להיבדק למעורבות בmechanosensation.
העיתוי של sh החוםפרוטוקול Ock פותח על מנת למקסם את מספר אזורי תא הומוזיגוטים באיברי החישה החיצוניים, תוך השארה הרבה של שאר הטרוזיגוטיים זבוב על המוקד של עניין. אזורים רבים של עניין יכולים להיות מסומנים על ידי הביטוי של GFP הבא הלם כפול חום, המאפשרים לזיפים מרובים להיבדק (איור 2). פרוטוקול MARCM מספק הזדמנות מצוינת ליצירת מוטציות הומוזיגוטים קטלניות באזורים הספציפיים של עניין, אבל פרוטוקול MARCM מסתמך על האינדוקציה הלם חום של פעילות recombinase, מה שהופך את תהליך אקראי כמו שזיפי סופו של דבר להיות ניתנות לבדיקה. מכיוון שכל זיפים מעורר טיפוח רגל ספציפי רפלקס 6,7, זה היה חשוב לנו כדי לוודא שהתגובות בשיבוטי MARCM פראי סוג דומות לאלה שתוארו קודם לכן. למקסם את היעילות של מסך מבוסס MARCM דורש את היכולת לבחון כל זיפי macrochaete לתגובת מוטציה ולהשוות DAT אלהנגד קצב התגובה מזיפים מקביל במניות MARCM-מוכן. יש לנו אישרו את התוצאות של Corfas ו -7 דודאי בזיפים להביע GFP בזבובי MARCM.
היכולת להבחין בקלות בין תגובות התנהגותיות זבוב הרגילות ונורמליות היא קריטית כדי לקבוע אילו מוטציות להפריע mechanotransduction. מוטציה בגן המעורב בmechanotransduction או היבט אחר של רפלקס הטיפוח צריך לעכב את תגובת הרגל; שיעור תגובה נמוך באופן משמעותי בזיפים המקביל במניות MARCM מוכנה צפוי. שיעורי התגובה התנהגותית בזבובי NOMPC ופראי סוג פסיפס לשמש כהוכחה לעיקרון שמסך ההתנהגות מבוססת MARCM יכול לשמש כדי להבדיל בין מוטציות mechanosensory וזבובים רגילים. הראינו כי בשיבוטי פסיפס המוטציה NOMPC, רפלקס הטיפוח בתגובה לזיפי גירוי כמעט בוטל. רק שני זבובים של ארבעה עשר שנבדקו הציגותגובת רגל. כל אחד מזבובים אלה הגיב רק פעם אחת במהלך בדיקות, המצביע על כך assay התנהגות מבוסס MARCM הוא יעיל בזיהוי פגם mechanosensation. משקיף יכול להבחין בין המוטציה mechanosensitive עף ועף ללא מוטציה או עם מוטציה שאינו מעורבת בתגובת הטיפוח. בגלל הרמה הגבוהה של שונות בתגובות wild-type, המסך יזהה אללים חזקים, אך סביר להניח להחמיץ שינויים עדינים יותר בהתנהגות בשל אללים חלשים. האוסף של מוטציות שיוקרנו כולל אללים קטלניים רק הומוזיגוטים, כך שסביר להניח כי אלה הם אללים חזקים או בטל ועשויים לבטל את תפקוד חלבון. עם זאת, המסך יחמיץ אללים שעשויות להיות קטלני בפיתוח, אבל לייצר פגם mechanosensory עדין יותר כאשר עשה הומוזיגוטים באופן מוגבל יותר על ידי MARCM.
בחרנו שיטת ניקוד הכל או אף לפשטות. שיטה זו מניבה נדיבהציון בהשוואה למערכת בשימוש על ידי Corfas ו -7 דודאי שמקצה ציון של 4 - 0. בהתאם להיקף תנועת הרגל. במערכת הכל-או-לא, כל תגובה היא נתון אשראי מלא בהנחה שכל תגובה לגירוי עולה כי המערכת החושית מזהה את הגירוי ואיתות למערכת המוטורית.
מסך זה עשוי לזהות מוטציות המשפיעות על כל צעד במעגל ההתנהגות. בדיקות נוספות, כגון אלקטרופיזיולוגיה (כמו באל Kernan et 5) או ההדמיה סידן, היו צריכים להיות בשימוש כדי לקבוע אם המוטציה מושפעת mechanotransduction או היבט אחר של הפיתוח או פונקציה של קשת רפלקס החושית-המוטורית ישירות.
דרוזופילה melanogaster לספק מערכת מודל מצוינת ללימוד mechanosensation. איברי החישה החיצוניים לשתף רב דמיון מבני ותפקודי בתאי השיער באוזן הפנימית היונקים20. הבהרת המולקולות מעורבות בתהליך זה בדרוזופילה יש הפוטנציאל לחשוף homologs וorthologs יונקים. מסכי במטרה לגלות מוטציות המשבשים mechanosensation יסלול את הדרך לתא הבא ביולוגי, אלקטרו, ומחקרים ביוכימיים לזהות ולאפיין מולקולות נוספים אלה, העמקת ההבנה של תהליך זה בשני זבובים ויונקים שלנו. מסך מבוסס MARCM למוטציות המשפיעות mechanosensation יהיה להשתמש בטכניקה גנטית מבוססת היטב יחד עם assay התנהגות תגובת טיפוח לחשוף גנים חדשים המעורבים בmechanotransduction ורפלקס לטוס טיפוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למרכז Bloomington המניות, Liqun לואו, צ'רלס צוקר, ולילי וYuh Nung יאן לשיתוף הנדיב של מניות לטוס ובא למימון: somas-URM (לJD וSW), בוגר תואר ראשון פורד פקולטה קיץ המלגה (לSW), BD תאגיד קיץ מחקר המלגה (לCL וDL), רנה ואנתוני מ 'מרלון, MD 63' קיץ מחקר מלגה (לDL) ג'יימס ג 75 וג'יין Colihan קיץ מחקר מלגה (TO) דרך הבוגרים / הורה קיץ קרן מחקר של המכללה לצלב הקדוש וסטראנסקי קרן מלגת מחקר הקיץ (ל). תודה מיוחדת למחלקה לביולוגיה ומשרד הדיקן במכללה לצלב הקדוש לתמיכה של כל העבודה במעבדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brewers Yeast (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Fly Food |
| Corn (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Fly Food |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Fly Food |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Fly Food |
| Molasses (1 Gallon) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Fly Food |
| Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Fly Food |
| Phosphoric acid | Fisher | A260-500 | Fly Food |
| Drosophila Vials, Narrow (PS) | Genesee | 32-109 | Fly Cultures |
| 6oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Plastic Fly Bottles | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayon Balls, Large | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 | Fly Food Preparation |
| Droso-Filler, Bottles | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparation |
| 8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount 1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | Fly Food Preparation |
| Water jacketed Kettle | Fly Food Preparation | ||
| Diurnal Growth Chamber | Forma Scientific | Temperature and light/dark cycle controlled | |
| Water bath | VWR | For heat shock | |
| MicroScissors | Fine Science Tools | 15000-08 | For removing heads |
| Fluroscence Dissecting Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter |
| Fluroscence Light Source | Zeiss | X-Cite 120 | Fiber optic light pipe makes this easy to configure |
| Camera for Scope | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Image acquistion software | Zeiss | ||
| Ice bucket | for cold anthesia | ||
| Homemade cold anthesia tray | for cold anthesia decapitation | ||
| Plastic boxes | for recovery of decaptitated flies in humid environment |
References
- Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
- Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
- Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
- Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
- Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
- Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012 (2010).
- Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
- Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).
