Abstract
そのため哺乳類の内耳の有毛細胞への構造的および機能的相同性のため、 ショウジョウバエの外部感覚器官を神経支配するニューロンはmechanosensationの研究のための優れたモデルシステムを提供します。このプロトコルは、mechanosensationを妨害する変異を同定するために使用することができショウジョウバエでシンプルなタッチの動作について説明します。 macrochaeteの触覚刺激は、ハエの胸郭に毛のいずれかの第1または第3の脚からグルーミング反射を誘発します。 （例えばNOMPCなど）メカノと、または反射弓の他の側面に干渉する突然変異は、グルーミング応答を阻害することができます。大人の行動の伝統的な画面は開発中の重要な役割を持っている変異体を逃したであろう。代わりに、このプロトコルは、exprで生成され、マークされたホモ接合変異体の細胞の限られた領域を可能にするために、抑制性細胞マーカー（MARCM）でモザイク解析でタッチスクリーンを組み合わせました緑色蛍光タンパク質（GFP）のession。異常行動応答についてMARCMクローンを試験することにより、より伝統的な方法では見逃されたであろうmechanosensationに関与する新しい遺伝子を検索するために致死P因子突然変異のコレクションをスクリーニングすることが可能です。
Protocol
1.十字MARCMのハエを生成するには
- 22℃で、または標準のショウジョウバエメディアコーンミール糖蜜培地（0.13％Tegosept; 23.5グラム/ Lの酵母; 60グラム/ Lのコーンミール、60ミリリットル/ Lの糖蜜; 4ミリリットル/ Lの酸ミックス6.5グラム/ Lの寒天）上のハエを維持12時間の明/暗サイクルです。
注：標準温度よりも低い、健康MARCM-株を維持するために使用されます。これは14日に卵と成人期の間の発達の時間を延長します。 - 上流活性化配列（UAS-GFP）、GAL80リプレッサータンパク質、GAL4転写因子の制御下（GFPを必要な遺伝的要素を含むMARCM対応在庫から - （8日齢約1）処女雌を使用してくださいリコンビナーゼ、およびFRT組換え部位を駆動する熱ショック）。
注：私たちのMARCMすぐ銘柄は以下の遺伝子型含まれていますelavGal4、UAS-CD8-GFP、HS-flipaseを。 FRT40A、tubGal80 / CYO。 tubGal4 / TM3Sb。
注：特定のFRT部位は、突然変異の位置に依存しますゲノムインチ例えば、FRT40Aは、NOMPC（MARCMプロトコルの詳細については10を参照のこと）などの第2染色体の左腕、上の変異をテストするために使用されます。 - 目的の変異とそれに対応するFRT部位含ま男性にクロスMARCM対応の処女雌（; NOMPC3、FRT40A / CYO;例えば、W-を+ / +）。効果的なMARCM誘導に制御するために、同じFRT部位を含む男性のハエを使用して第2のクロスを設定したが、突然変異のありません。十字架で1男性：女性5のおおよその比率を使用してください。
2.時限産卵
- ハエは、少なくとも一晩交配させた後、新鮮な培地で新しいバイアルに大人を移動します。ハエが再び新しいバイアルに十字架を転送する前に、約4時間、暗い環境で卵を産むようにします。産卵期間の開始時間と終了時間に注意してください。
注意：4時間のintervaの終了前に、メディア上の卵の数が多いがあるように表示されたときに短い間隔が許容されますリットル。- 熱が後で衝撃を与えたことを摂氏22度で12時間の明/暗サイクルで十分な卵の数（約20以上）とストアでバイアルを保管してください。
注：メディア上の卵の数が少ないバイアル（約20未満）は行動試験のために飛ぶと効率の利益のためにそれは彼らがさらなる試験のために保持されないことをお勧めします大人の十分な数が得られることはほとんどありません。
注意：私たちのハエは、午前8時から午後8時までにライトで発生します。午後8時と午後8時 - 午前零時 - したがって、我々は、通常4〜時限交配を行い、夕方の時間点が高い卵密度につながる発見しました。ハエが暗いキャビネット内に室温で産卵した後、インキュベーター中で、通常の明暗サイクルを乱さないように、次の日にインキュベーターに戻します。
- 熱が後で衝撃を与えたことを摂氏22度で12時間の明/暗サイクルで十分な卵の数（約20以上）とストアでバイアルを保管してください。
3.有糸分裂組換えを誘導するために熱ショックを実行します
- 約85 - 産卵後100時間、場所のV1時間37℃で水浴にIALS。水位がバイアル内のメディアの高さの上に達したが、完全に溺れてから幼虫を防ぐためにバイアルを水没しないことを確認してください。
- 水浴からバイアルを取り出し、室温で1時間の回復期間を可能にします。
- バック1時間、摂氏37度の水浴中にバイアルを置きます。
- 羽化するまで22℃で12時間の明/暗サイクルでインキュベーターで水浴とストアからバイアルを取り外します。
行動試験のための準備4。
- 羽化後、氷上でハエを麻酔。 MARCMのためのすべての遺伝的要素を含み、GFP発現マーキングされたクローンは、おそらく親銘柄で使用観察可能な表現型マーカーに基づいて観察される示す遺伝子型を有するハエを選択します。虹彩切除術ハサミでハエを斬ります。
注：例えば、私たちは遺伝子マーカーなしでハエのためCYO（カーリー翼）及びSb（無精ひげ毛）同定するために、選択されましたモザイク領域を作成するために必要なすべての遺伝的要素を含むことになる年度ハエは、GFPでマークされました。
注意：斬首が刺激されると飛んから大人を防止する必要があります。 - 閉じられた、湿った環境でのヘッドレスハエを置き、約10可能に - 回復の20時間を。右自身さらなる試験のため乱さハエをのみを使用します。テストは断頭の30時間以内に飛びます。
5.行動試験
- 蛍光解剖顕微鏡下で断頭ハエを観察することによって、毛外部感覚器官のGFPでマークされたホモ接合クローンを同定します。剛毛名および左側または右側を記録します。任意の潜在的なバイアスを排除するために、毛刺激を行うラボメンバーは毛、野生型または変異体の遺伝子型に盲目でなければなりません。
- 硬い髪や細かい鉗子でフライ本体に向かって毛と脚の再を観察マークされたGFPを偏向させることによりグルーミング反射を引き出しますsponse。彼らの足を移動しないハエに刺激し、ゼロのスコアを毛に応じて自分の足を持ち上げハエに1のスコアを与えます。
注：以前の研究6,7は、特定の毛を刺激することによって誘発された足の応答を特徴としています。これは、各剛毛に応答足とその特定の毛の刺激に反応するハエの割合が含まれています。私たちは私たちがVandervorstの分類6に基づいて対応することが期待足の動きを記録しました。 - 離れて2分間隔の5件の試験を実施します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このプロトコルの成功は、主にテスト可能なハエの全収率に依存して、熱ショックの効果は、有糸分裂組換え、2分間隔で刺激されたハエにおける強固な行動反応を得る能力を誘導します。胚の推定12.5％が必要MARCM要素およびGFP発現の可能性を有する孵化する成人の推定16.67％を含有することを考えると、それは時限中の卵の高い数を得ることが重要である産みます。成功したタイミングの例を図1Aに示されているプロトコールの残りの部分に使用される4時間の間隔にわたって置きます。
ヒートショックを85に行われた場合 - 産卵後100時間を、GFP標識された外部感覚器官の収率が最もハエ標識macrochaetaeのうちの1つを有するとともに、最高です。関心の多くの領域がtestablの拠点でホモ接合細胞を含んでいてもよいです熱ショックを背中心とポスト鼻翼と、この期間内に実行された電子の毛が（ 図2A）は、最も頻繁にラベルされた発見され剛毛。興味のあるボディ領域、あるいは全くGFP発現（ 図2B）の外側のGFP発現のパッチでこのウィンドウ結果の外の時点。
当然エスケープ応答19を開始することによって迫り来る刺激に反応飛びます。逃げるのハエを防ぐために、我々は、ハエを断頭。グルーミング応答回路は、腹側神経索5内にそのまま残ります。ハエは、二酸化炭素麻酔下で断頭場合も回復するが、氷の上で冷たい麻酔を断頭とき数時間で回復しません。断頭後、ハエは、乾燥を防ぐために、回復期間中に囲まれた、湿った環境で保管する必要があります。いくつかのハエが乾燥するか（ 図1B）に立つことができないかもしれないが、のみ（ 図1C）に立つことができるものがテストに使用されています。試験の前に、ハエは胸背板にタッチした後の動きを監視することにより、一般的な応答性がチェックされます。多くのハエが数日間応答のままですが、テストは24で完了する必要があります - 断頭後36時間。観察者が真の刺激依存グルーミング応答とフライの一般的な動きを区別する難しさを持っている可能性があるため、多動は行動試験中に問題となる可能性が飛びます。触覚刺激によって誘発されるない余分な動きを有する動物では、より信頼性の高い結果が静止状態になるために非常に活発ハエを待つことによって達成されます。
我々は、毛に慣れを防止するために、2分間隔で離間し5回、触れたときの野生型ハエの47％が少なくとも1回反応することを見出しました。いくつかのグループは異なる毛の刺激は、特定の脚6,7のパターン化された応答を誘発することが示されています）6応答ハエの割合を刺激した後グルーミング反射を誘発しない剛毛の。我々の実験では、野生型対照ハエは、試験（ 図3）の（能登胸膜）86％14％（背側中央）からの光のタッチに反応しました。未知の変異体とMARCMベースの画面で、mechanosensationに関与しない突然変異を含有するハエは、野生型コントロール動物で観察されたものと同様の信頼性のある行動反応を示すことが期待できます。
予想として知られている機械受容変異体、NOMPCはグルーミング応答を破壊しました。コントロールハエは、ホモ接合クローン化された後鼻翼に刺激が時間の37％（ 図4）毛毛に反応しました。これとは対照的に、NOMPCためにホモ接合した剛毛を有する動物は、時間（ 図4）の2％を答えました。野生型のハエが再ながらそれに相当異なる別の毛の刺激に、これらの結果は、NOMPCとして機械受容変異は、ほぼグルーミング応答を排除することを示唆しています。未知の変異体との画面で、グルーミング応答を阻害mechanosensationに関与するいくつかの突然変異が期待されています。
図1.適切な飼育条件が最適な行動試験のために必要とされます。 4時間の産卵期間- （A）胚の十分な数が2以下の必要とされています。 4時間の時限産卵後の胚の数が大人の十分な数の行動試験のために飛んで得する可能性がある。（B）断頭後の回復期間中、一部のハエが生存せず、さらなる試験で使用することはできません。（C）正しく回復期間中に湿った環境下で保存した断頭ハエがあります行動アッセイでテスト可能。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
毛図 2. MARCMクローン85との間で熱ショックを与え-産卵後100時間。産卵後101時間- （A）は 、成人におけるGFP発現は、熱が98に衝撃を与えたときに飛びます。 。産卵後164時間-最大10 macrochaete毛がホモ接合変異体の外部感覚器官を含み、グルーミング応答行動アッセイにおける試験に適した成人（B）GFP発現は、熱が161に衝撃を与えたときに飛びます。テスト可能な外部感覚器官でホモ接合細胞のないパッチがないことを示す、macrochaete剛毛の拠点でGFP発現の欠如に注意してください。arge.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
触覚刺激に対する反応の頻度3.図は、毛のアイデンティティに依存している。単一の毛の刺激に対する個々のハエの応答の合計数は、パーセント応答を与えるために刺激の数で割りました。それぞれが（テストハエのN =＃、22ポストエイラーを、21背中央14、胚盤、7 Notopleural）毛のためにパーセンテージを平均した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. NOMPCの変異体は、pの触覚刺激。刺激に応答しませんOST-翼状剛毛は野生型MARCMクローンにおける応答を誘発します。しかし、NOMPC 3だったポスト鼻翼剛毛のMARCMクローンの刺激- / - （緑のバー）が、いくつかの回答が得られた（N = 23、野生型、および12 NOMPC - / - ）。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは 、ショウジョウバエでmechanosensationに影響を与える変異をスクリーニングするために、大人の行動アッセイを利用しています。突然変異体のコレクションは、成人としてのスクリーニング不可能に致死P因子の変異が含まれているため、このプロトコルは最初のリーと羅によって記述複雑な遺伝的手法を利用しています、（1999）、成人の致死性を回避するための呉とルオプロトコル、（2006）などの詳細。 MARCMは、ホモ接合細胞のクローン領域を生成するために、相同染色体間有糸分裂組換えを誘導します。これらの領域があるため、有糸分裂組換え時に発生するリプレッサータンパク質、浴槽-GAL80の損失のGFPでマークされています。特定の遺伝子座でホモ接合性である細胞を生成するためにMARCMを使用することにより、遺伝子機能は、このホワイトペーパーで説明した行動アッセイを含む種々の方法を使用して成虫に研究することができます。
数とBのできる特定の遺伝子の両方を制限する主な要因Eテストは、ハエのゲノム内のFRT部位の存在です。フライ株式は、目的の変異の染色体腕のFRT部位が含まれている必要があります。 MARCM準備フライ株式は、有糸分裂組換えを可能にするために、変異染色体と同一のFRT部位が含まれている必要があります。私たちの研究室では、我々はFRT40AとFRT42DサイトとMARCMの背景を含むフライ株式を開発しました。これらの株式は、私たちはそれぞれ、既に2Lと2R染色体腕に対応するFRT部位と組み合わせて任意の大人の致死P因子をスクリーニングすることができます。メカノやグルーミング反射に影響を与える突然変異についてのスクリーニングにMARCMの可能性を最大化するために、第3染色体の両腕とX染色体上の遺伝子を検査することのできるMARCMの背景を持つ追加のフライ株が作成されます。開発されるとFRT部位と組み合わせて最も成人致死P因子突然変異がmechanosensationの関与をテストするために、これらの銘柄ができるようになります。
熱SHのタイミング関心対象の遺伝子座におけるヘテロ接合性のハエの残りの大部分を残しながらOCKプロトコルは、外部感覚器官におけるホモ接合セル領域の数を最大化するために開発されました。関心の多数の領域は、複数の毛が（ 図2）を試験することを可能にするために、二重の熱ショック後のGFP発現によってマークすることができます。 MARCMプロトコルは、関心のある特定の領域にホモ接合致死突然変異を作成するための絶好の機会を提供しますが、私たちのMARCMプロトコルは、最終的にテスト可能になる剛毛するためにどのようにランダムなプロセス作り、リコンビナーゼ活性の熱ショック誘導に依存しています。それぞれが特定の足の毛づくろいが6,7レフ誘発毛ので、我々は、野生型MARCMクローンにおける応答は、以前に記載されたものと同等であることを確認することが重要でした。 MARCMベースのスクリーンの効率性を最大化する変異体の応答をmacrochaete剛毛のいずれかをテストするために、これらのDATを比較する機能が必要ですMARCM対応株式の対応する毛からの応答率に対する。我々はMARCMハエにGFPを発現する剛毛でCorfasとDudai 7の結果を確認しています。
容易に正常と異常なフライ行動反応を区別する能力はメカノと干渉する変異を決定することが重要です。メカノやグルーミング反射の他の側面に関与する遺伝子の突然変異は、足の応答を阻害する必要があります。 MARCM対応株式の対応する毛で有意に低い応答率が期待されています。モザイクNOMPCと野生型ハエにおける行動反応率はMARCMベースの行動画面は機械刺激変異体および正常なハエを区別するために使用することができるという原理の証拠として役立ちます。我々はNOMPC変異モザイククローンで、刺激を毛に応答しグルーミング反射がほぼ消失していることが示されています。展示テスト14の2つだけハエ脚応答。これらのハエのそれぞれがMARCMベースの行動アッセイはmechanosensation欠陥を識別するのに有効であることを示唆し、テストの過程で一度だけ答えました。機械受容変異体を区別することができ、観察者はハエ変異なしまたはグルーミング応答に関与していない変異に飛びます。そのため野生型応答の変動度が高いのは、画面が強い対立遺伝子を識別しますが、可能性による弱い対立遺伝子に行動のより微妙な変化を見逃すことになります。スクリーニングされる変異体のコレクションは、ホモ接合性致死対立遺伝子を含むので、これらは、強いまたはヌル対立遺伝子であり、タンパク質の機能を破壊する可能性があると思われます。しかし、画面は開発中の致死かもしれ対立遺伝子を逃すが、MARCMにより、より限定的にホモ接合作ったときより微妙な機械刺激欠陥を生成することになります。
私たちは簡単にするために全か無かのスコアリングシステムを選択しました。この方法は、寛大なをもたらします脚の動きの程度に応じて、4 - 0のスコアを割り当てCorfasとDudai 7が使用するシステムに比べて得点。全か無かのシステムでは、任意の応答が、刺激に対する応答は、感覚系の刺激を検出し、モータシステムにシグナリングされていることを示すと仮定して完全に信用を与えられます。
この画面では、行動の回路の任意のステップに影響を与える変異を識別することができます。またはカルシウムイメージング（カーナンら 5のように）そのような電気生理学などのさらなる試験は、変異が直接メカノまたは感覚運動反射アークの発達や機能のいくつかの他の側面に影響を与えるかどうかを決定するために使用されなければなりません。
ショウジョウバエは mechanosensationの研究のための優れたモデルシステムを提供メラノ 。外部感覚器官は、哺乳類の内耳の有毛細胞で多くの構造的および機能的類似性を共有します20。 ショウジョウバエでは、このプロセスに関与する分子の解明は、哺乳類ホモログおよびオルソログを明らかにする可能性があります。 mechanosensationを崩壊させる変異を発見することを目的と画面はハエや哺乳類の両方で、このプロセスの理解を深め、さらにこれらの分子を同定し、特徴付けるために、生物学的な電気生理学的、および生化学的研究その後の細胞のための道を開きます。 mechanosensationに影響を与える突然変異についてMARCMベースの画面が新しいメカノに関与する遺伝子や反射をグルーミングフライを明らかにグルーミング応答行動分析と対になって十分に確立遺伝的手法を使用します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は全く競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
著者らは、ハエの株式の寛大な共有のためのブルーミントンストックセンター、Liqun羅、チャールズZuker、とリリーとユウ農月に感謝し、資金調達のために、以下の希望：（JDとSW）はSOMAの-URM、学士フォード学部夏フェローシップを、レニーとアンソニー・M・マーロン、MD '63夏の研究フェローシップ（CLおよびDLに）（SW）は、BD社サマー研究員を経て（TO）ジェームズ・C. '75とジェーンColihan夏の研究フェローシップ（DLに） （TO）にホーリークロス、ストランスキー財団サマー研究員の大学の卒業生/親サマー研究基金。ラボですべての作業をサポートするためのホーリークロスカレッジで生物学科と学部長のオフィスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brewers Yeast (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Fly Food |
| Corn (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Fly Food |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Fly Food |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Fly Food |
| Molasses (1 Gallon) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Fly Food |
| Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Fly Food |
| Phosphoric acid | Fisher | A260-500 | Fly Food |
| Drosophila Vials, Narrow (PS) | Genesee | 32-109 | Fly Cultures |
| 6oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Plastic Fly Bottles | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayon Balls, Large | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 | Fly Food Preparation |
| Droso-Filler, Bottles | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparation |
| 8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount 1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | Fly Food Preparation |
| Water jacketed Kettle | Fly Food Preparation | ||
| Diurnal Growth Chamber | Forma Scientific | Temperature and light/dark cycle controlled | |
| Water bath | VWR | For heat shock | |
| MicroScissors | Fine Science Tools | 15000-08 | For removing heads |
| Fluroscence Dissecting Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter |
| Fluroscence Light Source | Zeiss | X-Cite 120 | Fiber optic light pipe makes this easy to configure |
| Camera for Scope | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Image acquistion software | Zeiss | ||
| Ice bucket | for cold anthesia | ||
| Homemade cold anthesia tray | for cold anthesia decapitation | ||
| Plastic boxes | for recovery of decaptitated flies in humid environment |
References
- Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
- Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
- Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
- Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
- Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
- Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
- Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
- Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012 (2010).
- Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
- Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).
