Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı Published: December 30, 2015 doi: 10.3791/53537

Abstract

Çünkü memeli iç kulak saç hücrelerinin yapısal ve işlevsel homoloji, Drosophila dış duyu organlarını innerve nöronların mechanosensation çalışma için mükemmel bir model sistemi sağlar. Bu protokol, mechanosensation müdahale mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir meyve sineği basit bir dokunmatik davranışını tarif etmektedir. Sineklerin toraks ya birinci ya da üçüncü ayağı bir tımar refleksini ortaya çıkarır bir macrochaete dokunsal uyarım kıl. Mechanotransduction (örneğin NOMPC gibi) müdahale mutasyonlar ya da refleks yayın diğer yönleri ile, bakım tepkisini inhibe edebilir. Yetişkin davranışların geleneksel ekran gelişimi sırasında gerekli rolleri vardır mutantlar cevapsız olurdu. Bunun yerine, bu protokol İfade tarafından oluşturulur ve işaretlenmesi için homozigoz mutant hücrelerin sadece sınırlı bölgeler için izin vermek için bir bastırılabilir hücre işaretleyici (MARCM) mozaik analizi ile dokunmatik ekran birleştirenYeşil floresan proteini (GFP) salgılamanın. Anormal davranış yanıtları için MARCM klonlar test ederek, daha geleneksel yöntemlerle cevapsız olurdu mechanosensation katılan yeni genlerin aramak için öldürücü p-element mutasyonlarının bir koleksiyon taranması mümkündür.

Protocol

1. Haçlar MARCM Sinekler oluşturmak için

  1. 22 santigrat derece veya standart Drosophila ortam Mısır unu pekmez ortam (% 0.13 Tegosept, 23.5 g / L maya, 60 g / L Mısır unu, 60 mL / L melas;, 4 mL / L asit karışımı 6.5 g / L agar) üzerine sinekler bakımı Bir 12-st ışık / karanlık döngüsünde.
    Not: Standart sıcaklık daha düşük bir sağlıklı MARCM-stoklarını tutmak için kullanılır. Bu 14 gün yumurta ve yetişkinlik arasındaki gelişimsel süresini uzatır.
  2. Bir yukarı-aktive dizisi (UAS-GFP), GAL80 bastırıcı protein, Gal4 transkripsiyon faktörü, bir kontrol altında (GFP gerekli genetik elementler içeren bir MARCM hazır stoktan - (8 gün eski, yaklaşık 1) bakire kadın kullanın ısı-şok odaklı rekombinaz ve FRT rekombinasyon sitesi).
    Not: Bizim MARCM hazır stokları aşağıdaki genotipleri içerir: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb.
    Not: Belirli FRT sitesi mutasyon yere bağlı olacaktırgenomuna. Örneğin, FRT40A gibi NOMPC (MARCM protokolleri ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için 10 bakınız) olarak kromozomun 2 sol kolunda, üzerinde mutasyon test etmek için kullanılır.
  3. Bir ilgi mutasyon ve buna tekabül eden FRT sitesini ihtiva erkeklere Çapraz MARCM hazır bakire kadın (; NOMPC3, FRT40A / CYO, örneğin w- + / +). Etkili MARCM indüksiyonu için kontrol etmek için, aynı FRT bölgesini ihtiva eden bir erkek sinekler kullanılarak bir ikinci çapraz ayarlanır, ancak mutasyonu olmayan. Melezlerde 1 erkek: 5 kadın yaklaşık bir oranını kullanın.

Döşeme 2. Zamanlı Yumurta

  1. Sinekleri, en az bir gece çiftleşme bırakıldıktan sonra, taze ortam ile yeni şişelere yetişkin hareket eder. Sinekler tekrar yeni şişe içine haçlar aktarmadan önce yaklaşık 4 saat karanlık ortamda yumurtalarını bırakmak için izin verin. Yumurtlama döneminin başlangıç ​​ve bitiş saatlerini not alın.
    Not: 4-hr interva sonundan önce medyaya yumurta sayısının yüksek olması göründüğünde kısa aralıklarla kabul edilebilirl.
    1. Isı, daha sonra şok olması için santigrat 22 derece 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde yeterli yumurta sayısına (yaklaşık 20'den fazla) ve mağaza ile şişeleri tutun.
      Not: Yetişkin onlar daha fazla test için muhafaza edilmesi tavsiye edilir davranışsal test ve verimlilik çıkarına uçar medya üzerinde yumurta düşük sayıda küçük şişeler (az 20 yaklaşık daha) yeterli sayıda elde etmek olası değildir.
      Not: Bizim sinekler 8 PM 8 saatleri arasında ışıkları ile yetiştirilir. 8 PM ve 8:00-gece yarısı - Biz puan daha yüksek yumurta yoğunlukları yol akşam saat, bu nedenle genellikle 4 ila zamanlı haç yapmak bulduk. Inkübatör düzenli aydınlık-karanlık döngüsü rahatsız etmemek için sinekler ertesi gün kuluçka iade edilir daha sonra karanlık bir kabine oda sıcaklığında kendi yumurtalarını ve.

3. Mitotik Birleşimi tetikleyebilecek Isı Şok gerçekleştirin

  1. Yaklaşık 85 - yumurtlama sonrasında 100 saat, yer v1 saat boyunca 37 ° C'de bir su banyosu içine IALS. Su seviyesi şişeleri medyanın yüksekliğinin üstünde ulaşır, ancak tam boğulmaktan larvaları önlemek için flakon daldırın olmadığından emin olun.
  2. Su banyosu şişeleri çıkarın ve oda sıcaklığında 1 saatlik toparlanma dönemine izin verir.
  3. Geri 37 santigrat derece su banyosu içine 1 saat yerleştirin şişeleri.
  4. Eclosion kadar 22 derece santigratta 12 saat ışık / karanlık döngüsünde inkübatör su banyosunda deposundan şişeleri çıkarın.

Davranışsal Test 4. Hazırlık

  1. Eclosion ardından, buz üzerinde sinekler uyutmak. MARCM için tüm genetik öğeleri içeren ve GFP-işaretli klonlar muhtemelen üst stoklarında kullanılan gözlemlenebilir fenotip belirteçler dayalı görülecektir işaret genotipleri ile sinekleri seçin. Iridektomi makasla sinekler başını kesmek.
    Not: Örneğin, genetik belirteçler olmadan sinekler için CYO (kıvırcık kanatlar) ve Sb (anız kıl) olduklarını gösteren seçilenmozaik bölgeleri oluşturmak için gerekli tüm genetik unsurlar içerecektir fy sinekler GFP ile işaretlenmiş.
    Not: Decapitation uyarıldığında uzak arasındaki yetişkin önlemek için gereklidir.
  2. Kapalı, nemli ortamda başsız sinekler yerleştirin ve yaklaşık 10 izin - kurtarma 20 saat. Sadece kullanım hakkı kendilerini daha fazla test için tedirgin o zaman uçar. Deney Dekapitasyon 30 saat içinde uçar.

5. Hareket Testleri

  1. Bir floresan diseksiyon mikroskop altında decapitated sinekler gözlemleyerek, kıl dış duyu organları da GFP ile işaretlenmiş homozigot klonları tanımlamak. Kıl adını ve sol veya sağ tarafına kaydedin. Herhangi bir potansiyel önyargı ortadan kaldırmak için, kıl stimülasyonu gerçekleştirmek laboratuar elemanı kıl, vahşi tip veya mutant genotipine kör olmalıdır.
  2. Sert saç veya ince forseps ile sinek vücudun doğru kıl GFP saptırma bir tımar refleksini işaretli ortaya ve bacak yeniden gözlemlemekyanıtlarının yokluğu. Stimülasyon ve bacaklarını hareket etmiyor sinekler sıfır puan kıl cevaben kendi bacak kaldırma sinekler birinin bir puan verin.
    Not: Daha önceki çalışmalarda 6,7 belirli bir kıl uyararak ortaya bacak tepkisini karakterize var. Bu, her bir fırça kılı yanıt bacak ve söz konusu kıl uyarılmasına yanıt sinekler oranını içerir. Biz sadece Vandervorst sınıflamasına 6 dayalı cevap bekleniyor bacak hareketleri attı.
  3. Birbirinden 2 dk aralıklı beş deneyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolün başarısı büyük ölçüde test edilebilir sineklerin toplam verim bağlıdır, ısı şoku etkinliği mitotik rekombinasyon ve 2 dakika aralıklarla uyarılan sinekler sağlam bir davranışsal yanıt elde yeteneği teşvik etmek. Embriyoların yaklaşık% 12.5, gerekli MARCM elemanları ve GFP tanımı için potansiyele sahip Eclose yetişkin yaklaşık% 16,67 ihtiva göz önüne alındığında, bu zamana bırakır sırasında yumurta yüksek sayıda elde etmek için kritiktir. Başarılı bir Zamanlı bir örneği, Şekil 1A'da gösterilen protokole geri kalanı kullanılabilecek bir 4 saat aralığı içinde yatmaktadır.

Isı şoku 85 gerçekleştirildiğinde - yumurtlama sonrasında 100 saat, dış duyu organları etiketli GFP verimi en sinekler etiketli macrochaetae biri sahip, en yüksek olduğu. Ilgi alanı çok testabl ait üslerde homozigot hücre içerebilirIsı şokları dorsal orta ve post-alar kıl olmak bulundu etiketli en sık (Şekil 2A) ile, bu süre içinde gerçekleştirildiğinde e kıllar. Ilgi ya da GFP (Şekil 2B) vücut bölgelerin dışında GFP tanımının parçalar halinde bu pencere sonucu dışına saat işaret eder.

Doğal bir kaçış tepkisi 19 başlatarak bir başgösteren uyarana cevap sinekler. Kaçmasını uçar önlemek amacıyla, sinekler başları kesildi. Tımar tepki devresi ventral sinir kordonu 5 bozulmadan kalır. Sinekler karbondioksit anesteziyle eğer iyi kurtarabilirsiniz ama buz soğuk anestezi ile decapitated zaman birkaç saat içinde geri değil. Dekapitasyon sonra, sineklerin kuruma önlemek için iyileşme döneminde kapalı, nemli ortamda saklanmalıdır. Bazı sinekler birbirinden ayrılacak ya da (Şekil 1B) durmak mümkün olsa da,Sadece (Şekil 1C) durmak mümkün olanlar test için kullanılır. Testten önce, sinekler notum bir dokunuş sonra hareket izleyerek genel yanıt kontrol edilir. Birçok sinekler birkaç gün boyunca duyarlı kalır, ancak test 24 tarafından tamamlanması gereken - Dekapitasyon sonra 36 saat. Bir gözlemci, gerçek bir uyarıcı bağımlı damat tepki ve sinek genel hareketler arasında ayrım zorluk çekebilir, çünkü hiperaktivite davranış testi sırasında bir sorun olabilir Fly. Taktil uyarımı ile yol açılan olmayan fazla hareket hayvanlarda, daha güvenilir sonuçlar hareketsiz hale hiperaktif sinekler bekleyen elde edilir.

Bir fırça kılında alışkanlık önlemek için 2 dakika aralıklarla yerleştirilmiş beş kez, dokunulduğunda, vahşi tip sinekler 47%, en az bir kez yanıt bulundu. Çeşitli gruplar, farklı kıllar uyarılması, belirli bir bacak 6,7 desenli bir tepki ortaya çıkarır göstermiştir 6. Deneylerde, vahşi tip kontrol sinekler çalışmaların% 86 (noto-plevral)% 14 (merkez dorsal) gelen hafif bir dokunuşla (Şekil 3) yanıt verdi. Bilinmeyen mutantları ile MARCM bazlı ekranında, mechanosensation karışmayan bir mutasyonu ihtiva eden sineklerin vahşi tipli kontrol hayvanlarında gözlenen benzer güvenilir bir davranış yanıt verdiği beklenebilir.

Beklendiği gibi bilinen mechanosensitive mutantı NOMPC bakım yanıt bozulur. Kontrol sinekler homozigot klonlanmış sonrası alar de uyaranlar zaman% 37 (Şekil 4) kıllar kıl yanıt verdi. Bunun aksine, NOMPC için homozigot olan fırça kıllarına sahip hayvanların (Şekil 4) zaman% 2 verdi. Vahşi tip sinekler re ikensını da farklı farklı kılların uyarılmasına, bu sonuçlar, bu NOMPC bir mechanosensitive mutasyonu, yaklaşık bakım yanıtını ortadan kaldırmaktadır düşündürmektedir. Bilinmeyen mutantları bir ekranda, bakım tepkisini inhibe eden mechanosensation görevli birkaç mutasyon beklenmektedir.

figür 1
Şekil 1. Uygun Yetiştirme Koşulları Optimal Davranış Testi için gereklidir. 4 saat yumurtlama dönemi - (A) embriyo yeterli sayıda 2 Aşağıdaki ihtiyaç vardır. 4 saat sonra, zamana bağlı yumurtlamaya embriyo sayısı yetişkin yeterli bir davranışsal testleri için uçan vermesi muhtemeldir. (B), başı kesilerek, aşağıdaki iyileşme süresi boyunca, bir sinek saklanamaz ve daha test kullanılamaz. (C) düzgün iyileşme döneminde nemli bir ortamda depolanmıştır bir başları sinek davranışsal deneyde test edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. kıllar MARCM klonlar Isı şok 85 arasında - 100 Hr sonra yumurta döşeme. Yumurtlama sonrasında 101 saat - ısı 98 şoke zaman yetişkin (A) GFP uçar. 10 gibi macrochaete kıllar homozigot mutant dış duyu organlarını içeren ve damat tepkisi davranış tahlilde test için uygun ısı 161 şoke zaman yetişkin (B) GFP uçar -. Yumurtlama sonrasında 164 saat. Test edilebilir bir dış duyu organı olarak homozigot hücrelerin yok yamaları belirten macrochaete kıllar üslerde GFP olmayışına dikkat edin.arge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Dokunsal Uyarım Yanıtın Frekans 3. Şekil Kıl Kimlik Bağımlı olduğunu. Tek bir kıl uyarılması için tek bir sinek yanıtların toplam sayısı yüzde yanıt vermek için uyaranların sayısına göre bölündü. Her (test edilen sinekler N = # 22 Mesaj Alar, 21 Dorsal Merkez 14, Scutellar, 7 Notopleural) kıl için Yüzdeler ortalaması alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. NOMPC mutantlar s Tactile Stimülasyon. Uyarım yanıt Etmeyinost-alar kılların, vahşi tip MARCM klonlarında bir yanıt ortaya çıkarır. Ancak, NOMPC 3 idi sonrası alar kıllar üzerinde MARCM klonlarının uyarılması - / - (yeşil çubuk) birkaç yanıtları sonuçlandı (N = 23 vahşi tip ve 12 NOMPC - / -). Büyük halini görmek için tıklayınız bu rakamın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mutantlar toplama yetişkinler olarak tarama engel olur ölümcül p-element mutasyonları içerdiğinden bu protokol, bu protokol ilk olarak Lee ve Luo tarafından açıklanan karmaşık genetik tekniği kullanır. Drosophila mechanosensation etkileyen mutasyonların taranması için yetişkin bir davranış deneyi kullanır (1999) ve yetişkin ölümcül aşmak için Wu ve Luo tarafından bir protokol, (2006) gibi ayrıntılı. MARCM homozigot hücrelerinin klonal bölgelerini oluşturmak için homolog kromozomlar arasındaki mitotik rekombinasyon indükler. Bu bölgeler için mitotik rekombinasyon sırasında meydana represör proteini, küvet-GAL80 kaybı GFP ile işaretlenmiştir. Belirli bir genetik lokusta homozigot olan hücreleri üretmek için MARCM kullanarak gen fonksiyonu, bu yazıda anlatılan davranış tahlilinde de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak sinekler yetişkin incelenebilir.

Numarası ve b belirli genleri hem sınırlayıcı birincil faktörTest e anında genomu içindeki bir FRT bölgesini varlığıdır. Fly stokları ilgi mutasyon kromozom kolunda FRT sitesi içermelidir. MARCM hazır sinek stokları mitotik rekombinasyon için izin mutant kromozomu olarak aynı FRT sitesini içermelidir. Laboratuvarda, biz FRT40A ve FRT42D siteleri ile MARCM arka içeren sinek stokları geliştirdi. Bu hisse senetleri bizi sırasıyla zaten 2L ve 2R kromozom kollarında karşılık gelen FRT sitesi ile kombine herhangi bir yetişkin öldürücü p-elemanı ekrana sağlayacaktır. Her iki üçüncü kromozom kolları ve X kromozomu oluşturulacak üzerindeki genlerin test edebilen MARCM geçmişlere sahip mekanotransdüksiyonu veya tımar refleksi, ek sinek stokları etkileyen mutasyonlar için ekranlarında MARCM potansiyelini maksimize etmek için. Geliştirilen bir kez FRT sitesi ile birlikte en çok erişkin ölümcül p-element mutasyonları mechanosensation karıştığı için test edilmesi için, bu stokları sağlayacaktır.

Isı sh zamanlamasıilgi odağı sinek heterozigot geri kalanından çok bırakırken ock protokol, dış duyu organları da homozigot hücre bölgelerin sayısını arttırmak için geliştirilmiştir. Ilgi alanı çok çoklu kıllar (Şekil 2) test edilecek sağlayan, bir çift ısı şoku aşağıdaki GFP ile işaretlenebilir. MARCM protokolü ilgi belirli bölgelerde homozigot ölümcül mutasyonlar yaratmak için mükemmel bir fırsat sağlar, ama bizim MARCM protokol sonuçta test edilebilir olacak kıllar hangi olarak oa rastgele verme süreci, rekombinaz aktivite ısı şok indüksiyon dayanır. Her biri belli bir bacak tımar 6,7 refleks ortaya çıkardığma kıl Çünkü bize yabani tip MARCM klonlar olarak yanıtlar daha önce tarif kıyaslanabilir onaylamak için bu önemliydi. Bir MARCM tabanlı ekran verimliliği maksimize mutant yanıt için macrochaete kılların herhangi test etmek ve bu dat karşılaştırmak yeteneğini gerektirirBir MARCM hazır stok karşılık gelen kıl gelen yanıt oranı karşısında. Biz MARCM sinekler GFP ifade kıllar Corfas ve Dudai 7 sonuçlarını doğruladı.

Hali hazırda normal ve anormal sinek davranışsal cevapları arasındaki ayrım becerisi mechanotransduction müdahale edebilecek şekilde oluşabilirler mutasyonların belirlenmesi çok önemlidir. Mechanotransduction veya bacak tepkisini inhibe gereken bakım refleks diğer yönünde yer alan bir gen bir mutasyon; Bir MARCM hazır stok gelen kıl de önemli ölçüde düşük yanıt oranı bekleniyor. Mozaik NOMPC ve vahşi tip sinekler davranışsal yanıt oranları MARCM dayalı davranışsal ekran mechanosensory mutantlar ve normal sinekler arasında ayırt etmek için kullanılabilir prensibine bir kanıtı olarak hizmet etmektedir. Biz NOMPC mutant mozaik klonlarda, stimülasyon kıl yanıt olarak bakım refleksi hemen hemen yok olduğunu göstermiştir. Ondört Sadece iki sinekler sergilendi test edilmişbacak yanıt. Bu sinekler her biri MARCM dayalı davranışsal deney bir mechanosensation kusur tespit etkili olduğunu düşündürmektedir, test boyunca sadece bir kez yanıt verdi. Mechanosensitive mutant ayırt edebilirsiniz bir gözlemci uçar ve mutasyon olmayan veya tımar yanıtta yer almayan bir mutasyon ile uçar. Çünkü yabani tip tepkileri değişkenlik yüksek derecede, ekran, güçlü allel tespit edecek, ama büyük olasılıkla nedeniyle zayıf allellerine davranış daha ince değişiklikler özleyeceğim. Elenecek mutantlar toplama sadece homozigot ölümcül allel içerir, bu nedenle bu güçlü veya boş alleldir ve protein fonksiyonunu ortadan kaldırmak muhtemel olması muhtemeldir. Ancak, ekran gelişiminde ölümcül olabilir allel özledim, ama MARCM tarafından daha sınırlı bir şekilde homozigot yapıldığı zaman daha ince mechanosensory kusur üretecektir.

Biz basitlik için bir all-or-yok skorlama sistemi seçti. Bu yöntem, cömert bir verimBacak hareketinin boyutuna bağlı olarak 4 - 0 skorla atar Corfas ve Dudai 7 tarafından kullanılan sisteme göre puan. Hep ya hiç sisteminde, herhangi bir yanıt uyarısına herhangi bir yanıt duyu sistemi uyarıcı tespit ve motor sistemine sinyal olduğunu gösterir varsayımı ile tam kredi verilir.

Bu ekran davranışsal devresinde herhangi bir adım etkileyen mutasyonlar tespit edebilir. Ya da kalsiyum görüntüleme (Kernan ve ark 5 deki gibi) bu tür elektrofizyoloji gibi başka test, mutasyon ile doğrudan mekanotransdüksiyonu ya da duyusal-motor refleks ark gelişimi veya fonksiyonu başka bir yönü etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılabilir gerekir.

Drosophila mechanosensation çalışma için mükemmel bir model sistemi sağlamak melanogaster. Dış duyu organları memeli iç kulak saç hücrelerinin birçok yapısal ve fonksiyonel benzerlikleri20. Drosophila bu süreçte yer alan moleküllerin aydınlatılması memeli homologları ve ortologlarını ortaya çıkarmak için bir potansiyele sahiptir. Sonraki hücre biyolojik, elektrofizyolojik önünü açacak mechanosensation bozan mutasyonlar keşfetme amaçlı Ekranlar ve biyokimyasal çalışmalar daha belirlemek ve sinekler ve memelilerin hem de bu sürecin anlayışımızı derinleştirmek, bu moleküllerin karakterize etmek. Mechanotransduction ve sinek damat refleks katılan yeni genleri ortaya çıkarmak için bir tımar tepki davranış deneyi ile eşleştirilmiş iyi kurulmuş bir genetik tekniği kullanacak mechanosensation etkileyen mutasyonlar bir MARCM tabanlı ekran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var.

Acknowledgments

Istiyorum Yazarlar Bloomington stok merkezi, Liqun Luo, Charles Zuker ve Lily ve Yuh Nung Oca sinek stoklarının cömert paylaşımı ve finansman aşağıdaki teşekkür: Lisans Ford Fakültesi Yaz Bursu (JD ve SW) somas-URM (SW), Renee ve Anthony M. Marlon, MD (DL) '63 Yaz Araştırma Bursu (CL ve DL için) BD Kurumlar Yaz Araştırma Bursu James C. '75 ve Jane Colihan Yaz Araştırma Bursu (TO) aracılığıyla Mezunlar / Kutsal Haç Koleji Veli Yaz Araştırma Fonu ve Stransky Vakfı Yaz Araştırma Bursu (TO). Laboratuvarda tüm çalışmaları desteklemek için Kutsal Haç Koleji'nde Biyoloji Bölümü ve Dekanlığa Special thanks.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewers Yeast (25 lb) MP Biomedicals  ICN90331225  Fly Food
Corn (25 lb) MP Biomedicals  ICN90141125  Fly Food
Agar (1 lb) MoorAgar Inc. 41004 Fly Food
Tegosept (5 kg) Genesee 20-259 Fly Food
Molasses (1 Gallon) Sugarmill Brand - Thomsen Food Service 0 2625 Fly Food
Propionic Acid Fisher A258-500 Fly Food
Phosphoric acid Fisher A260-500 Fly Food
Drosophila Vials, Narrow (PS) Genesee 32-109 Fly Cultures
6oz Square Bottom Bottle (PP) Genesee 32-130 Fly Cultures
Flugs - Plastic Fly Bottles Genesee 49-100 Fly Cultures
Rayon Balls, Large Genesee 51-100 Fly Cultures
Droso-Filler, Narrow Genesee 59-168 Fly Food Preparation
Droso-Filler, Bottles Genesee 59-170 Fly Food Preparation
8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount  1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz Cleveland Mixer 8A-C Fly Food Preparation
Water jacketed Kettle Fly Food Preparation
Diurnal Growth Chamber Forma Scientific Temperature and light/dark cycle controlled
Water bath VWR For heat shock
MicroScissors  Fine Science Tools  15000-08 For removing heads
Fluroscence Dissecting Microscope Zeiss SteREO Discovery V8  With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter
Fluroscence Light Source Zeiss X-Cite 120 Fiber optic light pipe makes this easy to configure 
Camera for Scope Zeiss AxioCam ICc1
Image acquistion software Zeiss
Ice bucket for cold anthesia
Homemade cold anthesia tray for cold anthesia decapitation
Plastic boxes for recovery of decaptitated flies in humid environment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
  2. Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).
  3. Gillespie, P. G., Walker, R. G. Molecular basis of mechanosensory transduction. Nature. 413, 194-202 (2001).
  4. Corfas, G., Dudai, Y. Adaptation and fatigue of a mechanosensory neuron in wild-type Drosophila and in memory mutants. J Neurosci. 10, 491-499 (1990).
  5. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
  6. Vandervorst, P., Ghysen, A. Genetic control of sensory connections in Drosophila. Nature. 286, 65-67 (1980).
  7. Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9, 56-62 (1989).
  8. Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3, e59 (2005).
  9. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nature Protocols. 1, 2583-2589 (2006).
  11. Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
  12. Walker, R. G., Willingham, A. T., Zuker, C. S. A Drosophila mechanosensory transduction channel. Science. 287, 2229-2234 (2000).
  13. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493, 221-225 (2013).
  14. Arnadottir, J., Chalfie, M. Eukaryotic Mechanosensitive Channels. Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).
  15. Christensen, A. P., Corey, D. P. TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation? Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).
  16. Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion. Neuron. 67, 373-380 (2010).
  17. Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia. PLoS One. 5, e11012 (2010).
  18. Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells. Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).
  19. de Vries, S. E., Clandinin, T. R. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Curr Biol. 22, 353-362 (2012).
  20. Jarman, A. P. Studies of mechanosensation using the fly. Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).

Tags

Neuroscience Sayı 106 MARCM mozaik analizi, davranış deney davranış kusurlar mutant kıl
Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Murphy, T. P., Luu, D. D., DeSimone, More

Murphy, T. P., Luu, D. D., DeSimone, J. A., O'Brien, T. C., Lally, C. J., Lindblad, J. J., Webster, S. M. A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (106), e53537, doi:10.3791/53537 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter