Protocol
Alle onderzoeksprotocollen beschreven zijn beoordeeld door de Universiteit van Chicago Institutional Review Board (IRB). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt voor de operatie en de studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Chicago IRB. Een biologisch veiligheidskabinet type 2 en handschoenen moeten worden gebruikt bij de behandeling van menselijk weefsel voor bescherming en om het risico van besmetting van cellen te verminderen.
1. Isolatie en Cultuur van primaire Ongetransformeerde stromale cellen
- Lichaamsmateriaal verzamelen en voorbereiding.
- Verkrijgen van specimens van menselijk omentum, 2 cm 3, verwijderd tijdens een buikoperatie en onmiddellijk weefsel onder te dompelen in RT-fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (Figuur 2A). Een stuk van omentum 3 cm x 2 cm levert doorgaans 1.000.000 primaire humane mesotheelcellen (HPMC) en 200.000 primaire menselijke fibroblasten of normaal omental fibroblasten (NOF).
- Spin down de PBS het weefsel werd ondergedompeld in 0,5 g gedurende 3min zo spoedig mogelijk na afname (<2 uur in PBS) en breng het weefsel verse 20 ml PBS in een 50 ml conische buis. Snij weefsel in 5mm 3 stukken door fijnhakken met scalpels in een 15 cm diameter, steriele cultuur schotel (Figuur 2B).
- Primaire humane mesotheelcellen celisolatie 8
- Om HPMC isoleren overdragen gehakt weefsel in 50 ml conische buizen en wacht 1 min de vaste delen te zweven boven (figuur 2C en D). HPMC en rode bloedcellen (RBC) aanwezig in de vloeistof op de bodem staan. Gebruik een pipet om de vloeistof vanaf de bodem van de buis en in een nieuwe conische buis te verwijderen. Spin de vloeistof neer op 0,5 g gedurende 3 minuten en zuig het supernatant van de HPMC / RBC pellet.
- Herhaal het proces drie keer: voeg 20 ml PBS aan het gehakt weefsel, zodat het weefsel stijgen, verwijdert vloeistof uit de bodem met een pipet en in de HPMC / RBC buis, spin down, en verwijder desupernatant. Immers spins worden voltooid en het supernatant afgezogen, wordt de korrel HPMC en RBC bevatten.
- Plate alle cellen van de pellet in een 75 cm2 kolf in 15 ml volledig groeimedium (DMEM met 10% foetaal runderserum [FBS], 1% MEM vitamines [93 mg / L], 1% MEM niet-essentiële aminozuren [81,4 mg / L], 1% penicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine]).
- Voer een secundaire PBS wassen om extra HPMCs isoleren.
- Voor de secundaire PBS wassen, schud de resterende vaste weefsel bij 200 rpm, 37 ° C gedurende 10 min in 20 ml PBS, wacht 1 min gedurende het weefsel naar boven drijven. Verwijder de vloeistof uit de bodem van de buis in een nieuwe buis, centrifuge 0.5 xg gedurende 3 min, en zuig de supernatant.
- Plate alle HPMC / RBC uit de tweede PBS wassen in een aparte 75 cm2 kolf in 15 ml volledig groeimedium.
- Om r isolerenemaining HPMC, schud gehakt weefsel bij 200 rpm, 37 ° C ° gedurende 10 min in 20 ml van een 1: 1 0,25% trypsine 25 mM EDTA: PBS oplossing volume. Laat het weefsel te stijgen, verzamelen van de vloeistof op de bodem van de buis in een nieuwe 50 ml buis en spin neer op 0,5 gx 3 min.
- Zuig het supernatant en de plaat de HPMC / RBC in een aparte 75 cm2 kolf in 15 ml volledig groeimedium.
- Cultuur van de cellen uitgeplaat bij 37 ° C en 5% CO2 in een vochtige omgeving. Feed geplateerde cellen door toevoeging van 15 ml volledig groeimedium op dagen 3 en 5 zonder de verbruikte media. HPMC kan gekweekt voor 5-7 dagen voor splitsing zijn.
- Gebruik low-passage HPMC (tot passage 2) in alle experimenten om dedifferentiatie en wijziging van de oorspronkelijke fenotype minimaliseren. Gebruik een wide-field microscoop bij voorkeur met een 20x objectief met plastic differentieel interferentie contrast mogelijkheden of 4-20x objectief met fase contrast capabilities (fase contrast filters op de microscoop) voor het nemen van alle afbeeldingen van de cellen, en een 10x objectief () in heldere gebied te analyseren immunohistochemische 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) kleuring.
- Controleer of de HPMC zijn kubisch en express cytokeratine 8 en vimentine door het uitvoeren immunohistochemie 8 (Figuur 3A, C, E).
- Om HPMC isoleren overdragen gehakt weefsel in 50 ml conische buizen en wacht 1 min de vaste delen te zweven boven (figuur 2C en D). HPMC en rode bloedcellen (RBC) aanwezig in de vloeistof op de bodem staan. Gebruik een pipet om de vloeistof vanaf de bodem van de buis en in een nieuwe conische buis te verwijderen. Spin de vloeistof neer op 0,5 g gedurende 3 minuten en zuig het supernatant van de HPMC / RBC pellet.
- NOF isolatie 8
- Maak 10 ml van een voorraad van collagenase type III-oplossing (10x) door het combineren van een 1: 1: 1 mengsel van 100x Pen-Strep: 1.500 eenheden activiteit / ml collagenase type III: 714 eenheden activiteit / ml hyaluronidase in PBS.
- Schud het gehakte omentum weefsel dat overblijft na HPMC isolatie bij 200 rpm, 37 ° C gedurende 6 uur in 10 ml van 10x collagenase type III verdund in serumvrij medium (DMEM met 1% MEM vitamines [93 mg / L], 1% MEM niet-essentiële aminozuren [81,4 mg / L], 1% penicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine]). Verteerd weefsel ondoorzichtig kijken en kunnen sommige vezelachtige afval (figuur 2E) hebben.
- Centrifugeer de oplossing die NOF cellen in suspensie bij 0,5 g gedurende 3 min bij kamertemperatuur, zuig de supernatant en het pellet plaat in een 75 cm2 kolf in 13 ml volledig groeimedium.
- Verwijder de oude media en te vervangen door 15 ml vers volledig groeimedia na 24 uur. NOF kunnen worden gekweekt gedurende 1-3 dagen voor splitsing. Opmerking proliferatie van de NOF zal ophouden wanneer de cellen confluentie bereiken.
- Controleer of de primaire menselijke fibroblasten zijn plat, langwerpig cellen en expressie vimentine maar niet cytokeratine 8 door het uitvoeren immunohistochemie 8 (figuur 3B, D, F). Gebruik low-passage NOF voor experimenten (idealiter vóór passage 3) dedifferentiation minimaliseren en wijziging van de oorspronkelijke fenotype. Gebruik een wide-field microscoop met een 20x objectief met plastic DIC mogelijkheden voor het nemen van alle fase beelden van de cellen,en een 10x doelstelling in heldere veld immunohistochemische DAB kleuring te analyseren.
2. Plating de Organotypische Cultuur 8
- Vrijgeven van de NOF 75 cm kolf door spoelen met 10 ml PBS, gevolgd door 3 ml van 0,25% trypsine / 25 mM EDTA niet langer dan 5 min. Neutraliseer met trypsine minstens 3 maal het volume van volledige groeimedia.
- Transfer getrypsiniseerd cellen in een 50 ml conische buis en spin neer op 0,5 gx 3 min. Verwijder supernatant en breng cellen terug in 5 ml volledig groeimedium. Gebruik een cel in tegen de cellen hersteld van de kolf te tellen.
- Verdun de cellen in het geschikte volume van volle groei media 2000-4000 NOF per 100 gl plaat op zwart, heldere bodem, 96 putjes. Voeg 0,5 ug / 100 ul van de rat-tail collageen ik naar de cel mengsel voordat plating. Laat cellen zitten bij 37 ° C in 5% CO2 in een vochtige omgeving gedurende ten minste 4 uur, of totdat de cellente houden aan het plaatoppervlak.
- Laat HPMC van de kolf met dezelfde methodes in stappen 2.1 en 2.2 beschreven. Verdun cellen in de juiste hoeveelheid volle groei media 10.000-20.000 HPMC per 50 ul plaat bovenop de NOF reeds bekleed met collageen I in 96-wells platen. Laat cellen zitten bij 37 ° C in 5% CO2 in een vochtige omgeving gedurende tenminste 18 uur voor het begin experimenten.
- Cultuur groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen HeyA8 eierstokkanker cellen in volle groei media. HeyA8 eierstokkanker cellen worden fluorescent gelabelde door expressie van een lentivirale vector die copepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 eierstokkankercellen moet 80-90% confluent op de dag van gebruik (logaritmische groeifase) zijn. Los cellen uit de cultuur plaat en tel met behulp van dezelfde methoden in stappen 2,1-2,2 voor primaire cellen beschreven.
- Laat ovarium kankercellen herstellen volledig groeimedia voor 15-20 min bij 37 ° C in eenconische buis met het deksel losjes afgesloten.
3. adhesietest 8
- Na herstel, de pellet eierstokkankercellen door spinnen gedurende 3 min bij 0,5 x g en verwijder het supernatant en verdun de cellen in het juiste volume van serumvrij medium tot een concentratie van 50.000 cellen / 100 pi te bereiken.
- Inverteer de 96-well platen met de HPMC / NOF organotypische kweken brachten media verwijderen en voeg 100 ul van de kankercel suspensie in serumvrij medium aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C in 5% CO2 in een vochtige omgeving gedurende 30 min tot 4 h.
- Inverteer de 96-putjesplaat media en niet-hechtende cellen te verwijderen. Gebruik een multichannel pipet op laag vermogen om zorgvuldig en voorzichtig pipet 100 ul PBS in elk putje, en omgekeerd bord weer. Herhaal de PBS te wassen eens te meer.
- Inverteer PBS verwijderen en 100 pl 4% paraformaldehyde aan elk putje. Laat de plaat te zitten voor 20 min om de cellen te repareren. Na 20 minuten, draai de plaat en voeg 100 ul PBS.
- Merk op dat de totale fluorescentie putten te melden of het aantal cellen worden gekwantificeerd. Voor kwantificering eerste plaat een standaardcurve in duplo gebruikt HeyA8 cellen bij een concentratie van 1 miljoen cellen / ml.
- Maak de standaard curve door het draaien van een daling van 1 miljoen cellen, het verwijderen van media, en waardoor ze zitten in 1 ml 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten.
- Spin cellen weer en brengen in 1 ml PBS (hertelling cellen tot 1 miljoen / ml concentratie te bevestigen). Plate 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000 en 0 cellen in elk putje in duplo en voeg PBS voor een totaal eindvolume van 50 pl in elk putje.
- Onderkant lees de cultuur plaat op een fluorescerende plaat lezer (excitatie = 488 nm, emissie = 528 nm), schalen hoge putten (50.000 op standaard curve). Gebruik de standaard curve hoeveel eierstokkanker cellen gehecht aan de organotyp berekenenic cultuur in elk putje (Figuur 4A-C).
4. Proliferation Assay 10
- Nadat de eierstokkankercellen herstellen (zie stap 2.5 en 2.6), pellet van de cellen door spinnen gedurende 3 min bij 0,5 xg en Verdun de cellen in het juiste volume van 1% FBS media (DMEM met 1% FBS, 1% MEM vitaminen [93 mg / L], 1% MEM niet-essentiële aminozuren [81,4 mg / L], 1% penicilline streptomycine [Pen-Strep, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine]) tot een concentratie van 4000 cellen bereiken / 150 ul.
- Inverteer de 96-well plaat met de HPMC / NOF organotypische kweken brachten media FBS media verwijderen en voeg 150 ul van de kankercel suspensie in 1% aan elk putje. Incubeer de plaat bij 37 ° C in 5% CO2 in een vochtige omgeving voor 72 uur.
- Onderkant lees de cultuur plaat op een fluorescerende plaat lezer een keer per dag (excitatie = 488 nm, emissie = 528 nm) om de relatieve proliferatie evaluerencellen. Verdere analyse voor 96 uur, verandert de media 48 uur (figuur 5A-C). Wees voorzichtig niet om de cultuur te storen bij het wijzigen van de media (omkeren van de plaat heeft de voorkeur).
5. Invasion Assay 8
- Voordat plating de 3D-cultuur, voeg 7,5 ug rat-tail collageen I in 200 ul PBS om een 24-well cultuur plaat insert (8 urn poriegrootte). Laat de plaat incubatiemengsel O / N, dan verwijder de PBS met een pipet onmiddellijk vóór het uitplaten HPMC / NOF organotypische kweek op de met collageen beklede inserts (stap 2 hierboven).
- Bereid de eierstokkanker cellen zoals in stap 3,1. Om de eierstokkankercellen plaat op de organotypische kweken van de inserts, zorgvuldig gebruiken een pipet om het papier uit de bovenkant van de inzetstukken te verwijderen. Voeg 100 ul van de celsuspensie eierstokkanker in serumvrij medium aan elk putje.
- Voeg 750 pl volledig groeimedium in de put onder het inzetstuk kankercel inducerenvasion in de organotypische kweken. Incubeer de plaat bij 37 ° C in 5% CO2 in een vochtige omgeving voor 24 uur.
Opmerking: Eierstokkanker cellen die binnenvallen de organotypische cultuur zal het inzetstuk steekt en blijven op de onderkant van het inzetstuk. - Na 24 uur, pak de insert met een tang en kort spoelen in een bekerglas van PBS, verplaats dan de insert in een lege put. Scrub de bovenkant van elke insert beide zijden van een wattenstaafje in totaal 1 min. Plaats snel het inzetstuk in een plaat met 750 pi 4% paraformaldehyde in elk putje. Sta elke insert te zitten in paraformaldehyde gedurende 10 minuten voor de overdracht van de inserts in putten gevuld met 750 ul PBS.
- Bekijk de binnengedrongen cellen (gehecht en bevestigd aan de bodem van inserts) met een microscoop bij 2,5x vergroting. Wanneer de gehele put binnen het gezichtsveld, passen de vergroting 10x en neemt 5 afbeeldingen één nabij het centrum en 1 in elk kwadrant van de put, het vermijdenhet nemen van foto's die te dicht bij de randen zijn. Volgen hetzelfde patroon voor elk putje.
- Met het programma van de fabrikant om het aantal cellen te tellen dat het beeld met een gemiddeld aantal cellen per veld binnengedrongen in elk putje (figuur 6A-C) komen volgens hun protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het organotypische kweek werd geassembleerd door eerst primaire menselijke fibroblasten met collageen type I en bedekken deze cultuur met 5 maal het aantal mesotheelcellen. De kweek werd gedurende ten minste 18 uur voor eierstokkanker cellen werden toegevoegd aan adhesie, invasie of verspreiding te bestuderen. Iedere test werd herhaald met meerdere (n = 3-5) 3D cultures verkregen uit verschillende patiënten en verschillende putjes werden getest in elke conditie voor de adhesie (n = 5), proliferatie (n = 5) en invasie assays (n = 3) . Eierstokkanker cellen gehecht aan de 3D organotypische kweek na 4 uur (figuur 4), zich verspreid over de kweek na 72 uur (6 keer de HeyA8 cel verdubbelingstijd) (figuur 5), en viel na 24 uur (Figuur 6). De hechting, proliferatie en invasie van HeyA8 ovariumkankercellen was integrine-afhankelijke (figuur 4-6). Met name de RGD peptide en het blokkeren ANTIBOdies tot 5 -integrin, β 1 -integrin α en β v 3 -integrin remde de eierstokkanker celadhesie de organotypische kweek a-, terwijl de RAD peptide, controle-antilichaam en ß 4 -integrin antilichaam niet (figuur 4) 10. In de proliferatie-assay, de RGD peptide en blokkerende antilichamen aan a 5 - en P 1 -integrin geremd eierstokkanker celproliferatie op de organotypische kweek, terwijl de RAD peptide, controle antilichaam, α vp 3 -integrin antilichaam en ß 4 -integrin antilichaam niet (Figuur 5). In de invasie assay, de RGD peptide en blokkerende antilichamen aan a 5 - en P 1 -integrin geremd, terwijl de α β v 3 -integrin antilichaam versterkt ovariale kankercel invasie door de 3D organotypische kweek. De RAD peptide, controle-antilichaam en β4 -integrin antilichaam had geen invloed invasie (Figuur 6). Zelden zal deze assays niet-interpreteerbare (dwz, α 5 -integrin blokkerende antilichaam zal hechting, proliferatie of invasie niet remmen in vergelijking met het controle-antilichaam). Eerder hebben we gevonden dat bepaalde organotypische kweken zal wegspoelen bij verandering van de media of PBS wassen tijdens de testen. Bovendien, indien de ovariële kanker cellen dood of niet lang genoeg hersteld van de trypsinedigest opnieuw express integrinen, worden de testen niet. Daarom is het altijd belangrijk om een positieve en negatieve controle bij elke test dus de kwaliteit van de organotypische kweek en eierstokkanker cell assay kan worden geëvalueerd. Zoals hier getoond, de RGD peptide, a- en ß 5 -integrin 1 -integrin blokkerende antilichamen remden alle eierstokkanker celadhesie, invasie en proliferatie van de organotypische kweek en kan worden gebruikt als positieve controles in de toekomst te testen. Evenzo β 4 -integrin blokkerend antilichaam geen invloed eierstokkanker celadhesie, invasie en proliferatie van de organotypische kweek en kan worden gebruikt als een negatieve controle in de toekomst assays.
Figuur 1. Histologie menselijke omental metastase. Hematoxyline en eosine kleuring van (A) normaal menselijk omentum (MC, mesotheelcellen, Fib, fibroblasten, Adi, adipocyten) en (B) ovariumkanker omental metastase (Met, eierstokkanker metastase). Bar in panels = 100 urn in lengte. (C) Schematische voorstelling van de organotypische 3D-model van eierstokkanker metastase nabootsen vroege eierstokkanker cel verspreiding naar het oppervlak van het menselijk omentum. Klik hier om een grotere ver bekijkensie van dit cijfer.
Figuur 2. Isolatie van humane primaire cellen omental. (A) Een stuk omentum ten chirurgie in PBS verzameld en naar het laboratorium. Het weefsel wordt gepelleteerd 0.5 xgx 3 minuten en overgebracht op vers PBS. (B) Het stuk omentum wordt overgebracht naar een 10 cm petrischaal, gewassen met PBS en scalpels worden gebruikt om het omentum in kleine stukjes (0,5 cm gesneden 3 ). (CD) De stukken weefsel worden verzameld met behulp van een 25 ml serologische pipet en overgebracht in een 50 ml conische buis voor isolatie van HPMC. PBS wordt verwijderd uit de buis en HPMC worden gepelleteerd uit de PBS een 0,5 x g bij 37 ° C. (MC, mesotheelcellen, RBC, rode bloedcellen, Fib, fibroblasten) (E) NOF worden geïsoleerd uit de remaini ng omental weefsel na incubatie met hyaluronidase en collagenase type III. Het beeld toont het weefsel na een 6- tot 12-uur spijsvertering. NOF worden gepelleteerd door het draaien op 0,5 xg bij RT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Karakterisering van HPMC en NOF geïsoleerd uit menselijk weefsel omentum. Fasecontrast beelden van (A) mesotheelcellen (HPMC) en (B) fibroblasten (NOF) na isolatie uit omentum weefsel. Menselijke HPMC gekleurd voor (C) en cytokeratine 8 (E) vimentine. Human NOF gekleurd voor (F) vimentine, maar niet vlek voor (D) cytokeratine 8. Bar = 100 micrometer, geldt voor alle panelen.ftp_upload / 53.541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Eierstokkanker celadhesie de organotypische kweek is integrine-afhankelijke. (A) De hechting werd uitgevoerd met 50.000 fluorescent gelabelde eierstokkankercellen, HeyA8 cellen, zoals beschreven in het protocol. De totale fluorescentie in elk putje gerapporteerd. De controle antilichaam muis IgG. Elke staaf vertegenwoordigt het gemiddelde +/- standaardfout gemiddelde. Representatieve (B) geleidelijk contrast en (C) fluorescentiebeelden van eierstokkanker celadhesie de organotypische kweek. Bar = 100 micrometer, geldt voor beide panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Eierstokkanker celproliferatie op de organotypische kweek is integrine-afhankelijke. (A) De proliferatie-assay werd uitgevoerd met 4000 fluorescent gelabelde eierstokkankercellen, HeyA8 cellen, zoals beschreven in het protocol. Het totale aantal cellen wordt gerapporteerd. De controle antilichaam muis IgG. Elke staaf vertegenwoordigt het gemiddelde +/- standaardfout gemiddelde. Samengevoegde fase-contrast en fluorescente beelden van eierstokkanker celproliferatie op de organotypische kweek bij (B) en 24 (C) 96 hr. Bar = 100 micrometer, geldt voor beide panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
tp_upload / 53.541 / 53541fig6.jpg "/>
Figuur 6. Eierstokkanker invasie door organotypische kweek is integrine-afhankelijke. (A) De invasie werd uitgevoerd bij 40.000 fluorescent gelabelde eierstokkankercellen, HeyA8 cellen, zoals beschreven in het protocol. Het aantal binnendringende cellen (verplaatst door de 3D cultuur aan de onderkant van het inzetstuk) gerapporteerd. De controle antilichaam muis IgG. Elke staaf vertegenwoordigt het gemiddelde +/- standaardfout gemiddelde. (B) Fase-contrast en (C) fluorescerende beelden van eierstokkanker cellen die binnengevallen door de organotypische cultuur. Bar = 100 micrometer, geldt voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een organotypische model van peritoneale micro opgericht om de individuele en collectieve functie (s) van zowel de cellulaire en aangeboren bestanddelen van de micro-omgeving bij eierstokkanker verspreiding van kanker te beoordelen. De specifieke protocollen voor plateren en het aanpassen van de 3D organotypische kweek eierstokkanker celhechting, proliferatie, invasie en onderzoeken zijn aanwezig. Omental primaire humane mesotheelcellen en fibroblasten werden geïsoleerd uit patiënten die in een vroeg doorgang naar normale morfologie en variatie patiënt te behouden. In dit model werden de normale omental fibroblasten en ECM (meestal type I collageen) gelaagd met een primaire humane mesotheelcellen cel monolaag. Dit model histologisch bootst de peritoneale bekleding, en stelt ons in staat om te recreëren en te onderzoeken belangrijke gebeurtenissen bij eierstokkanker metastase waaronder eierstokkanker celadhesie, proliferatie en de invasie 8,27.
Voorheen beperkte 3D-modellenopgericht om eierstokkanker interactie met micro 13,14,21-25 ontstaat, terwijl deze 3D organotypische model is de eerste die de constructie van de mesothelial-bekleding van de buikholte opnieuw. Het menselijk omentum wordt verzameld van patiënten variërend in leeftijd en gezondheid. De gezondheid van het weefsel rechtstreeks effect op de mesotheelcellen cel en fibroblast isolatietechnieken. De gezonder weefsel wordt lichter van kleur met zeer kleine lobben (1-3 mm) in vergelijking met weefsels die meer oranje kleur met grote lobben aanwezig (> 5 mm). De meeste HPMC afwerpen in de eerste PBS en het weefsel wordt uitgevoerd van een operatie naar het laboratorium. De gezonder het weefsel echter het veerkrachtiger de HPMC moeten verwijderen, en aanvullende PBS wast en 1: 1 PBS: trypsine digestie kan resulteren in een gemengde kweek van HPMC en NOF cellen. In het gezonder weefsels kunnen sommige HPMC overleven de 6-uur collagenase verteren, en een samenvatting O / N in 1x collagenase oplossing vollediggroeimedia wordt aanbevolen om een zuivere NOF cultuur te verkrijgen. Let op de omentum moet onmiddellijk in PBS na verwijdering worden geplaatst of geen HPMCs zal worden verhaald op weefsel. Bovendien, als het weefsel wordt opgeslagen in PBS gedurende langere tijd (> 2 uur) bij kamertemperatuur of in de koelkast, het aantal levensvatbare HPMCs geïsoleerd aanzienlijk verminderd.
A 1: 5 verhouding van fibroblasten cellen mesotheelcellen uitgeplaat om de verhouding van fibroblasten nabootsen aan cellen mesotheelcellen in vivo 8. Het is belangrijk op te merken dat de grootte van geïsoleerde mesotheelcellen verschilt van patiënt tot patiënt kan aanpassing van de beplating verhouding vereist. De mesotheliale cellen van sommige patiënten zijn veel kleiner; in deze gevallen plaat we het dubbele van het aantal mesotheelcellen (20.000). Daarnaast worden de primaire cellen altijd op jonge (1-2) doorgang naar morfologie behouden. Mesotheelcelsuppletie kunnen kubisch of spichtige en kubische mesotheelcellen worden meer spichtigezij zijn gepasseerd, of met grotere blootstelling aan geconditioneerde media uit ovarium kankercellen of behandeling met TGFp 10.
Eierstokkanker cellen kunnen hechten aan en dringen door de mesenchymale mesotheelcellen efficiënter dan de epitheliale mesotheelcellen uit dezelfde of verschillende patiënten. Typisch, zetten we de organotypische cultuur gedurende 18 uur voor aanvang van de functionele testen met eierstokkanker cellen. Hoe langer de mesotheelcellen en fibroblasten worden gekweekt samen, hoe meer tijd ze moeten verschillende eiwitten zoals ECM eiwitten, die het gedrag van het ovarium kankercellen kunnen beïnvloeden afscheiden. Een andere belangrijke factor om rekening te houden bij het uitvoeren van deze testen is de differentiële proliferatiesnelheid en expressieniveau van eiwitten geassocieerd met verhoogde adhesie, invasie en / of proliferatie, waaronder integrinen, proteasen en groeifactoren, in elke kanker cellijn of primaire humane kankerceltypen.De tijd en aantal kankercellen die in elk van de functionele assays met organotypische kweek moet worden geoptimaliseerd voor elke kanker cellijn of primaire type kankercel. Bijvoorbeeld, in de beschreven adhesietest kan eierstokkanker cellen invasie van de cultuur tijdens deze periode.
Is duidelijk dat dit model organotypische niet alle componenten van de normale peritoneale micro zoals immune, endotheliale en adipocytcellen bevatten. Bovendien, het model afhankelijk van de toegankelijkheid en beschikbaarheid van primaire humane weefsels, als primaire cellen alleen gebruikt binnen de eerste drie doorgangen. Echter, het model heeft vele voordelen in het gebruik van primaire menselijke cellen en integratie van meerdere celtypen die zijn bewezen belangrijke rol in metastase. Dit model is gebruikt om genen en eiwitten in de individuele celtypen (dwz kankercellen, normale mesotheelcellen of fibroblast cellen) na onderzoekco-kweek. Vooral de rol van c-Met 28, MMP-2 9,29, E-cadherine 30, β 1 -integrin 10, p 3 -integrin 16, a- 5 -integrin 10,31 en fibronectine 10 begin metastase onderzocht. Bovendien, het model heeft het potentieel om uit te breiden tot meer celtypen, zoals het aanbrengen van adipocyten 6 omvatten. Het model is gewijzigd en geminiaturiseerd voor gebruik in high-throughput screening kleinmoleculige remmers van eierstokkanker celadhesie / invasie identificeren de peritoneale micro 27. Toekomstige toepassingen van dit model zal de opname van immuuncellen in de assay, waaronder macrofagen voor mechanistische studies en high-throughput screening. Samengevat, de organotypische celkweek levert een bruikbaar model om de interacties tussen het menselijke peritoneale micro en eierstokkankercellen evalueren met Goal van het ophelderen van belangrijke moleculaire mechanismen van verspreiding en progressie van de ziekte, en het identificeren van potentiële therapeutische targets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
