Protocol
Все протоколы исследований, описанные были рассмотрены в Чикагском университете Institutional Review Board (IRB). Информированное согласие было получено от каждого пациента до операции и исследования был одобрен в Чикагском университете IRB. Биологическая безопасность типов корпус 2 и перчатки должны быть использованы при обращении человеческую ткань для защиты и снижения риска контаминации клеток.
1. Выделение и культуры первичных стромальных клеток нетрансформированных
- Коллекция тканей человека и подготовка.
- Получение образцов человеческого сальника, 2 см 3, удалены во время операции на брюшной полости, и сразу же погружают ткань в РТ фосфатно-солевом буфере (PBS) (фиг.2А). Кусок сальника 3 см х 2 см, как правило, дает 1 млн первичных человеческих мезотелиальной клетки (ГПМЦ) и 200000 первичных фибробластов человека или нормальные фибробласты сальника (Ноф).
- Спин вниз PBS ткань погружают в 0,5 мкг на 3 длямин как можно скорее после сбора (<2 ч в PBS) и передать ткань на свежий 20 мл PBS в 50 мл коническую трубку. Нарежьте ткань в 5 мм 3 куски фарша с скальпелей в 15 см в диаметре, стерильные культуры блюдо (рис 2B).
- Первичная изоляция человека мезотелиальной клетки 8
- Для выделения НРМС, передать фарш ткани в 50 мл конические пробирки и подождите 1 мин для твердых части, чтобы плавать к вершине (рис 2С & D). ГПМЦ и эритроциты (RBC) будет присутствовать в жидкости на дне. Использование пипетки, чтобы удалить жидкость из нижней части трубы и в новую коническую трубку. Спин жидкость вниз на 0,5 мкг в течение 3 мин и аспирата супернатант от осадка ГПМЦ / RBC.
- Повторите процедуру три раза: добавить 20 мл PBS, чтобы фарш ткани, позволяют ткани, чтобы расти, удалить жидкость из нижней части с помощью пипетки и в ГПМЦ / РБК трубки, спин вниз, и снимитесупернатант. После того как все спины будут завершены, и супернатант отсасывали, а осадок содержит НРМС и RBC.
- Пластина все клетки из осадка в 75 см 2 колбу в 15 мл полной питательной среды (DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 1% MEM витаминов [93 мг / л], 1% MEM заменимых аминокислот [81,4 мг / л], 1% пенициллина стрептомицина [Pen-Strep, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина]).
- Выполните вторичную PBS мыть, чтобы изолировать дополнительные НРМС.
- Для вторичной PBS мыть, встряхнуть оставшееся твердое вещество ткани при 200 оборотах в минуту, 37 ° С в течение 10 мин в 20 мл PBS, а затем ждать 1 мин для ткани, чтобы плавать на поверхности. Удалить жидкость из нижней части трубы в новую пробирку, центрифугирование со скоростью 0,5 мкг в течение 3 мин, и аспирата супернатант.
- Пластинчатый все ГПМЦ / RBC из вторичного PBS мыть в отдельном 75 см 2 колбу в 15 мл полной питательной среды.
- Для выделения любого гemaining НРМС, встряхнуть измельченной ткани при 200 оборотах в минуту, 37 ° С градусов в течение 10 мин в 20 мл 1: 1 0,25% трипсина 25 мМ ЭДТА: Раствор PBS по объему. Дайте ткани расти, сбора жидкости на дне пробирки в новую пробирку 50 мл, и спин вниз на 0,5 GX 3 мин.
- Аспирируйте супернатант и пластины все ГПМЦ / RBC в отдельном 75 см 2 колбу в 15 мл полной питательной среды.
- Культура клеток высевали при 37 ° С и 5% СО 2 в увлажненной среде. Кормовые покрытием клетки, добавив 15 мл полной питательной среды на 3 и 5 без удаления истощенных средах. ГПМЦ может быть культивировали в течение 5-7 дней до расщепления.
- Используйте низкой проход НРМС (до прохождения 2) во всех экспериментах, чтобы минимизировать дедифференцировку и модификацию оригинальной фенотипа. Используйте широкий поля микроскопа желательно с 20-кратным объективом с пластиковой дифференциальных возможностей вмешательство контрастных или 4-20x цели с фазового контраста capabilitieS (фазового контраста фильтры на микроскопом) для принятия всех изображений клеток, и 10x объектив () в светлом поле, чтобы проанализировать иммуногистохимическое 3,3-диаминобензидина окрашивание (DAB).
- Убедитесь, что ГПМЦ являются кубический и выразить цитокератин 8 и виментин выполняя иммуногистохимии 8 (рис 3А, C, E).
- Для выделения НРМС, передать фарш ткани в 50 мл конические пробирки и подождите 1 мин для твердых части, чтобы плавать к вершине (рис 2С & D). ГПМЦ и эритроциты (RBC) будет присутствовать в жидкости на дне. Использование пипетки, чтобы удалить жидкость из нижней части трубы и в новую коническую трубку. Спин жидкость вниз на 0,5 мкг в течение 3 мин и аспирата супернатант от осадка ГПМЦ / RBC.
- Изоляция Ноф 8
- Подготовка 10 мл исходного типа раствора коллагеназы III (10x) путем объединения 1: 1: 1 смесь 100x Pen-Strep: активность 1500 единиц / мл коллагеназы типа III: Активность 714 единиц / мл гиалуронидазы в PBS.
- Встряхнуть фарш сальника ткани, которая остается после выделения НРМС при 200 оборотах в минуту, 37 ° C в течение 6 ч в 10 мл 10x коллагеназы типа решения III, разведенного в бессывороточной СМИ (DMEM с 1% MEM витаминов [93 мг / л], 1% MEM заменимых аминокислот [81,4 мг / л], 1% пенициллина стрептомицина [Pen-Strep, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина]), Расщепленную ткани будет выглядеть непрозрачным и может иметь некоторую волокнистую мусора (Рисунок 2E).
- Центрифуга раствор, содержащий клетки Ноф в виде суспензии в 0,5 мкг в течение 3 минут при комнатной температуре, аспирата супернатант и осадок пластины в 75 см 2 колбу на 13 мл полной питательной среды.
- Удалить старые средства массовой информации и заменить 15 мл свежего полной питательной среды после 24 часов. Ноф можно культивировать в течение 1-3 дней до расщепления. Примечание распространение Ноф прекратится, когда клетки достигают слияния.
- Убедитесь, что первичные фибробласты человека плоские удлиненные клетки, и выражают виментин, но не Цитокератин 8, выполнив иммуногистохимии 8 (3В, D, F). Используйте низкой проход Ноф для экспериментов (в идеале до прохождения 3), чтобы минимизировать дедифференцировку и модификация оригинального фенотипа. Используйте широкий поля микроскоп с 20-кратным объективом с пластиковых ОПК возможностей для принятия всех фазовых изображений клеток,и 10x цель в светлом поле, чтобы проанализировать окрашивание иммуногистохимическое DAB.
2. обшивки Органотипической Культура 8
- NOF Освобождение от 75 см культуральной колбы промывкой 10 мл PBS, затем 3 мл 0,25% трипсина / EDTA 25 мМ не более чем за 5 мин. Нейтрализовать трипсина, по крайней мере в 3 раза объема полной питательной среды.
- Перевести трипсином клетки в 50 мл коническую трубку и спином вниз на 0,5 GX 3 мин. Удалить супернатант и принести клетки обратно в 5 мл полной ростовой среде. Использование клеток счетчик для подсчета клеток выделяют из культуры колбы.
- Развести клетки в соответствующем объеме полной питательной среды к пластине 2000-4000 NOF на 100 мкл на черную, ясно, дном, 96-луночные планшеты. Добавить 0,5 мкг / 100 мкл крысы хвост коллагена-I в смеси клеток, прежде чем покрытие. Пусть клетки сидеть при 37 ° С в 5% СО 2 в увлажненной среде, по крайней мере 4 ч, или до тех пор, пока клеткипридерживаться поверхности пластины.
- Отпустите НРМС из колбы культуры, используя те же методы, описанные в шагах 2.1 и 2.2. Развести клетки в соответствующем количестве полной питательной среды к пластине 10000-20000 НРМС за 50 мкл на верхней части NOF уже покрытой коллагеном I в 96-луночных планшетах. Пусть клетки сидеть при 37 ° С в 5% СО 2 в увлажненной среде, по крайней мере 18 ч перед началом экспериментов.
- Культура зеленый флуоресцентный белок (GFP), -expressing HeyA8 клеток рака яичников в полном СМИ роста. HeyA8 яичников раковые клетки флуоресцентно меченных путем экспрессии лентивирусов вектора, экспрессирующего Копепод cGFP (PCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 клеток рака яичников должно быть 80-90% сплошности в день использования (логарифмической фазе роста). Отпустите клетки из культуральной пластины и рассчитывать, используя те же методы, описанные в шагах 2.1-2.2 для первичных клеток.
- Разрешить клеток рака яичников, чтобы восстановить в полном ростовой среде в течение 15-20 мин при температуре 37 ° С вконическую трубку с крышкой неплотно закрыты.
3. Адгезия Анализ 8
- После выздоровления, осаждения клеток рака яичников на спиннинг в течение 3 мин при 0,5 мкг, а затем удалить супернатант и растворить клеток в соответствующем объеме сыворотки среды для достижения концентрации 50000 клеток / 100 мкл.
- Обратить 96-луночных с / Ноф органотипических культур ГПМЦ для удаления отработавших СМИ, и добавить 100 мкл клеточной суспензии рак в бессывороточных СМИ в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 ° С в 5% СО 2 в увлажненной среде в течение 30 мин до 4 ч.
- Переверните планшет 96-а для удаления информации и неправительственных организаций прилипшие клетки. Использование многоканального пипетки на малой мощности тщательно и осторожно пипеткой 100 мкл PBS в каждую лунку, и инвертировать пластину снова. Повторите PBS мыть еще раз.
- Обратить удалить PBS и добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку. Разрешить пластина сидеть в течение 20 мип чтобы зафиксировать клетки. Через 20 мин пластину перевернули и добавить 100 мкл PBS.
- Следует отметить, что общее флуоресценции лунки могут быть представлены или количество клеток может быть определена количественно. Для количественного, первая пластина стандартная кривая эксперимент дважды с использованием HeyA8 клеток в концентрации 1 млн клеток / мл.
- Сделайте стандартную кривую летел вниз 1 млн клеток, удаляя массовой информации, и позволяет им сидеть в 1 мл 4% параформальдегида в течение 20 мин.
- Побочные клетки снова и воспитывать в 1 мл PBS (пересчет клетки подтвердить 1 млн / мл концентрации). Пластина 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000, и 0-клетки в каждую лунку в двух экземплярах, а также добавить PBS для конечного общего объема 50 мкл в каждую лунку.
- Нижняя читать культура пластину на флуоресцентной ридере (возбуждения = 488 нм, эмиссия = 528 нм), масштабирование высокие скважин (50000 на стандартной кривой). Используйте стандартную кривую для расчета, сколько клеток рака яичников, прилипших к organotypIC культуры в каждую лунку (фиг.4А-С).
4. Анализ пролиферации 10
- После клеток рака яичников восстановления (см шаги 2.5 и 2.6 выше), осаждения клеток, вращая в течение 3 мин со скоростью 0,5 мкг, а затем разбавленной клеток в соответствующем объеме 1% FBS сред (DMEM с 1% FBS, 1% MEM витамины [93 мг / л], 1% MEM заменимых аминокислот [81,4 мг / л], 1% пенициллина стрептомицина [Pen-Strep, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина]) до достижения концентрации 4000 клеток / 150 мкл.
- Обратить 96-луночного планшета с ГПМЦ / Ноф органотипических культур для удаления отработавших СМИ, и добавить 150 мкл клеточной суспензии рак в 1% FBS СМИ в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 ° С в 5% СО 2 в увлажненной среде в течение 72 ч.
- Нижняя читать культура пластину на флуоресцентной ридере один раз в день (возбуждение = 488 нм, эмиссия = 528 нм), чтобы оценить относительную пролиферациюячеек. Продолжить анализ в течение 96 ч, меняя СМИ в 48 часов (5А-C). Будьте осторожны, чтобы не нарушить культуры при изменении СМИ (обращения пластина предпочтительно).
5. Вторжение Пробирной 8
- Перед покрытие 3D-культуру, добавить 7,5 мкг крыс-хвост коллагена I в 200 мкл PBS к культуре пластины вставки 24-а (размер пор 8 мкм). Пусть пластина инкубат O / N, затем тщательно удалить PBS с пипеткой непосредственно перед гальваническое покрытие органотипической культуры ГПМЦ / Ноф на коллагеновых покрытием вставками (шаг 2 выше).
- Подготовка клеток рака яичников, как в шаге 3.1. С планшетом клеток рака яичников на органотипических культур на вставках, тщательно использовать пипетку, чтобы удалить избыток носителя из верхней части вставки. Добавить 100 мкл суспензии яичников раковых клеток в сыворотке крови без средств массовой информации в каждую лунку.
- Добавить 750 мкл полной СМИ рост в колодец ниже вставки, чтобы вызвать раковые клетки внашествия в органотипических культур. Инкубируйте планшет при 37 ° С в 5% СО 2 в увлажненной среде в течение 24 ч.
Примечание: клеток рака яичников, что проникают в органотипической культуре будет пересекать вставку и остаются на нижней стороне вставки. - После 24 часов, понять вставку с щипцами и кратко промыть его в стакан PBS, затем переместите вставку в пустую лунку. Скраб вершины каждой вставки с обеих сторон ватным тампоном в общей сложности 1 мин. Быстро разместить вставку в планшет, содержащий 750 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку. Разрешить каждая вставка сидеть в параформальдегиде в течение 10 мин перед передачей вставок в скважинах, заполненных 750 мкл PBS.
- Просмотр захваченных клеток (присоединение и крепится к нижней части вставки) с помощью микроскопа при увеличении в 2,5 раза. Когда вся хорошо в пределах поля зрения, регулировать увеличение до 10x и принять 5 фотографии, один недалеко от центра и 1 в каждом квадранте скважины, избегаяпринимать изображения, которые слишком близко к краям. Выполните ту же шаблон для каждой скважины.
- Используйте программу производителя, чтобы подсчитать количество ячеек в каждом изображении, чтобы получить среднее число клеток вторглись в поле каждую лунку (рис 6A-C) в соответствии с их протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Органотипической культура была собрана, сначала смешивая первичные фибробласты человека с коллагеном I типа, а затем наложение эту культуру с 5-кратным количеством мезотелиальных клеток. Культуру инкубировали в течение не менее 18 ч, прежде чем клеток рака яичников были добавлены для изучения адгезии, инвазии или пролиферации. Каждый анализ был повторен с несколькими (N = 3-5) 3D культуры, полученные из разных пациентов и многочисленных скважин были протестированы в каждом условии для адгезии (N = 5), пролиферации (N = 5) и инвазии анализы (N = 3) , Клеток рака яичников придерживались органотипической культуры 3D после 4 часов (рисунок 4), распространение на культуре после 72 ч (6 раз клетка удвоения времени HeyA8) (рисунок 5), и вторгся через 24 ч (рис 6). Адгезия, пролиферация и инвазия HeyA8 клеток рака яичников был интегрину-зависимыми (Рисунок 4-6). В частности, РГД пептид и блокирование Антибodies к а 5 -integrin, β 1 и α -integrin V & beta; 3 -integrin ингибирует адгезию клеток рака яичников к органотипического культуры, в то время как пептид, контрольное антитело RAD и р 4 -integrin антитела не (фиг.4) 10. В анализе пролиферации, в RGD пептида и блокирующих антител к альфа 5 - и бета 1 -integrin заторможенном пролиферации клеток яичников рак на органотипического культуры, а пептид RAD, контрольное антитело, α v & beta; 3 антител -integrin и р 4 -integrin Антитело не (фиг.5). В анализе вторжения, то РГД пептида и антитела, блокирующие к а 5 - и р 1 -integrin тормозится, в то время как α v β 3 -integrin антитела усиливается яичников вторжение раковых клеток через органотипической культуры 3D. РАУ пептид, контрольное антитело, и β4 -integrin антитела не влияют на вторжение (рисунок 6). Редко, эти анализы будут не-интерпретируемой (т.е. α 5 -integrin блокирующее антитело не ингибирует адгезию, пролиферацию или вторжение в сравнении с контрольным антителом). Ранее мы обнаружили, что некоторые культуры органотипической смоет при изменении средств массовой информации или PBS промывки в ходе теста. Кроме того, если яичников раковые клетки мертвы или не восстановился достаточно долго от трипсина переварить повторно экспресс интегрины, анализы не будут работать. Таким образом, это всегда важно иметь положительные и отрицательные контрольные в каждом анализе так что качество культуры органотипического и яичников анализа раковых клеток может быть оценена. Как здесь показано, то RGD пептида, a 5 -integrin и р 1 -integrin блокирующие антитела ингибирует адгезию всего рак яичников, рак клеток, инвазию и пролиферацию в культуре органотипического и могут быть использованы в качестве положительного Conуправления установлен в будущих анализов. Кроме того, β 4 -integrin блокирования антитела не влияет яичников адгезию клеток рака, инвазию и пролиферацию в культуре органотипического и могут быть использованы в качестве отрицательного контроля в будущих анализов.
Рисунок 1. Гистология сальника метастазов человека. Гематоксилином и эозином пятно (A) нормальная человеческая сальника (МС, мезотелиальные клетки, Фибо, фибробласты, Ади, адипоциты) и (Б) рак яичников, рак сальника метастазирования (Met, яичников метастазов рака). Бар в панели = 100 мкм в длину. (С) Схема органотипической модели 3D яичников метастазов рака яичников, имитирующей раннего метастазирования раковых клеток к поверхности человеческого сальника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше верСион этой фигуры.
Рисунок 2. Выделение первичных клеток сальника человека. (A) часть сальника собраны в операции в PBS и транспортируется в лабораторию. Ткань осаждали при 0,5 xgx 3 мин и переносили в свежую PBS. (B) часть сальника переносят в 10 см чашки Петри, промывали PBS и скальпели используются для резки сальника на мелкие кусочки (0,5 см 3 ). (CD) Куски ткани собирают с помощью 25 мл пипетки серологические и переносили в 50 мл коническую пробирку для выделения НРМС. PBS удаляется из трубки и НРМС осаждают из PBS с 0,5 мкг при 37 ° С. (MC, мезотелиальные клетки, РБК, красные кровяные клетки, Фибо, фибробласты) (Е) Ноф изолированы от remaini нг сальника ткани после инкубации с гиалуронидазы и коллагеназы типа III. Изображение показывает ткани после 6 до 12 ч пищеварения. Ноф осаждают центрифугированием при 0,5 мкг при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Характеристика ГПМЦ и NOF изолированы от человеческого сальника ткани. Фазово-контрастной изображения (а) мезотелиальных клеток (ГПМЦ) и (б) фибробластов (NOF) после выделения из сальника ткани. Человека ГПМЦ окрашивали (C) цитокератином 8 и (е) виментину. Человека NOF окрашивали на (F) виментина, но не окрашивали по (D) цитокератин 8. бар = 100 мкм, относится ко всем панелей.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. адгезии яичников раковых клеток к органотипического культуры интегрин-зависимый. (А) Адгезия анализ проводили с 50000 флуоресцентно меченных клеток рака яичников, клеток HeyA8, как описано в разделе протокола. Общее флуоресценции в каждой лунке сообщается. Контроль антитела IgG мыши. Каждый бар представляет собой среднее +/- стандартное среднее ошибке. Представитель (В) фазового контраста и (с) флуоресцентные изображения адгезии клеток рака яичников к органотипического культуры. Бар = 100 мкм, относится к обоим панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. пролиферации раковых клеток яичников на органотипического культуры интегрин-зависимый. (A) Анализ пролиферации проводили с 4000 флуоресцентно меченных клеток рака яичников, клеток HeyA8, как описано в разделе протокола. Общее количество клеток сообщается. Контроль антитела IgG мыши. Каждый бар представляет собой среднее +/- стандартное среднее ошибке. Объединенный фазового контраста и флуоресцентные изображения пролиферации клеток рака яичников на органотипической культуры в (B) 24 и (С) 96 ч. Бар = 100 мкм, относится к обоим панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
tp_upload / 53541 / 53541fig6.jpg "/>
Рисунок 6. яичников инвазию раковых через органотипического культуры интегрин-зависимый. (А) вторжение анализ проводили с 40000 флуоресцентно меченных клеток рака яичников, клеток HeyA8, как описано в разделе протокола. Количество вторжения клеток (перемещается через 3D культуры в нижней части вставки) сообщается. Контроль антитела IgG мыши. Каждый бар представляет собой среднее +/- стандартное среднее ошибке. (Б) фазового контраста и (С) флуоресцентные изображения клеток рака яичников, которые вторглись через органотипического культуры. Бар = 100 мкм, относится ко всем панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Органотипической модель перитонеального микросреды был создан для оценки индивидуальной и коллективной функции (ы) как через сотовые и врожденных компонентов микроокружения яичников распространения рака. Конкретные протоколы для гальванических и настройки органотипической культуру 3D исследовать яичников адгезии клеток рака, пролиферации и вторжение предоставляются. Первичные человеческие клетки сальника мезотелиальные и фибробласты были выделены от больных и использовать на ранних прохождения сохранить нормальную морфологию и изменения пациента. В этой модели, нормальные фибробласты и сальника ЕСМ (обычно коллагена типа I), наслаивали первичного мезотелиальной монослоя клеток человека. Эта модель имитирует гистологически брюшной подкладка, и позволяет воссоздать и изучить ключевые события в яичников метастазов рака яичников в том числе адгезии клеток рака, пролиферации и инвазии 8,27.
Ранее ограниченные 3D модели имеютбыла создана для расследования яичников взаимодействия с раком микросреды 13,14,21-25, а эта модель 3D органотипической является первым, чтобы воссоздать строительство мезотелиальных-прокладки в брюшную полость. Человека сальник собраны от пациентов различных по возрасту и здоровью. Здоровье ткани непосредственно влияет на мезотелиальной Клеточные технологии и изоляции фибробластов. Чем здоровее ткани появляется светлее с очень маленькими дольками (1-3 мм) по сравнению с тканью, которая является более оранжевый цвет с большими дольками, присутствующих (> 5 мм). Большинство НРМС сбрасывать в начальной PBS в ткань осуществляется после операции в лабораторию. Чем более здоровый ткань, тем не менее, более устойчивыми ГПМЦ являются удаления и дополнительных промывок PBS и 1: 1 PBS: трипсина дайджеста может привести к смешанной культуры ГПМЦ и NOF клеток. В здоровых тканях, некоторые НРМС может пережить 6-ч коллагеназы переваривать, и дайджест O / N в 1X решения коллагеназы в полном объемеростовую среду рекомендуется получить чистый NOF культуры. Обратите внимание, что сальник должен быть немедленно помещены в PBS при удалении или нет НРМС не будут восстановлены из ткани. Кроме того, если ткань хранится в PBS в течение длительного периода времени (> 2 ч) при комнатной температуре или в холодильнике, количество жизнеспособных НРМС изолированных значительно снижается.
А 1: 5 соотношение фибробластов Мезотелиальной клетки высевают для имитации соотношение количества фибробластов Мезотелиальной клетки в естественных 8. Важно отметить, что размер отдельных клеток мезотелиальной варьируется от пациента к пациенту, и это может потребовать корректировки в соотношении обшивки. В мезотелиальные клетки некоторых пациентов значительно меньше; в этих случаях, мы пластины двойной ряд мезотелиальных клеток (20000). Кроме того, первичные клетки всегда используются в раннем (1-2) прохода, чтобы сохранить морфологию. Мезотелиальной клетки могут быть кубовидные или веретенообразные и кубовидные мезотелиальные клетки становятся более тонкимикак они пассируют, или с большей воздействия кондиционированной среды от клеток рака яичников или лечения с TGF-beta 10.
Клеток рака яичников могут прилипать к и захватывают с помощью мезенхимных клеток мезотелиальной более эффективно, чем эпителиальных клеток мезотелиальной из той же или разных пациентов. Как правило, мы создали культуру органотипической в течение 18 часов перед началом функциональные пробы с клеток рака яичников. Чем дольше мезотелиальные клетки и фибробласты, культивируют вместе, тем больше времени они должны выделять различные белки в том числе ECM белков, которые могут повлиять на поведение клеток рака яичников. Другим важным фактором, который следует учитывать при выполнении этих анализов является скорость распространения дифференциального и уровень экспрессии белков, ассоциированных с повышенной адгезией, инвазию и / или пролиферации, в том числе интегринов, протеазы и факторы роста, в каждом раковых клеток линии или первичных человеческих типы раковых клеток.Время и количество раковых клеток использовали в каждом из функциональных анализов с органотипического культуры должен быть оптимизирован для каждого раковых клеток линии или типа первичного раковой клетки. Например, в описанном адгезии анализа, клеток рака яичников может быть вторжение в культуру в течение этого времени.
Ясно, что это Органотипической модель не содержит все компоненты нормальной брюшины микроокружения, такие как иммунной, эндотелиальных и адипоцитов клетки. Кроме того, модель зависит от доступности и наличия первичной ткани человека, как первичные элементы используются только в течение первых трех проходов. Однако модель имеет много преимуществ в использовании первичных человеческих клеток и включения нескольких типов клеток, которые были продемонстрированы играют важную роль в метастазировании. Эта модель была использована для исследования регуляции генов и белков в типах клеток от частных лиц (например, раковые клетки, нормальный Мезотелиальной или фибробластов) послесовместно культуры. В частности, роли С-Met 28, ММР-2 9,29, Е-кадгерин 30, β 1 -integrin 10, р 3 -integrin 16, А 5 -integrin 10,31, и фибронектин в начале 10 метастазов у были изучены. Кроме того, модель имеет потенциал для расширения, чтобы включить больше типов клеток, таких как включение адипоцитов 6. Модель была изменена и миниатюрных для использования в высокопроизводительного скрининга для выявления низкомолекулярные ингибиторы яичников раковых клеток адгезии / инвазии в брюшную микросреды 27. Будущие приложения этой модели будет включать в себя включение иммунных клеток в анализе, включая макрофаги для механистических исследований и высокопроизводительного скрининга. Таким образом, культура клеток Органотипической обеспечивает полезную модель для оценки взаимодействия между человеческим перитонеального микросреды и клеток рака яичников, с ПАл выяснения важных молекулярных механизмов распространения и прогрессирования заболевания, а также выявление потенциальных терапевтических мишеней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
