Protocol
Alla forskningsprotokoll som beskrivits har varit föremål för granskning av University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Informerat samtycke erhölls från varje patient före operationen och studien godkändes av University of Chicago IRB. En biologiskt säkerhetsskåp typ 2 och handskar bör användas vid hantering av mänsklig vävnad för skydd och att minska risken för kontamine celler.
1. Isolering och kultur av primära otransformerade stromaceller celler
- Human insamling och vävnad förberedelse.
- Erhålla prover av humant omentum, 2 cm 3, som avlägsnats under en bukoperation, och omedelbart doppa vävnad i RT fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (figur 2A). En bit av omentum 3 cm x 2 cm ger typiskt 1 miljon primära humana mesotelceller (HPMC) och 200.000 primära humana fibroblaster eller normala omental fibroblaster (NOF).
- Centrifugera ner PBS vävnaden nedsänktes i vid 0,5 x g under 3min så snart som möjligt efter provtagningen (<2 tim i PBS) och överför vävnaden till frisk 20 ml PBS i en 50 ml koniska rör. Skär upp vävnaden i 5mm 3 stycken genom hackning med skalpeller i en 15 cm diameter, steril odlingsskål (Figur 2B).
- Primära humana mesotelceller isolering 8
- För att isolera HPMC, överföra det malda vävnaden i 50 ml koniska rör och vänta en min för de fasta partiklar att flyta upp till toppen (figur 2C & D). HPMC och röda blodkroppar (RBC) kommer att vara närvarande i vätskan på botten. Använd en pipett för att avlägsna vätskan från botten av röret och in i ett nytt koniskt rör. Snurra vätskan ner på 0,5 xg under 3 min och aspirera supernatanten från HPMC / RBC pellets.
- Upprepa processen tre gånger: tillsätt 20 ml PBS till malet vävnaden, låt vävnaden att stiga, avlägsna vätska från botten med en pipett och in i HPMC / RBC rör, spinn ner och ta bortsupernatanten. Efter alla spins är klara och supernatanten sugs kommer pelleten innehåller HPMC och RBC.
- Plate alla celler från pelleten till en 75 cm 2 kolv i 15 ml full tillväxt media (DMEM med 10% fetalt kalvserum [FBS], 1% MEM vitaminer [93 mg / L], 1% MEM icke-essentiella aminosyror [81,4 mg / l], 1% penicillin-streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin]).
- Utför en sekundär PBS tvätt för att isolera ytterligare HPMC.
- För den sekundära PBS tvätta, skaka återstående fasta vävnaden vid 200 varv per minut, 37 ° C under 10 min i 20 ml PBS, sedan vänta en min för vävnaden att flyta upp till toppen. Avlägsna vätskan från botten av röret till ett nytt rör, centrifugera vid 0,5 x g under 3 min och aspirera supernatanten.
- Plate alla HPMC / RBC från sekundära PBS tvätta i en separat 75 cm 2-kolv i 15 ml full tillväxt media.
- För att isolera någon remaining HPMC, skaka det malda vävnaden vid 200 varv per minut, 37 ° C grader under 10 minuter i 20 ml av en 1: 1 0,25% trypsin 25 mM EDTA: PBS-lösning i volym. Låt vävnaden att stiga, samla vätskan vid botten av röret in i en ny 50 ml-rör, och spinn ner vid 0,5 gx 3 min.
- Aspirera supernatanten och plattan alla HPMC / RBC i en separat 75 cm 2-kolv i 15 ml fullständigt tillväxtmedium.
- Kultur de pläterade cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad miljö. Feed pläterade celler genom att lägga 15 ml full tillväxt media på dagarna 3 och 5 utan att ta bort de förbrukade medierna. HPMC kan odlas i 5-7 dagar före uppdelning.
- Använd låg passage HPMC (upp till passage 2) i alla experiment för att minimera dedifferentiering och modifiering av original fenotyp. Använd en brett fält mikroskop företrädesvis med en 20x objektiv med plast differentialinterferenskontrast kapacitet eller 4-20x mål med faskontrast capabilities (faskontrast filter på mikroskop) för att ta alla bilder av celler och en 10x mål () i starkt fält för att analysera immunohistokemisk 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) färgning.
- Kontrollera att HPMC är kubformig och uttrycker cytokeratin 8 och vimentin genom att utföra immunohistokemi 8 (figur 3A, C, E).
- För att isolera HPMC, överföra det malda vävnaden i 50 ml koniska rör och vänta en min för de fasta partiklar att flyta upp till toppen (figur 2C & D). HPMC och röda blodkroppar (RBC) kommer att vara närvarande i vätskan på botten. Använd en pipett för att avlägsna vätskan från botten av röret och in i ett nytt koniskt rör. Snurra vätskan ner på 0,5 xg under 3 min och aspirera supernatanten från HPMC / RBC pellets.
- NOF isolering 8
- Bered 10 ml av en lager av kollagenas typ III-lösning (10x) genom att kombinera ett 1: 1: 1 blandning av 100x Pen-Strep: 1500 enheter aktivitet / ml kollagenas typ III: 714 enheter aktivitet / ml hyaluronidas i PBS.
- Skaka det malda omentum vävnaden som finns kvar efter HPMC isolering vid 200 varv per minut, 37 ° C under 6 h i 10 ml av den 10 x kollagenas typ III lösning utspädd i serumfritt medium (DMEM med 1% MEM-vitaminer [93 mg / L], 1% MEM icke-essentiella aminosyror [81,4 mg / L], 1% penicillin streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin]). Diger vävnad ser ogenomskinlig och kan ha en viss fiber skräp (Figur 2E).
- Centrifugera lösningen innehåller NOF celler i suspension vid 0,5 xg under 3 min vid RT, aspirera supernatanten och plattan pelleten i en 75 cm 2-kolv i 13 ml fullständigt tillväxtmedium.
- Ta bort gamla medier och ersätt med 15 ml färsk full tillväxt media efter 24 timmar. NOF kan odlas under 1-3 dagar före uppdelning. Obs spridning av NOF upphör när cellerna når sammanflytning.
- Bekräfta att de primära humana fibroblaster är platta, långsträckta celler och uttrycka vimentin men inte cytokeratin 8 genom att utföra immunhistokemi 8 (figur 3B, D, F). Använd låg-passage NOF för experiment (helst före passagen 3) för att minimera dedifferentiering och modifiering av original fenotyp. Använd en brett fält mikroskop med en 20x objektiv med plast DIC kapacitet för att vidta alla fas bilder av celler,och en 10x mål i starkt fält för att analysera immunhistokemisk DAB färgning.
2. Plätering av Organotypic Kultur 8
- Släpp NOF från 75 cm odlingskolv genom att skölja med 10 ml PBS följt av 3 ml 0,25% trypsin / 25 mM EDTA under högst 5 min. Neutralisera trypsin med minst 3 gånger volymen av fullständiga tillväxtmedier.
- Överför trypsiniserade celler till en 50 ml koniska rör och spinn ner på 0.5 gx 3 min. Avlägsna supernatanten och ta celler tillbaka upp i 5 ml full tillväxt media. Använd en cellräknare för att räkna de som återvunnits från odlingskolven celler.
- Späd celler i lämplig volym av fullständiga tillväxtmedier till plattan 2,000-4,000 NOF per 100 ul på en svart, klar botten, 96-brunnar. Tillsätt 0,5 | j, g / 100 | il rått-svanskollagen I till cellblandningen innan plätering. Låt celler sitta vid 37 ° C i 5% CO2 i en fuktad miljö under åtminstone 4 h, eller tills cellernaatt ansluta sig till plåtytan.
- Släpp HPMC från odlingskolven med användning av samma metoder som beskrivs i stegen 2.1 och 2.2. Späd celler i den lämpliga mängden av fullständiga tillväxtmedier vid plattan 10,000-20,000 HPMC per 50 pl ovanpå NOF redan pläterad med kollagen I i 96-brunnsplattor. Låt cellerna sitta vid 37 ° C i 5% CO2 i en fuktad miljö under åtminstone 18 h innan experimenten.
- Kultur grönt fluorescerande protein (GFP) -uttryckande HeyA8 äggstockscancerceller i fullständigt tillväxtmedium. HeyA8 äggstockscancerceller är fluorescensmärkt genom expression av en lentivirusvektor som uttrycker copepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). HeyA8 äggstockscancerceller bör vara 80-90% konfluenta på användningsdagen (logaritmiska tillväxtfasen). Släpp celler från odlingsplattan och räkna med samma metoder som beskrivs i steg 2,1-2,2 för primära celler.
- Tillåt ovariala cancerceller att driva in hela tillväxtmedier för 15-20 minuter vid 37 ° C i enkoniska röret med locket löst förseglad.
3. Vidhäftning Assay 8
- Efter återhämtning, pellets äggstockscancerceller genom att snurra under 3 min vid 0,5 xg och sedan avlägsna supernatanten och späd cellerna i lämplig volym av serumfria medier för att uppnå en koncentration av 50.000 celler / 100 | il.
- Invertera 96-brunnars plattor med HPMC / NOF organotypiska kulturer för att avlägsna förbrukade media och tillsätt 100 pl av cancercellen suspension i serumfria medier till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i 5% CO2 i en fuktad miljö för 30 min till 4 h.
- Invertera 96-brunnar för att avlägsna media och icke vidhäftande celler. Använd en flerkanalig pipett med låg effekt att noggrant och försiktigt pipettera 100 l PBS i varje brunn, och vänd plattan igen. Upprepa PBS tvätta en gång till.
- Invertera för avlägsnande PBS och till 100 pl 4% paraformaldehyd i varje brunn. Låt plattan sitta i 20 min för att fixera cellerna. Efter 20 minuter, vänd plattan och tillsätt 100 pl PBS.
- Observera att den totala fluorescensen av brunnar kan rapporteras eller antalet celler kan kvantifieras. För kvantifiering, första plattan en standardkurva i duplikat med användning HeyA8 celler vid en koncentration av 1 miljon celler / ml.
- Gör standardkurvan genom att snurra ner 1 miljoner celler, ta bort media, och låta dem sitta i en ml 4% paraformaldehyd under 20 minuter.
- Spin celler sätta igen och upp i 1 ml PBS (Räkna celler för att bekräfta ett miljoner / ml koncentration). Plate 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000, och 0-celler i varje brunn i duplikat, och lägg till PBS för en slutlig total volym av 50 pl i varje brunn.
- Botten läsa kulturen plattan på en fluorescerande plattläsare (excitation = 488 nm, emission = 528 nm), skalning höga brunnar (50.000 på standardkurva). Använd standardkurvan för att beräkna hur många ovariala cancerceller vidhäftade till organotypic kultur i varje brunn (figur 4A-C).
4. spridning analys 10
- Efter äggstockscancerceller återhämta sig (se steg 2.5 och 2.6 ovan), pellets cellerna genom att snurra under 3 min vid 0,5 xg och sedan späda cellerna i lämplig volym av 1% FBS medium (DMEM med 1% FBS, 1% MEM vitaminer [93 mg / L], 1% MEM icke-essentiella aminosyror [81,4 mg / L], 1% penicillin-streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin]) för att uppnå en koncentration av 4000 celler / 150 ^.
- Invertera 96-brunnar med HPMC / NOF organotypiska kulturer för att avlägsna förbrukade media och tillsätt 150 | il av cancercellen suspension i en% FBS-medium till varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i 5% CO2 i en fuktad miljö för 72 timmar.
- Botten läsa odlingsplattan på en fluorescerande plattläsare en gång om dagen (excitation = 488 nm, emission = 528 nm) för att utvärdera den relativa proliferationenav celler. Fortsätt analysen för 96 timmar, ändra media vid 48 h (figur 5A-C). Var noga med att inte störa kulturen när föränderliga medie (vända plattan är att föredra).
5. Invasion analys 8
- Innan plätering 3D kulturen, tillsätt 7,5 | ig rått-svanskollagen I i 200 pl PBS till en 24-brunnars odlingsplatta insats (8 | am porstorlek). Låt plattan inkubatet O / N, sedan försiktigt bort PBS med en pipett omedelbart före plätering HPMC / NOF organotypic kultur på kollagen-belagda skär (steg 2 ovan).
- Förbered äggstockscancerceller som i steg 3.1. Till tallriken äggstockscancerceller på de organotypiska kulturer på insatserna, försiktigt använda en pipett för att avlägsna överskott media från toppen av insatserna. Tillsätt 100 ul av äggstockscancer cellsuspensionen i serumfria medier till varje brunn.
- Lägg 750 il full tillväxt medier i brunnen under insatsen att framkalla cancercell ivasion in i de organotypiska kulturerna. Inkubera plattan vid 37 ° C i 5% CO2 i en fuktad miljö för 24 timmar.
Obs: ovariala cancerceller, som invaderar organotypic kulturen kommer att korsa insatsen och stanna kvar på den nedre sidan av insatsen. - Efter 24 timmar, ta tag i insatsen med tång och kortfattat skölj den i en bägare med PBS, sedan flytta insatsen i en tom brunn. Skrubba toppen av varje skär med båda sidor av en bomullspinne för totalt 1 minut. Snabbt placera insatsen i en platta innehållande 750 pl 4% paraformaldehyd i varje brunn. Låt varje insats att sitta i paraformaldehyd under 10 minuter innan de överförs skären i brunnar fyllda med 750 pl PBS.
- Se de invaderade cellerna (vidhäftade och fixerade till botten av skären) med ett mikroskop vid 2,5x förstoring. När hela väl är inom synfältet, justera förstoringen till 10x och ta 5 bilder, en nära centrum och en i varje kvadrant av brunnen, undvikamed bilder som är för nära kanterna. Följer samma mönster för varje brunn.
- Använd tillverkarens program för att räkna antalet celler i varje bild för att få ett genomsnittligt antal celler invaderat per fält i varje brunn (Figur 6A-C) enligt deras protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den organotypiska odlings sattes ihop genom att först blanda primära humana fibroblaster med kollagen typ I och sedan överlagra denna kultur med 5 gånger antalet mesotelceller. Kulturen inkuberades under minst 18 h före ovariala cancerceller tillsattes för att studera adhesion, invasion eller proliferation. Varje analys upprepades med flera (n = 3-5) 3D kulturer erhållna från olika patienter och många brunnar testades i varje tillstånd för vidhäftningen (n = 5), proliferering (n = 5) och invasionsanalyser (n = 3) . Äggstockscancerceller anslutit sig till 3D organotypiska kultur efter 4 timmar (Figur 4), frodats på kulturen efter 72 timmar (6 gånger cellen fördubblingstiden HeyA8) (Figur 5), och invaderade efter 24 timmar (Figur 6). Vidhäftningen, proliferation och invasion av HeyA8 ovariala cancerceller var grin-beroende (figur 4-6). Närmare bestämt RGD-peptid och hindrat AntibOdies till a 5 -integrin, β 1 -integrin och α V β 3 -integrin inhiberade äggstockscancer celladhesion till organotypic kultur, medan RAD-peptiden, kontrollantikropp och Ps 4 -integrin antikropp inte gjorde det (figur 4) 10. I tillväxtanalys, RGD peptid och blockerande antikroppar till a 5 - och p 1 -integrin inhiberad äggstockscancer celltillväxt på organotypic kultur, medan RAD-peptiden, kontrollera antikropp, α v P 3 -integrin antikropp och p 4 -integrin antikropp inte (Figur 5). I invasionen analysen till RGD-peptid och blockerande antikroppar a 5 - och p 1 -integrin inhiberad, medan α v β 3 -integrin antikropp förbättrad äggstockscancer cellinvasion genom 3D organotypisk kulturen. RAD-peptid, kontrollantikropp, och β4 -integrin antikropp påverkade inte invasionen (Figur 6). Sällan kommer dessa analyser att vara un-tolkningsbar (dvs α 5 -integrin blockerande antikropp kommer inte inhibera vidhäftning, proliferation eller invasion vid jämförelse med kontrollantikroppen). Tidigare har vi funnit att vissa organotypiska kulturer kommer att tvätta bort vid byte av media eller PBS tvätt under analyserna. Dessutom, om de ovariala cancerceller är döda eller har inte återhämtat sig tillräckligt länge från trypsinet smälta att åter express integriner kommer analyserna inte att fungera. Därför är det alltid viktigt att ha en positiv och negativ kontroll i varje analys så kan bedömas kvalitet organotypic kultur och äggstockscancer cellanalys. Såsom visas här, RGD-peptid, a 5 -integrin och Ps 1 -integrin blockerande antikroppar alla inhiberade äggstockscancer celladhesion, invasion och spridning till organotypic kulturen och skulle kunna användas som positiv conkontroller i framtida analyser. Likaså β 4 -integrin blockerande antikropp påverkade inte äggstockscancer celladhesion, invasion och spridning till organotypic kulturen och skulle kunna användas som en negativ kontroll i framtida analyser.
Figur 1. Histologi av humant omental metastaser. Hematoxylin och eosin fläck av (A) normalt humant omentum (MC, mesotelceller, Fib, fibroblaster, Adi, adipocyter) och (B) äggstockscancer omental metastaser (Met, äggstockscancer metastaser). Bar i paneler = 100 um i längd. (C) Skiss över organotypiska modell av äggstockscancermetastaser härma tidig äggstockscancerceller metastaser till ytan av den mänskliga omentum 3D. Klicka här för att se en större versionsionen av denna siffra.
Figur 2. Isolering av primära humana omental celler. (A) En bit av omentum samlas vid operation i PBS och transporterades till laboratoriet. Vävnaden pelleteras vid 0,5 xgx 3 min och överfördes till färsk PBS. (B) Stycket omentum överförs till en 10 cm petriskål, tvättades med PBS, och skalpeller används för att skära omentum i små bitar (0,5 cm 3 ). (CD) Vävnaden bitar samlas in genom en 25 ml serologisk pipett och överfördes till ett 50 ml koniskt rör för isolering av HPMC. PBS avlägsnas från röret och HPMC pelleteras från PBS ett 0,5 xg vid 37 ° C. (MC, mesotelceller, RBC, röda blodkroppar, Fib, fibroblaster) (E) NOF isoleras från remaini ng omental vävnad efter inkubation med hyaluronidas och kollagenas typ III. Bilden visar vävnad efter en 6- till 12-hr digestion. NOF pelleteras genom centrifugering vid 0,5 xg vid RT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Karakterisering av HPMC och NOF isolerades från human omentum vävnad. Faskontrast bilder av (A) mesotelceller (HPMC) och fibroblaster (B) (NOF) efter isolering från omentum vävnad. Human HPMC färgas för (C) cytokeratin 8 och (E) vimentin. Human NOF färgas för (F) vimentin, men inte färgas för (D) cytokeratin 8. Bar = 100 um, gäller för alla paneler.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Ovarialcancer celladhesion till organotypic kulturen är grin-beroende. (A) Vidhäftningsanalysen utfördes med 50.000 fluorescensmärkta ovariala cancerceller, HeyA8 celler, såsom beskrivs i protokollet sektion. Den totala fluorescensen i varje brunn rapporteras. Kontrollantikroppen är mus-IgG. Varje stapel representerar medelvärdet +/- standardfelet medelvärdet. Representant (B) faskontrast och (C) fluorescerande bilder av äggstockscancer celladhesion till organotypic kultur. Bar = 100 um, gäller båda panelerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Ovarialcancer cellproliferation på organotypic kulturen är grin-beroende. (A) proliferationsanalys utfördes med 4000 fluorescensmärkta ovariala cancerceller, HeyA8 celler, såsom beskrivs i protokollet sektion. Det totala antalet celler har rapporterats. Kontrollantikroppen är mus-IgG. Varje stapel representerar medelvärdet +/- standardfelet medelvärdet. Sammanslagen faskontrast och fluorescerande bilder av äggstockscancer celltillväxt på organotypic kultur vid (B) 24 och (C) 96 tim. Bar = 100 um, gäller båda panelerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
tp_upload / 53541 / 53541fig6.jpg "/>
Figur 6. Ovarialcancer invasion genom organotypic kulturen är grin-beroende. (A) invasionsanalys utfördes med 40.000 fluorescensmärkta ovariala cancerceller, HeyA8 celler, såsom beskrivs i protokollet sektion. Antalet invaderande cellerna (förflyttas genom 3D kultur till botten av insatsen) rapporteras. Kontrollantikroppen är mus-IgG. Varje stapel representerar medelvärdet +/- standardfelet medelvärdet. (B) Fas-kontrast och (C) fluorescerande bilder av äggstockscancerceller som invaderade genom organotypic kultur. Bar = 100 um, gäller för alla paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En organotypisk modell av peritoneal mikro inrättades för att bedöma individuella och kollektiva funktion (er) av såväl de cellulära och medfödda komponenter i mikro i äggstockscancer spridning. De särskilda protokoll för plätering och anpassa 3D organotypiska kultur för att undersöka äggstockscancer celladhesion, proliferation och invasion tillhandahålls. Primära humana omental mesotelceller och fibroblaster isolerades från patienter och används på ett tidigt passage för att bevara normal morfologi och patient variation. I denna modell, normal omental fibroblaster och ECM (vanligtvis kollagen typ I) lager med en primär human mesotelcell monolager. Denna modell histologiskt efterliknar peritoneal foder, och tillåter oss att återskapa och undersöka viktiga händelser i äggstockscancermetastaser inklusive äggstockscancer celladhesion, proliferation och invasion 8,27.
Tidigare begränsade 3D-modeller haretablerats för att undersöka äggstockscancer interaktioner med mikromiljön 13,14,21-25, medan denna 3D organotypisk modell är den första att återskapa konstruktionen av mesothelial-slemhinnan i bukhålan. Den mänskliga omentum samlas in från patienter med varierande ålder och hälsa. Hälsan hos vävnaden direkt påverkar mesotelcell och fibroblast isoleringstekniker. Ju friskare vävnad visas ljusare i färgen med mycket små lobulus (1-3 mm) jämfört med vävnad som är mer orange färg med stora lobulus närvarande (> 5 mm). Majoriteten av HPMC överge i den initiala PBS som vävnaden genomföres från operation till laboratoriet. Ju friskare vävnaden, dock mer motståndskraftig HPMC är avlägsnande och ytterligare PBS tvättar och 1: 1 PBS: trypsin sammandrag kan resultera i en blandad kultur av HPMC och NOF celler. I friskare vävnader, kan vissa HPMC överleva 6-hr kollagenas smälta, och ett sammandrag O / N i 1x kollagenas lösning i sin helhetodlingsmedia rekommenderas för att få en ren NOF kultur. Notera omentum måste placeras direkt i PBS vid avlägsnande eller inga HPMC kommer att återvinnas från vävnad. Dessutom, om vävnaden lagras i PBS under en utsträckt tidsperiod (> 2 h) vid RT eller i ett kylskåp, antalet livsdugliga HPMC isolerade har minskat avsevärt.
A 1: 5 förhållande av fibroblaster att mesotelceller är guldpläterade för att efterlikna förhållandet mellan fibroblaster att mesotelceller in vivo 8. Det är viktigt att notera att storleken av isolerade mesotelceller varierar från patient till patient och detta kan kräva justering av plätering förhållandet. Mesotelcellerna vissa patienter är mycket mindre; i dessa fall, vi plattan fördubbla antalet mesotelceller (20.000). Dessutom är de primära cellerna används alltid i ett tidigt (1-2) passage för att bevara morfologi. Mesotelceller kan vara kuboidala eller spinkiga och kuboidala mesotelceller blir mer spindlysom de passe, eller med större exponering mot konditionerade media från äggstockscancerceller eller behandling med TGF 10.
Äggstockscancerceller kan ansluta sig till och invadera genom mesenkymala mesotelcellerna mer effektivt än de epiteliala mesotelcellerna från samma eller olika patienter. Typiskt, vi inrättat organotypic kultur under 18 timmar innan de funktionella analyser med äggstockscancerceller. De längre mesotelcellerna och fibroblaster odlas tillsammans, ju mer tid de har att utsöndra olika proteiner inklusive ECM-proteiner, som kan påverka beteendet hos de ovariala cancerceller. En annan viktig faktor att ta hänsyn till när man utför dessa analyser är den differentiella proliferationshastigheten och expressionsnivån av proteiner associerade med ökad vidhäftning, invasion och / eller proliferation, inbegripet integriner, proteaser och tillväxtfaktorer, i varje cancercellinje eller primära humana cancercelltyper.Tiden och antalet cancerceller som används i var och en av de funktionella analyser med organotypic kulturen måste optimeras för varje cancercelllinje eller typ av primär cancercell. Till exempel i den beskrivna vidhäftningsanalysen kunde ovariala cancercellerna vara invadera kulturen under denna tid.
Uppenbarligen innebär detta organotypisk modell inte innehåller alla komponenter i den normala peritoneal mikro såsom immun, endotel och adipocyt celler. Dessutom, modellen beror på tillgänglighet och tillgång till primär mänsklig vävnad, eftersom de primära cellerna används endast inom de tre första kanalerna. Emellertid har modellen många fördelar i användningen av primära humana celler och inkorporering av multipla celltyper som har visat sig spela viktiga roller i metastas. Denna modell har använts för att undersöka gen- och protein reglering i de typer enskilda cell (dvs cancerceller, normal mesothelial eller fibroblastceller) eftersamodling. I synnerhet rollerna som c-met 28, MMP-2 9,29, E-cadherin 30, β 1 -integrin 10, p 3 -integrin 16, a 5 -integrin 10,31, och fibronektin 10 i början av metastas har utforskats. Dessutom har modellen möjlighet att expandera till att omfatta fler celltyper, såsom införlivandet av adipocyter 6. Modellen har ändrats och miniatyriserade för användning i high-throughput screening för att identifiera små molekyler hämmare av äggstockscancer celladhesion / invasion till peritoneal mikro 27. Framtida tillämpningar av denna modell kommer att inkludera inkorporering av immunceller in i analysen, inklusive makrofager för mekanistiska studier och high-throughput screening. Sammanfattningsvis ger organotypic cellodling en användbar modell för att utvärdera samspelet mellan människans peritoneal mikro och äggstockscancerceller, med goal belysa viktiga molekylära mekanismer för spridning och sjukdomsutveckling, och identifiera potentiella terapeutiska mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
