Protocol
Tarif edilen tüm araştırma protokolleri Chicago Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi'nde (KİK) tarafından incelenmiştir. Aydınlatılmış onam ameliyattan önce her hastadan alındı ve çalışma Chicago IRB Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Korunması için insan dokusu taşıma ve hücrelerin kontamine riskini azaltmak için ne zaman bir biyolojik güvenlik kabini tip 2 ve eldiven kullanılmalıdır.
Birincil dönüştürülmemiş Stromal Hücreleri 1. İzolasyon ve Kültür
- İnsan doku toplama ve hazırlama.
- Abdominal operasyon esnasında alınan insan omentum, 2 cm3, örneklerini elde edilir ve hemen RT fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (Şekil 2A), dokuyu bırakın. X 2 cm omentum 3 cm'lik bir parçası, tipik olarak 1.000.000 birincil insan mezoteliyal hücreleri (HPMC) ve 200,000 primer insan fibroblastları ve normal omental fibroblastlar (NOF) verir.
- Doku 3 için 0.5 xg'de dalmış PBS aşağı Spindak kısa sürede sonra toplanması (<2 PBS içinde saat) ve 50 ml konik bir tüp içinde 20 ml taze PBS doku aktarın. 15 cm çapında, steril kültür çanak (Şekil 2B) neşter ile kıyma ile 5mm 3 parçaya doku yukarı kesti.
- Birincil insan mezotel hücre izolasyonu 8
- HPMC izole etmek için, 50 ml konik tüpler içine kıyılmış doku transferi ve katı parçaları üst (Şekil 2C-D) float için 1 dakika bekleyin. HPMC ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) alt kısmında sıvı içinde mevcut olacaktır. Borunun alt ve yeni bir konik tüp içine sıvının çıkması için bir pipet kullanın. 3 dakika boyunca 0.5 xg sıvıyı aşağı Spin ve HPMC / RBC pelet süpernatant aspire.
- , Kıyılmış dokuya 20 ml PBS eklemek doku, aşağı spin, yükselmeye bir pipet ile ve HPMC / RBC tüpüne alttan sıvıyı çıkarmak için izin ve kaldırın: işlemini üç kez tekrarlayınsüpernatant. Tüm spin tamamlanır ve süpernatan aspire edildikten sonra, pelet HPMC ve RBC'yi içerecektir.
- Plaka% 10 cenin sığır serumu [FBS],% 1 MEM vitamin [93 mg / L],% 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 tam büyüme ortamı, 15 ml DMEM (75 cm 2 şişe içine pelet tüm hücrelerin mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]).
- Ek HPMCs izole etmek için ikinci bir PBS yıkama yapın.
- Doku üstüne yüzen ikincil PBS yıkama için, 200 rpm'de, 20 ml PBS içinde 10 dakika süreyle 37 ° C 'de geri kalan katı doku sallayın, daha sonra 1 dakika bekleyin. 3 dakika boyunca 0,5 x g'de santrifüj, yeni bir tüp içine tüpün altındaki sıvıyı çıkarın ve süpernatan aspire.
- Tam büyüme ortamı 15 ml ayrı 75 cm 2 şişe yıkama, ikincil PBS tüm HPMC / RBC Plate.
- Herhangi r izole etmek içinhacimce PBS solüsyonu: 1,% 0.25 tripsin, 25 mM EDTA: HPMC emaining, 1, 20 ml, 10 dakika boyunca, 200 rpm'de 37 ° C derece kıyılmış doku sallayın. Doku yükselmeye tüpün alt kısmında sıvı toplamak, yeni bir 50 ml tüp içine ve 0.5 gx 3 dakika aşağı dönmesine izin verin.
- Süpernatant aspire tam büyüme ortamında 15 ml ayrı 75 cm 2 şişe tüm HPMC / RBC plaka.
- Kültür nemlendirilmiş bir ortamda 37 ° C'de ve% 5 CO2 plakalandı hücreleri. Harcanan medya çıkarmadan günlerde 3 ve 5 tam büyüme ortamı 15 ml ekleyerek Yem kaplı hücreler. HPMC bölme önce 5-7 gün süre ile kültüre edilebilir.
- Orijinal fenotip dediferansiyonunu ve modifikasyonu en aza indirmek için tüm deneylerde (geçit 2 kadar) düşük geçit HPMC'ye kullanın. Faz kontrast capabilitie plastik diferansiyel girişim kontrast yetenekleri veya 4-20x amacı ile 20x objektif ile tercihen geniş alan mikroskobu kullanıns hücrelerinin tüm görüntüleri çekmek için (mikroskop faz kontrast filtreleri) ve 3,3'-diaminobenzidin (DAB) boyama immunohistokimyasal analiz parlak alanında 10x objektif ().
- HPMC cuboidal olduğunu onaylayın ve immunohistokimyasal 8 (Şekil 3A, C, E) gerçekleştirerek sitokeratinin 8 ve vimentinin ifade eder.
- HPMC izole etmek için, 50 ml konik tüpler içine kıyılmış doku transferi ve katı parçaları üst (Şekil 2C-D) float için 1 dakika bekleyin. HPMC ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) alt kısmında sıvı içinde mevcut olacaktır. Borunun alt ve yeni bir konik tüp içine sıvının çıkması için bir pipet kullanın. 3 dakika boyunca 0.5 xg sıvıyı aşağı Spin ve HPMC / RBC pelet süpernatant aspire.
- NOF izolasyonu 8
- 1: 100 x Pen-Strep 1 karışımı bir 1: birleştirerek kollajenaz tip III çözeltisi (10 x) 'in bir stokunun 10 ml hazırlayın kollajenaz tip III 1500 ünite aktivite / ml PBS içinde hyaluronidaz 714 ünite aktivite / ml olmuştur.
- % 1 MEM vitamin [93 mg / L] ile serumsuz ortam içinde seyreltilmiş 10 kat kollajenaz tip III çözeltisi, 10 ml (DMEM 6 saat süre ile 200 rpm'de HPMC izolasyon sonra kalan kıyılmış omentum doku 37 ° C sallayın, % 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]). Sindirilmiş doku opak bakacağız ve bazı lifli enkaz (Şekil 2E) olabilir.
- Çözelti içeren NOF hücreleri Santrifüj oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 0,5 x g 'de süspansiyon halinde, süpernatan aspire tam büyüme ortamında 13 ml bir 75 cm'lik 2 şişeye pelet plaka.
- Eski ortamı çıkarın ve 24 saat sonra taze tam büyüme ortamı 15 ml ile değiştirin. NOF bölme önce 1-3 gün süre ile kültive edilebilir. Hücreler konfluense ulaştığınızda NOF notu çoğalması sona erecek.
- Birincil insan fibroblastlar, düz, uzun hücreler olduğunu onaylayın ve vimentinin ifade ama immünohistokimyasal 8 gerçekleştirerek 8 sitokeratin değil (Şekil 3B, D, F). Dediferansiyonunu en aza indirmek için (ideal geçit 3 öncesi) deneyler için düşük geçit NOF kullanın ve orijinal fenotip modifikasyonu. Hücrelerin her aşaması fotoğraf çekmek için plastik DIC yetenekleri ile 20x amacı ile geniş alan mikroskobu kullanınve parlak alanında 10x objektif immunohistokimyasal DAB boyama analiz etmek.
2. Organotipik Kültür 8 Kaplama
- En fazla 5 dakika boyunca 3 ml% 0.25 tripsin / EDTA 25 mM, ardından 10 ml PBS ile çalkalayın 75 cm kültür şişesi Yayın NOF. Tam büyüme ortamının en az 3 kez hacmi ile nötralize tripsin.
- 50 ml konik tüp içine tripsinize hücreleri aktarın ve 0.5 gx 3 dk aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve tam büyüme ortamı 5 ml kadar geri hücreleri getirmek. Kültür şişesi kurtarıldı hücreleri saymak için bir hücre sayacı kullanın.
- Bir 96-yuvalı, berrak tabanlı siyah plaka üzerine 100 ul başına 2000-4000 NOF plaka tam büyüme ortamı, uygun hacimde hücreleri ile seyreltilir. Kaplama önce hücre karışıma sıçan kuyruğu kollajen I 0.5 ug / 100 ul ekleyin. Let Hücrelerin en az 4 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de oturup, ya da hücrelerin kadarplaka yüzeyine yapışır için.
- Adımlar 2.1 ve 2.2 açıklanan aynı yöntemleri kullanarak kültür şişesi HPMC bırakın. Tam büyüme ortamının uygun miktarda hücrelerin önceden 96 oyuklu plakalar içinde kollajen I kaplama NOF üstünde 50 ul başına 10,000-20,000 HPMC plaka seyreltin. Hücreler deney başlamadan önce en az 18 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de bekletin.
- Tam büyüme ortamı HeyA8 yumurtalık kanser hücreleri -expressing Kültür yeşil flüoresan proteini (GFP). HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, floresan kopepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1) eksprese eden bir lentiviral vektör ekspresyonu ile etiketlenir. HeyA8 yumurtalık kanseri hücreleri, kullanım gününde (logaritmik büyüme fazı) üzerine% 80-90 ortak akışlı olmalıdır. Kültür hücreleri plakadan bırakın ve birincil hücreler için adımlar 2,1-2,2 açıklanan aynı yöntemleri kullanarak saymak.
- Yumurtalık kanseri hücreleri, 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca tam bir büyüme ortamı içinde kurtarmak için izin verinkapaklı konik tüp gevşek kapatılmış.
3. Yapışma Deneyi 8
- İyileştikten sonra 0,5 xg'de 3 dakika boyunca iplik ile yumurtalık kanseri hücrelerini pellet haline getirmek ve daha sonra süpernatant kaldırmak ve 50.000 hücre / 100 ul bir konsantrasyona ulaşmak için serum içermeyen ortam, uygun hacimde hücreleri seyreltin.
- Harcanan ortam kaldırmak için HPMC / NOF Organotipik kültürler ile 96 oyuklu plakalar ters çevirin, ve her bir serumsuz ortam içinde kanser hücre süspansiyonu 100 ul ilave edin. 4 saat 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
- Ortam ve yapışmayan hücreleri çıkarmak için 96 oyuklu plaka ters çevirin. Dikkatle ve yavaşça her kuyuya PBS 100 ul pipetlemeyin ve tekrar plaka ters düşük güçte bir çok kanallı pipet kullanın. PBS bir kez daha yıkayın tekrarlayın.
- PBS çıkarın ve her bir oyuğa 100 ul% 4 paraformaldehid eklemek için ters çevirin. Plaka 20 mil için bekletinn hücreleri gidermek için. 20 dakika sonra, plaka ters çevirin ve 100 ul PBS ilave edin.
- Toplam kuyu flüoresan kaydedilmemiştir veya hücre sayısı belirlenebilir unutmayın. Ölçümü için, 1.000.000 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda HeyA8 hücreleri kullanılarak, iki kopya halinde birinci plaka standart eğrisi.
- Aşağı 1 milyon hücre iplik medya kaldırarak, ve onları 20 dakika boyunca 1 ml% 4 paraformaldehid oturup izin vererek standart eğri olun.
- Spin hücreleri tekrar PBS (anlattıklarında hücreleri 1000000 / ml konsantrasyon onaylamak için) ml 1'de getirmek. Levha 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5.000, 1.000, ve de her biri çifte biçimde içine 0 hücreleri, ve her çukur 50 ul'lik bir nihai toplam hacim PBS ilave edin.
- Alt yüksek kuyu (standart eğri üzerinde 50.000) ölçekleme, bir flüoresan plaka okuyucusu (uyarım = 488 nm, emisyon = 528 nm) ile kültür plakasına okuyun. Organotyp yapıştırılır kaç yumurtalık kanseri hücrelerini hesaplamak için standart eğri kullanınHer bir oyuğa (Şekil 4A-C) 'ic kültürü.
4. Proliferasyon Deneyi 10
- Yumurtalık kanseri hücreleri, geri sonra% 1 FBS (DMEM,% 1 FBS ortamı uygun hacimde hücreleri sulandırmak sonra 0.5 x g'de 3 dakika boyunca iplik hücreleri pelet,% 1 MEM (adım 2.5 ve yukarıda belirtilen 2,6 bakınız) vitaminler [93 mg / L],% 1 MEM esansiyel olmayan amino asitler [81,4 mg / L],% 1 penisilin streptomisin [Pen-Strep, 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin]) 4.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için / 150 ul.
- Her bir oyuğa FBS ortamı harcanan ortamını çıkarın ve 1% kanser hücre süspansiyonu 150 ul eklemek için HPMC / NOF Organotipik kültürler ile 96 oyuklu plaka ters çevirin. 72 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
- Alt görece proliferasyonunu değerlendirmek için bir kez bir flüoresan plaka okuyucusu günde (uyarım = 488 nm, emisyon = 528 nm) kültür plaka okumahücre. 48 saat (Şekil 5A-C) 'de ortamının değiştirilmesi, 96 saat boyunca deney devam edin. (Plaka tercih edilir tersini) ortam değiştirirken kültürünü rahatsız etmemek için dikkatli olun.
5. Invasion Testi 8
- 3D kültür kaplama önce, 24 oyuklu bir kültür plakasına parçası (8 um gözenek boyutu) 200 ul PBS içinde 7.5 ug fare kuyruk kolajeni eklemek. Plaka inkübe O / N, daha sonra dikkatlice hemen kollajen kaplı ekler (yukarıdaki adım 2) üzerine HPMC / NOF organotipik kültürünü kaplama önce bir pipet ile PBS kaldırmak edelim.
- Adım 3.1 olarak yumurtalık kanseri hücrelerini hazırlayın. Ekler üzerinde organotipik kültürlerinin üzerine yumurtalık kanseri hücrelerini plaka dikkatle ekler üst fazla olan ortamı çıkarmak için bir pipet kullanın. Her bir oyuğa, serumsuz ortam içinde yumurtalık kanseri hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
- Kanser hücresini ikna etmek için iyi bir ekin altındaki içine tam büyüme ortamı 750 ul ekleyinorganotipik kültürlerinin içine vasion. 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir ortamda% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
Not: Organotipik kültür ekleme çapraz ve ekin alt tarafında kalacaktır istila Yumurtalık kanseri hücrelerini. - Boş kuyuya insert taşıyın, 24 saat sonra, maşa ile ekleme kavramak ve kısaca PBS beher durulayın. 1 dakikalık bir toplam pamuklu çubuk her iki yanına, her bir ek üst fýrçalayýn. Hızlı bir şekilde her bir 750 ul% 4 paraformaldehid içeren bir plaka içine ekleme yerleştirin. Her insert 750 ul PBS ile dolu kuyu içine ekler aktarmadan önce 10 dakika boyunca paraformaldehid oturup bekleyin.
- 2.5x büyütme mikroskop ile işgal hücreler (ekler dibine yapıştırılır ve sabit) görüntüleyin. Tüm kuyu görüş alanı içinde olduğu zaman, kaçınarak, 10x büyütme ayarlayın ve 5 resim, kuyunun her kadranda merkezine yakın bir ve 1 almakkenarlarına çok yakın görüntüler alarak. Her iyi için aynı desen izleyin.
- Onların protokole göre her bir kuyu (Şekil 6A-C) 'de alan başına işgal hücrelerin ortalama sayısını elde etmek için her görüntüdeki hücre sayısını saymak için üreticinin programı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organotipik kültürü ilk olarak kollajen tip I primer insan fibroblastları karıştırılması ve sonra mezotelyal hücrelerin 5 kez sayı ile bu kültürü overlaying tarafından toplandı. Yumurtalık kanseri hücreleri, yapışma, istilası veya proliferasyonunu çalışma ilave edilmeden önce, kültür en az 18 saat süreyle inkübe edildi. Her bir deney, çoklu tekrarlanmıştır (n = 5) ve istila deneyler (n = 3) (n = 3-5), farklı hastalara ve çok sayıda kuyu elde edilen 3D kültürleri yapışma her durumda test edildi (n = 5), proliferasyon . 4 saat (Şekil 4) sonra 3D Organotipik kültürü yapışık yumurtalık kanseri hücreleri, 72 saat (6 kez HeyA8 hücreli ikileme zamanı) (Şekil 5) sonra kültürü çoğaldı ve 24 saat (Şekil 6) sonra işgal etti. HeyA8 yumurtalık kanseri hücrelerinin yapışması, proliferasyon ve istila integrin bağımlı (Şekil 4-6) idi. Spesifik olarak, RGD peptid ve antib blokeAntikor (Şekil 4) 10 yoktu integrin RAD peptidi, kontrol antikor ve 4 beta ise Odies, Organotipik kültürüne yumurtalık kanseri hücre yapışmasını inhibe integrin 5 integrin, β 1 integrin ve α v p 3 a'ya. Ve Organotipik kültürü üzerinde inhibe yumurtalık kanseri hücre çoğalması integrin 1 beta, RAD peptit antikoru kontrol ederken, α antikor integrin 3 p olan ve 4 integrin beta v - proliferasyon deneyinde, RGD peptid ve 5 a karşı bloke edici antikorlar olarak Antikor (Şekil 5) vermedi. Antikor integrin α v β 3 3D Organotipik kültür yoluyla yumurtalık kanseri hücre istilasını gelişmiş iken, ve inhibe integrin 1 beta - işgali deneyinde, RGD peptid ve engelleme antikorlar 5. a için. RAD peptidi, kontrol antikoru ve β4 integrin antikoru işgali (Şekil 6) etkilememiştir. Nadiren, bu denemeler, un tarafından yorumlanabilir olacaktır (örneğin, kontrol antikor ile karşılaştırıldığında yapışma, proliferasyonu veya invazyonu inhibe olmaz bloke edici antikor integrin α 5). Daha önce, belli organotipik kültürler deneyleri sırasında ortam veya PBS yıkama değiştirilmesi üzerine yıkayacak olacağını bulduk. Yumurtalık kanseri hücreleri, ölü ya da tripsin ile yeterince uzun kurtarıldı değil varsa ek olarak, yeniden-express integrinleri sindirmek, tahliller çalışmaz. Bu nedenle, bu Organotipik kültürü ve yumurtalık kanseri hücre tahlilinde kalitesinin değerlendirilmesi böylece her deneyde pozitif ve negatif kontrol her zaman önemlidir. Burada gösterildiği gibi, RGD peptid, 5 integrin a ve organotipik kültürü antikorların her inhibe yumurtalık kanseri hücre yapışması, yayılmasını ve çoğalmasını bloke integrin 1 beta ve pozitif con olarak kullanılabilirgelecekteki deneylerde Trols. Benzer şekilde, 4 β bloke edici antikor Organotipik kültürüne yumurtalık kanseri hücre yapışma, yayılmasını ve çoğalmasını etkilemedi integrin ve gelecekteki deneyler bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir.
İnsan omentum metastazı Şekil 1. Histoloji. Hematoksilen ve (A) normal bir insan omentum (MC, mezotelyal hücreler, Fib, fibroblastlar, Adi, adiposit) ve (B) yumurtalık kanseri omental metastazı (Met, yumurtalık kanseri metastazı) eozin leke. = Panellerde uzunluğu 100 mikron Bar. İnsan omentum yüzeyine erken yumurtalık kanseri hücre metastazı taklit yumurtalık kanseri metastazı 3D organotipik modelinin (C) şematik. Ver bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sion.
Birincil insan omentum hücrelerinin Şekil 2. izolasyonu. (A) omentum bir parça PBS içinde ameliyat toplanır ve laboratuara nakledilir. Doku 0,5 xgx 3 dakika topak ve taze PBS aktarılır. (B) omentum parçası, PBS ile yıkandı, 10 cm'lik bir petri tabağına aktarılır ve neşter küçük parçalar (0.5 cm, omentum kesmek için kullanılır 3 ). (CD) Doku parçaları 25 ml'lik bir pipet kullanılarak serolojik toplandı ve HPMC izolasyonu için 50 ml konik bir tüp içine aktarılır. PBS tüp çıkarılır ve HPMC PBS 37 ° C'de 0,5 xg ile pellet haline getirilir. (MC, mezotel hücreleri, RBC, kırmızı kan hücreleri, Fib, fibroblastlar) (E) NOF remaini izole edilmiştir hiyaluronidaz ve kolajenaz tip III ile inkübasyondan sonra ng omental dokusu. Resim 6 ila 12 saat sonra, doku sindirim gösterir. NOF RT'de 0.5 xg'de iplik ile pelet. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
HPMC ve NOF Şekil 3. Karakterizasyonu İnsan omentum dokusundan izole (A). Mezotel hücreleri (HPMC) ve (B) fibroblastlar (NOF) faz-kontrast görüntüleri omentum dokusundan izole edildikten sonra. İnsan HPMC (C) sitokeratin 8 ve (E) vimentin için boyandı. İnsan NOF (F) vimentin lekeli, ama (D) sitokeratin 8. Bar = 100 um için leke yoktu, tüm paneller için geçerlidir.ftp_upload / 53541 / 53541fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Organotipik kültürüne Şekil 4. Yumurtalık kanseri hücre yapışma integrin bağlıdır. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi (A) yapışma deneyi, 50.000 floresan etiketli yumurtalık kanseri hücreleri, HeyA8 hücreleri ile gerçekleştirildi. Her oyuktaki toplam flüoresanı bildirilmektedir. Kontrol antikor fare IgG. Her çubuk ortalama +/- standart hata ortalamasını temsil etmektedir. Örnek (B) faz-kontrast ve organotipik kültürü yumurtalık kanseri hücre yapışmasının (C), floresan ve görüntüler. Bar = 100 um, her iki paneller için de geçerlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Organotipik kültürü Şekil 5. yumurtalık kanser hücresi çoğalmasını integrin bağlıdır. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi (A) 'proliferasyon deneyi, 4000 floresan etiketli yumurtalık kanseri hücreleri, HeyA8 hücreleri ile gerçekleştirildi. Toplam hücre sayısı raporlanır. Kontrol antikor fare IgG. Her çubuk ortalama +/- standart hata ortalamasını temsil etmektedir. Birleştirilmiş faz-kontrast ve (B) en Organotipik kültürü yumurtalık kanseri hücre çoğalması floresan görüntüler 24 ve (C) 96 saat. Bar = 100 um, her iki paneller için de geçerlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
tp_upload / 53541 / 53541fig6.jpg "/>
Organotipik kültür yoluyla Şekil 6. Yumurtalık kanseri istilası integrin bağlıdır. Protokol bölümünde tarif edildiği gibi (A) 'işgali tahlil, 40.000 floresan etiketli yumurtalık kanseri hücreleri, HeyA8 hücreleri ile gerçekleştirildi. (Ucun tabanına 3D kültür yoluyla taşınan) akın eden hücre sayısını rapor edilmektedir. Kontrol antikor fare IgG. Her çubuk ortalama +/- standart hata ortalamasını temsil etmektedir. (B) faz-kontrast ve (C) Organotipik kültür yoluyla işgal yumurtalık kanseri hücrelerinin floresan görüntüler. Bar = 100 um, tüm paneller için geçerlidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periton mikroçevresinin bir Organotipik modeli yumurtalık kanseri yayılmasına mikroçevresinin hücresel ve doğuştan bileşenlerin hem bireysel ve kolektif işlev (ler) değerlendirmek için kurulmuştur. Yumurtalık kanseri hücre yapışması, proliferasyon ve istila araştırmak için 3D Organotipik kültürü kaplama ve uyarlama için özel protokolleri temin edilmektedir. Primer insan omental mezotel hücreleri ve fibroblastlar hastalardan izole edilen ve normal morfoloji ve hasta varyasyonu korumak için erken bir pasajda kullanılmıştır. Bu modelde, normal bir omentum fibroblastlar ve ECM (tipik olarak kolajen tip I), bir primer insan mezotel hücre tek tabaka ile tabakalandı. Bu model histolojik periton astar taklit ve bize yeniden ve yumurtalık kanseri hücre yapışması, çoğalması ve işgali 8,27 olmak üzere yumurtalık kanseri metastazı önemli olayları incelemek için izin verir.
Daha önce, sınırlı 3D modeller varBu 3D Organotipik modeli periton boşluğu mezotelial-astarı inşaatını yeniden ilk iken, mikroçevresinin 13,14,21-25 ile yumurtalık kanseri etkileşimlerini araştırmak için kuruldu. İnsan omentum yaşına ve sağlığına değişen hastalardan tahsil edilir. Doku sağlığını doğrudan mezotel hücre ve fibroblast izolasyon teknikleri etkiler. Sağlıklı doku mevcut büyük lobüllerinden (> 5 mm) renkli fazla turuncu dokusu ile karşılaştırıldığında çok küçük lobüllerinden (1-3 mm) açık renkli görünür. Doku laboratuara cerrahiden yapılır olarak HPMC çoğunluğu ilk PBS sıyrılmış. 1 PBS: Doku sağlıklı, ancak, daha esnek bir HPMC çıkarılması, ve ek bir PBS yıkama ve 1 ila olan tripsin sindirimi HPMC ve NOF hücrelerin karışık bir kültüründe neden olabilir. Sağlıklı dokularda, bazı HPMC 6 saatlik kollajenaz sindirimi yaşayabilir ve tam 1x kollajenaz çözüm bir sindirmek O / NBüyüme ortamı saf NOF kültürünü elde etmek için tavsiye edilir. Omentum uzaklaştırılması üzerine PBS hemen yerleştirilmelidir veya HPMCs dokudan telafi edilecektir unutmayın. Doku, oda sıcaklığında ya da bir buzdolabı içinde bir süre (> 2 saat) bir süre için PBS içinde depolanırsa başka, izole edilmiş canlı HPMCs sayısı önemli ölçüde azalır.
A 1: hücreler mezotelyal fibroblastların 5 oran in vivo 8 hücreleri mezotelyal fibroblastların oranı taklit etmek için kaplanır. Bu izole mezotelyal hücrelerin boyutu hastadan hastaya değişir ve bu kaplama oranı ayarlama gerektirebilir dikkat etmek önemlidir. Bazı hastalarda mezotelial hücreler çok daha küçük; Bu durumlarda, biz mezotel hücreleri (20,000) çift sayıda plaka. Buna ek olarak, birincil hücreler her zaman morfolojisi korumak için bir erken (1-2) geçişte kullanılmaktadır. Mezotelyal hücreler kübik veya cılız ve kübik mezotel hücreleri daha cılız hale olabilirbunlar, ya TGFβ 10 yumurtalık kanseri hücreleri ya da tedaviden koşullanmış ortama daha fazla maruz olan geçişli gibidir.
Yumurtalık kanseri hücreleri uygun ve aynı ya da farklı hastalardan epitelyal mezotel hücreleri daha verimli mezenkimal mezotel hücreleri ile işgal edebilir. Tipik olarak, biz yumurtalık kanseri hücreleri fonksiyonel deneyleri başlamadan önce 18 saat Organotipik kültürü kurdu. Uzun Mezotel hücreleri ve fibroblastlar, hep beraber yumurtalık kanseri hücrelerinin davranışını etkileyebilir ECM proteinleri, dahil olmak üzere farklı proteinler salgılar zorunda daha fazla zaman kültür. Bu tahliller yapmak integrinler, proteazlar, büyüme faktörleri de dahil olmak üzere artmış yapışma, invazyon ve / veya proliferasyonu ile ilişkili proteinlerin ayırıcı proliferasyon hızı ve sentezleme seviyesi bir diğer önemli faktör, her bir kanser hücresi hattı veya birincil insan, dikkate almak kanser hücresi türleri.Organotipik kültürü ile fonksiyonel analizlerin her birinde kullanılan kanser hücrelerinin zaman ve sayısının her kanser hücresi hattı veya primer kanser hücre tipi için optimize edilmesi gerekmektedir. Örneğin, tarif edilen yapışma deneyinde, yumurtalık kanseri hücreleri, bu süre içinde kültürün işgal olabilir.
Açıktır ki, bu Organotipik modeli, tüm bu bağışıklık, endotelyal normal periton mikro ortamının bileşenleri ve adiposit hücre içermez. Birincil hücreler yalnızca ilk üç pasajlar içinde kullanılan Buna ek olarak, model, erişilebilirlik ve birincil insan dokusunun mevcudiyetine bağlıdır. Bununla birlikte, model primer insan hücreleri ve metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilen sağlık multipl hücre tipleri esas kullanımında bir çok avantajı vardır. Bu model daha sonra tek tek hücre tiplerinde gen ve protein düzenleme (örneğin, kanser hücrelerini normal mezotel veya fıbroblast hücreleri) araştırmak için kullanıldıko-kültür. Özellikle, rolleri erken metastazlarında c-Met 28, MMP-2 9,29, 5 integrin 10,31 a 3 integrin 16 p olan E-kadherin 30, β 1 integrin 10, ve fibronektin 10 sahip incelenmiştir. Buna ek olarak, model, adipositler 6 dahil edilmesi gibi daha fazla hücre tipinin, kapsayacak bir potansiyele sahiptir. Model değiştirilebilir ve periton mikro-27 yumurtalık kanseri hücre yapışma invazyon / küçük molekül inhibitörlerini tanımlamak üzere yüksek verimli tarama kullanılmak üzere minyatür edilmiştir. Bu modelin gelecek uygulamalar mekanik çalışmalar ve yüksek verimli tarama makrofajlar dahil olmak üzere, tahlil bağışık hücrelerin, eklenmesini içerir. Özet olarak, Organotipik hücre kültürü Goa insan periton mikro-ve yumurtalık kanseri, hücreler arası etkileşimleri değerlendirmek için yararlı bir model sağlaryaygınlaştırılması ve hastalığın ilerlemesi önemli moleküler mekanizmaların ve potansiyel terapötik hedefler belirlenmesi l.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation and culture of primary cells | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| Glass flask | ? | ? | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM with L-Glutamine | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamins | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nonessential amino acids | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Shaker | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Incubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator Model 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0.25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| T-75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | |
| T-175 Flasks | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipet tips | Rainin | P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Pipet tips | Corning | Filtered tips P2, P10, P20, P200 and P1000 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2. Plating 3D culture | |||
| Cell Counter | Invitrogen | Countess | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Collagen Type I (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96 well plate, clear bottom, black | BD Biosciences | 353219 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3. Adhesion assay | |||
| Multichannel pipet | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| Plate reader | Molecular Devices | Minimax | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5. Invasion assay | |||
| Cell Culture Inserts (8um, 24-well) | BD Biosciences | 353097 | |
| Cotton swabs | Q-tips | cotton swabs | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200m | |
| Cell Profiler | public domain | ||
| 24 well plate | BD Biosciences | 353047 | |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 6. Antibodies | |||
| Anti-Integrin αVβ3 Antibody, clone LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
- Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
- Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
- Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
- Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
- Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
- Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
- Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
- Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
- Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
- Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
- White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
- Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
- Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
- Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
- Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).
