Introduction
Glutamat är den huvudsakliga excitatoriska neurotransmittorn i näthinnan 1. Näthinneganglieceller (RGC), som får glutamaterg synaptisk input från bipolära celler 2, är utgångs nervceller i näthinnan som skickar visuell information till hjärnan. Fysiologiska studier visade att synaptiska excitering av RGC förmedlas postsynaptiskt av NMDA-receptorer (NMDARs) och AMPA-receptorer (AMPARs) 3,4,5. Även excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) i RGC förmedlas av AMPARs och NMDARs 3,5,6,7,8, spontana miniatyr EPSCs (mEPSCs) på RGC uppvisar endast en AMPARs-medierad komponent 4,5,9. Emellertid minskar glutamatupptaget avslöjade en NMDAR komponent i spontana EPSCs 5, vilket tyder på att NMDARs på RGC dendriter kan vara belägna utanför av excitatoriska synapser. Membranassocierade guanylat kinaser (MAGUKs) såsom PSD-95 att klusterneurotransmittorreceptorer, inklusive glutamatreceptorer och jonkanals vid synaptiska platser, även uppvisar tydliga subsynaptic uttrycksmönster 10,11,12,13,14.
Under de senaste decennierna, konfokal immunohistokemi och pre-inbäddning elektronmikroskop (EM) immunohistokemi har använts för att studera membranreceptoruttryck. Även konfokal immunfärgning avslöjar breda mönster av receptoruttryck, gör sin lägre upplösning det omöjligt att använda för att skilja subcellulär plats. Pre-inbäddning EM studier i däggdjur näthinnan visar att NMDAR subenheter finns i postsynaptiska element vid kon bipolär cell band synapser 15,16,17. Detta är i uppenbar kontrast till fysiologiska bevis. Emellertid är diffusionen av reaktionsprodukten ett välkänt artefakt i pre-inbäddning immunoperoxidas-metoden. Därför innebär detta synsätt inte brukar ge statistiskt tillförlitliga uppgifter och kan utesluta åtskillnad mellan lokalisering till synaptiska membranet kontra extrasynaptic membran 18,19,20,21. PåDäremot fysiologiska och anatomiska data överensstämmer med en synaptiska lokalisering av AMPARs på RGC 3,5,7,9,22. Sålunda är glutamatreceptorer och MAGUKs vid retinal band synaps lokaliserade inte bara för att den postsynaptiska utan även för de perisynaptic eller extrasynaptic membran fack. Dock krävs fortfarande en hög upplösning kvantitativ analys av dessa membranproteiner i en retinal band synaps.
Här har vi utvecklat en postembedding EM immunogold teknik för att undersöka subsynaptic lokalisering av NMDAR subenheter, Ampar subenheter och PSD-95 följt av att uppskatta antalet, densiteten och variationen av dessa proteiner vid synapser på råtta RGC märks med koleratoxin subenhet B (CTB) retrograda spårning metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skötsel och hantering av djur var i enlighet med NIH Djurvård och användning kommittén riktlinjer. Postnatal dag (P) 15-21 Sprague-Dawley, injicerade med 1-1,2% CTB bilateralt genom den överlägsna colliculi, hölls på en 12: 12-timmar ljus: mörker-cykel.
1. näthinnevävnad Fixering
- Montera följande material och verktyg: En dissekera mikroskop, 2 pincett med mycket fina tips, sax, cellulosafilterpapper, plastpipetten och ett objektglas.
- Söva råttan i en sluten kammare med 2,0 ml halotan (inhalationsmedel bedövningsmedel). Bestämma lämplig anesthetization av dessa metoder: brist på tillbakadragande av bakre tass efter tå nypa, eller brist på blinkreflex. Sedan decapitate omedelbart med en giljotin. Ta bort ögonen med ett par iris sax och lägg i en glasskål innehållande 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (PB) vid pH 7,4.
- Med hjälp av dissekera mikroskop bort majsea genom att skära av den främre delen av ögongloben. Ta bort linsen och glaskroppen från inre näthinnan ytan med pincett.
- Skala av sklera med de två pincett tills näthinnan är isolerad från ögonmusslan.
- Skär näthinnan omedelbart i 100 - 200 nm tjocka remsor med en rakkniv, och under förutsättning att pH-skift fixering.
- Fix retina remsor i 4% paraformaldehyd i 0,1 M PB vid pH 6,0 för 20-30 min och därefter i 4% paraformaldehyd plus 0,01% glutaraldehyd vid pH 10,5 under 10 - 20 min vid RT.
- Efter flera tvättar i PB med 0,15 mM CaCl2 (pH 7,4 vid 4 ° C), cryoprotect näthinnans remsor med glycerol (60 min vardera i 10%, 20%, 30%, då O / N i 30%) i 0,1 M PB före frysa substitution.
2. Frys substitution
OBS: Denna frysSubstitutionsMetoden ändras från en tidigare publicerade protokoll 19,20. Dessutom är det viktigt att instrumenten är mycket kallt (handskar); otherwise kan vävnaden tina delvis vid beröring med instrumenten. Alla dessa steg utförs i AFS kammaren och instrumenten aldrig tillåts att ta sig över kanten av kammaren. På samma sätt är det nödvändigt att kylningen av datorns alla kemikalier som används i AFS.
- Plunge-frysa retinala remsorna i flytande propan vid -184 ° C i en EM frysförvaring instrument (CPC). Med hjälp av en fin pensel, placera proverna på små bitar av dubbelhäftande tejp knutna till metall stubbar som går på slutet av störtar stavar (veken bort extra buffert med pensel).
- Störta stavarna i flytande propan och hålla det i ca 5 sekunder, och sedan överföra till den automatiska fryssubstitution instrument (AFS) med hjälp av en liten transportkammare som är fylld med flytande kväve (LN 2 kyls Cryo överföringsbehållaren ").
- Efter att ha placerat den frusna provet och instrument (tång och skalpell) i AFS, kyla instrument i kammaren för sigVeral minuter innan vidröra vävnaden, eller kyla dem genom att placera spetsarna på instrument under några sekunder i den lilla transportkammaren (fylld med flytande kväve (LN 2 kyls Cryo överföringsbehållare)).
- En gång i AFS, ta provet och tejpen från stubben med en fin skalpell. Håll också kvävgasflödeskontroll, TF (TF beskrivs som en "regulator kontroll för LN 2 förgasare") öppen under dessa förfaranden.
- Före att förlägga den frusna vävnaden i flat inbäddning hållare (dvs innan du installerar AFS), skär en tunn cirkel från en klar plastfolie och placera den i botten på hållaren så att linje botten av varje brunn. Detta möjliggör relativt lättare avlägsnande av polymeriserade provblocken när du är klar.
OBS: Tidigare använde vi en alternativ metod för att platta inbäddningsrestriktioner innehavare, och sysselsätter dubbla Reichert + gelatinkapslar (se Petralia och Wenthold, 1999) <sup> 20. - Använda följande automatiska sekvensen i AFS (med hjälp av instrument terminologi): T1 = -90 ° C under 32 h, S1 = temperaturökning av 4 ° C / h (11,3 h), T2 = -45 ° C under 50 h, S2 = temperaturökning med 5 ° C / h (9 tim), T3 = 0 ° C under 40 h (totalt = 142,3 h). Det kan ta 2-4 timmar att placera prov i AFS (vid -90 ° C) före start av tidsinställd sekvens.
- Doppa frysta snitt i 1,5% uranylacetat i metanol vid -90 ° C under> 32 timmar i AFS. Placera två bitar av vävnader (typiskt) i var och en av de sju brunnar i flat inbäddning aluminiumhållaren (tre passar in i AFS).
- Placera vävnaden + band i uranylacetat / metanol i brunnarna och ta bort tejpen senare, strax före början bädda medium (såsom Lowicryl HM20) infiltration, om det är för svårt att ta bort vävnad från bandet.
- Därefter höja temperaturen stegvis till -45 ° C (+ 4 ° C per timme; i den automatiska sekvensen).
- Tvätta prover tre gånger i kyld metanol, genom att använda en spetsig plastpipetten ta bort den gamla lösningen från varje platt-inbäddning hållare, och sedan med en annan standard plastpipetten att lägga till förkyld färsk metanol.
- Sedan, med hjälp av samma metod, infiltrera proverna progressivt med låg temperatur inbäddning hartser såsom inbäddningsmedium (HM20 / metanol vid 1: 1 och 2: 1, var och en under 2 timmar, följt av ren harts under 2 timmar och sedan ändra hartserna och hålla O / N).
- Ändra hartset igen nästa dag, justering av nivån av hartset för att nå precis till den övre kanten av brunnarna.
- Polymerisera proverna (-45 ° C till 0 ° C i automatisk sekvens, + 5 ° C per timme) med UV-ljus under 40 h.
- Ta sedan bort proverna från AFS. Vanligtvis sampelblock visar fortfarande några små fingrar i färg. Placera proverna nära fluorescerande ljus i den kemiska dragskåp, vid RT O / N eller längre tills de appenöra helt klar.
3. Postembedding EM immunoguld Immuncytokemi
OBS: Postembedding immunocytokemi utförs såsom beskrivs 23,24,25.
- Klipp 1 pm sektioner med ultramicrotome, fläcksektioner med 1% toluidin-blått, och undersöka dem för avsnitt orientering; orientera vävnadsblock för att uppnå den optimala tvärplan snittning.
- Skär 70 nm tjocka ultratunna sektioner med ultramicrotome och samla dem på Formvar-kol-belagda nickel slot galler.
- Tvätt galler en gång i destillerat H2O, följt av en Tris-buffrad saltlösning tre gånger (TBS, 0,05 M Tris-buffert, 0,7% NaCl, pH 7,6) tvätt.
- Inkubera galler i 20 | il droppar av 5% BSA i TBS under 30 min, och sedan i 20 | il droppar av en blandning innehållande get-anti-CTB (1: 3000) och en antikropp till en NMDAR subenhet (anti-kanin GluN2A 01:50 , GluN2B 01:30), eller en anti-kanin GluA2 / 3 (01:30)i TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) med 2% BSA och 0,02 M NaN3 O / N vid RT.
- Tvätta galler på tre separata droppar (20 | il) av TBS (pH 7,6) för 10, 10 och 20 min, följt av TBS (pH 8,2) under 5 min.
- Inkubera galler under 2 h på droppar (20 | il) av en blandning innehållande åsne-anti-kanin-IgG (1:20) som är kopplad till 10 nm guldpartiklar och åsne-anti-get-IgG (1:20) som är kopplade till 18 nm guldpartiklar i TBST (pH 8,2) med 2% BSA och 0,02 M NaN3.
- Tvätta galler i 20 | il droppar av TBS (pH 7,6) under 5, 5, och 10 minuter, därefter i ultrarent vatten och sedan torka dem.
- Kontrast galler med 5% uranylacetat och 0,3% blycitrat i destillerat H2O för åtta och fem minuter under mörka förhållanden.
- För trippelmärkningsexperiment, inkubera galler O / N vid RT med 20 l droppar av en blandning av anti-get CTB (1: 3000), anti-mus PSD-95 (1: 100) och anti-kanin GluN2A (1 : 50). inkubera sedan galler under 2 timmar på två0 | il droppar av en blandning av IgG kopplad till 18, 10, och 5 nm guldpartiklar i TBST (pH 8,2) med 2% BSA och 0,02 M NaN3. Håll samma förfaranden som dubbel märkning för tvätt och motfärgning mellan och efter antikropps inkubation.
- Kontroller utfördes i vilka de sekundära antikropparna applicerades ensamma.
- Se galler på en EM och digitalisera bilder. Process slutliga siffrorna i Adobe Photoshop 6.0 endast för ljusstyrka och kontrast om det är nödvändigt 24.
4. Kvantifiering
- Manuellt valda områden av det inre plexiformskiktet (IPL) utan hål eller sprickor på 8,000X förstoring, sedan slumpmässigt photomontage hela djup IPL på 25,000X förstoring.
- Identifiera RGC dendriter vid kon bipolära dyader när de a) innehålla den retrograd transporteras CTB signal (stora guldpartiklar), b) uppvisar väldefinierad membran, Gälspringor och postsynaptiska densiteter, c) innehåller minst två små guld delicles inom PSD, eller mer än en liten guldpartikel längs extrasynaptic plasmamembranet.
- Samla 45 - 55 RGC dendriter, baserat på ovanstående kriterier, för kvantitativ analys.
- Mäta längderna hos PSD och extrasynaptic plasmamembranet hos individuella RGC dendriter med NIH ImageJ programvara. Räkna guldpartiklar inom 10 nm av membranet som membranassocierat, baserat på en genomsnittlig tjocklek av 7-9 nm för plasmamembranet 26.
- Beräkna partikeldensitet som antalet guldpartiklar per linjär mikrometer (guld / xm). Mät avståndet mellan mitten av varje guldpartikel och mitten av PSD (för synaptisk plats) eller i utkanten av PSD (för extrasynaptic plats).
- Utföra statistiska analyser av mjukvara. Använd två-tailed t-test för att jämföra medel. Ingå signifikans när P <0,05. Om inget annat anges, rapportvärden som medelvärde ± SEM 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultat som presenteras här visar påfallande olika subsynaptic lokaliseringsmönster GLUa 2/3 och NMDARs på RGC dendriter i råtta näthinnan, såsom beskrivits tidigare 24,25. 77% av GLUa 2/3 immunogold partiklar i RGC dendritiska profiler är belägna inom PSD (Figur 1A), liknar mest centrala synapser. Emellertid var NMDARs belägna antingen synaptically eller extrasynaptically. 83% av GluN2A immunogold partiklar lokaliserade i PSD (Figur 1C, 2A, 2B), företrädesvis vid OFF synapser och guldpartiklarna var mer koncentrerad i mitten av PSD (figur 2C). I motsats härtill var en stor majoritet av partiklar märkning för GluN2B (96%) som är belägen utanför nämnda PSD (Figur 1B, 2A, 2B), fördelade i huvudsak längs den extrasynaptic plasmamembranet, med toppen partikeldensiteten vid 180 nm från kanten av den PSD (Figur 2B). I synnerhet GluN2B uppvisade en preferens för ON synapser. I en delmängd av experiment, samtidig märkning av GluN2A, PSD-95 och CTB indikerade att GluN2A och PSD-95 var samlokaliserades i PSD av AV RGC dendriter (Figur 1D), där NR2A var i den dendritiska membranet medan PSD-95 var under membranet, vilket tyder på att de är förankrade i PSD. En signifikant skillnad i guld densitet mellan perisynaptic membran och mitokondriella membranen observerades, vilket tyder på en särskild märkning i fd (figur 2D).
Figur 1. immunogold Märkning Visar Synaptic och Perisynaptic Lokalisering av glutamatreceptorer på RGC Dendrites Märkt av CTB. (A): double immunogold märkning av GluA2 / 3 (10 nm guld) och CTB (18 nm guld). Presynaptiska band indikeras av pilspetsar. liten gold partiklar är grupperade (pilen) i PSD av RGC processer. (B) dubbel immunogold märkning av GluN2B (10 nm guld) och CTB (18 nm guld); små guldpartiklar (pil) är på extrasynaptic plasmamembranet. (C) dubbel immunogold märkning av GluN2A (10 nm guld) och CTB (18 nm guld). I likhet med GluA2 / 3, är små partiklar samlade i PSD. (D) Triple immunogold märkning av GluN2A (5 nm guld), PSD-95 (10 nm guld) och CTB (18 nm guld). GluN2A guldpartiklar (små pilar) och PSD-95 guldpartiklar (stora pilar) är samlokaliserade i PSD på individuella CTB-positiva RGC dendriter. Infällt: högre förstoring av PSD. Skalstreck: 0,1 ^ m (A = C = D, B). Dessa är nya mikrofotografier baserade på data som publicerats i Zhang och Diamond 24,25. Klicka här för att tävlawa större version av denna siffra.
Figur 2. Kvantitativ Jämförelse av NMDAR Lokalisering i RGC dendriter. (A) Ett histogram som visar den tangentiella fördelningen av immunogold för GluN2A (n = 53 profiler) och GluN2B (n = 56 profiler) inom och utanför PSD. Den perisynaptic regionen delades in i 60 nm fack. (B) Ett histogram visar märkning densitet immunogold partiklar för GluN2A (n = 53 profiler) och GluN2B (n = 56 profiler). Den perisynaptic regionen delades in i 180 nm fack från kanten av PSD. (C) ett histogram som visar den tangentiella fördelningen av det totala antalet immunogold partiklar för GluN2A (n = 44 profiler) och GluN2B (n = 3 profiler) på alla profiler med märkning i PSD. (D) Jämförelse av partikeldensitet avimmunogold partiklar för GluN2B (n = 53 och 33 profiler) och GluN2A (n = 9 och 30) i perisynaptic membran och mitokondriemembranet, respektive, i CTB-positiva RGC processer. Dessa histogram ändras från histogram som publicerats i Zhang och Diamond 24,25. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit fyra tekniker för framgångsrik kvantitativ efter inbäddning immunogold EM: 1) kort och svag fixering, 2) frys substitution, 3) efter inbäddning immunogold färgning och 4) kvantifiering.
EM immunoguld medger detektion av specifika proteiner i ultratunna vävnadssnitt. Antikroppar märkta med guldpartiklar kan direkt visualiseras med EM. Medan kraftfulla i att detektera subsynaptic lokaliseringen av en membranreceptor, kan EM immunogold vara tekniskt utmanande och kräver rigorös optimering av vävnadsfixering och bearbetningsmetoder.
Att hitta en optimal balans mellan membran integritet och antigenicitet, vi testade olika fixeringsmetoder och tider. Till exempel, ett framgångsrikt protokoll som används för postembedding EM NMDAR vid centrala synapser 19,20 misslyckats med att upptäcka NMDAR immunoreaktivitet i näthinnan. Denna studie användes mild fixering och korta inkubationstider tillundvika minskning av NMDA-receptor antigenicitet efter stark, långvarig fixering 16.
Fryssubstitutionsmetoden utvecklades först för ultra lokalisering av glutamatreceptorer i början av 1990-talet 27, och innebär infiltration och polymerisation vid låg temperatur i en icke-polär, hydrofob harts, HM20 28, som behövs för optimal postembedding immunogold märkning. Den specifika fryssubstitution metod som används här var utvecklad för märkning glutamatreceptorer i snäckan 29 och optimerad för glutamatreceptorer i centrala synapser 18,19,20,30, och det har modifierats ytterligare under de senaste åren. Den infiltration låg temperatur och polymerisation av hartset hjälper till att bevara antigenicitet av värmekänsliga molekyler och minimerar lipidextraktion och ogynnsamma kemiska reaktioner mellan harts och vävnads 19,31. Kombinerat med fixerings metoder som beskrivs ovan, denna fryssubstitutionsmetoden provides bra antigenicitet och rimlig strukturell bevarande.
Den postembedding immunogold teknik som används här har flera fördelar jämfört med den preembedding immunoperoxidas metoden. Även om preembedding immunoperoxidas metoden har högre känslighet 15,16,17,19,20,21, är diffusion av reaktionsprodukt oundviklig, vilket resulterar i ospecifik märkning 26,32. Dessutom är peroxidasenzymet reaktionen inte linjär 21, vilket gör det svårt att utvärdera kvantitativt den exakta subsynaptic lokalisering av receptorer 18,21. Den postembedding immunogold metod utnyttjar ett icke-diffunderbart markör och utför immunoreaktionen på ytan av hartsinbäddade vävnaden, vilket minskar diffunderbara artefakter och medger högre spatial upplösning 18,33,34. Guldpartiklar kan direkt räknas för övrigt gör det möjligt att uppskatta antalet, densiteten och variationen av dessa receptorer vid retinal band syn-apses. Dessutom postembedding immunogold möjliggör lokalisering av flera receptorer samtidigt undersökas på EM-nivå. Detta protokoll har använts med framgång i att identifiera lokalisering av andra membranproteiner (t ex., GABA-receptorer och kalciumaktiverade kalium [BK] kanaler) i retinal stav bipolära synapser 35.
Flera faktorer är avgörande för att lyckas med detta protokoll. Först, snabb och skonsam fixering är det första viktiga steget för att bevara antigenicitet och fin struktur. För det andra är fördelaktigt för optimal detektion av antigena epitoper och bra ultra bevarande 36 "pH-shift" protokoll för fixering. Tredje, fryssubstitution bevarar antigeniciteten av receptorerna, under bibehållande av rimliga finstruktur. Fjärde, under immunogold färgning, TBST-buffert (med Triton X-100) används med antikropp inkubation, medan TBS-buffert (utan Triton X-100) användsför tvättning mellan och efter inkubering av antikroppar; Detta kan minimera förändringar i fin struktur. Femte, under utbyte av lösningar är sektioner hålls våt att minska artefakter som orsakas av vävnadstorkning.
Medan postembedding immunoguld Protokollet som beskrivs här tillhandahåller en förbättrad metod för att identifiera membranreceptorer på näthinnans band Synapse, är det inte riktigt lika känsliga som preembedding immunohistokemiska metoder; men den senare är inte ett bra alternativ eftersom de lider av relativt lägre specificitet och är mindre mottagliga för kvantifiering som nämnts ovan. Vår protokoll äventyrar också bra struktur i viss utsträckning, jämfört med starkare fast vävnad inte förberedda för immunmärkningen. Förhoppningsvis kommer framtida innovationer övervinna dessa begränsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Intramural Program för National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (NINDS) och National Institute on Dövhet och andra kommunikationsstörningar (NIDCD), av National Institutes of Health (NIH). Vi tackar NINDS EM anläggningen och NIDCD avancerad bildbehandling kärna (kod # Zic DC 000.081 till 03) för att få hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
- Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
- Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
- Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
- Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
- Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
- Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
- Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
- Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
- Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
- Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
- Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
- Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
- Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
- Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
- Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
- Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
- Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
- Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
- Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
- Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
- Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
- Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).
