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Neuroscience

उच्च संकल्प मात्रात्मक immunogold झिल्ली रिसेप्टर्स के रेटिना रिबन synapses पर विश्लेषण

Published: February 18, 2016 doi: 10.3791/53547
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

Introduction

ग्लूटामेट रेटिना 1 में प्रमुख उत्तेजक neurotransmitter है। रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs), द्विध्रुवी कोशिकाओं 2 से ग्लूटामेटरगिक synaptic इनपुट प्राप्त करने, रेटिना के उत्पादन न्यूरॉन्स कि मस्तिष्क के लिए दृश्य जानकारी भेज रहे हैं। शारीरिक अध्ययन से पता चला है कि RGCs के synaptic उत्तेजना NMDA रिसेप्टर्स (NMDARs) और AMPA रिसेप्टर्स (AMPARs) 3,4,5 द्वारा postsynaptically मध्यस्थता है। हालांकि RGCs में उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं (EPSCs) AMPARs और NMDARs द्वारा मध्यस्थता कर रहे 3,5,6,7,8, सहज लघु EPSCs (mEPSCs) पर RGCs केवल एक AMPARs की मध्यस्थता घटक 4,5,9 दिखा रहे हैं। हालांकि, ग्लूटामेट तेज को कम करने सहज EPSCs 5 में एक NMDAR घटक का पता चला है, सुझाव है कि RGC dendrites पर NMDARs उत्तेजक synapses के बाहर स्थित किया जा सकता है। झिल्ली जुड़े guanylate kinases (MAGUKs) ऐसे PSD-95 के रूप में है कि क्लस्टर न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स, ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और आयन चैनल सहितsynaptic स्थलों पर एस, यह भी अलग sub अन्तर्ग्रथनी अभिव्यक्ति पैटर्न 10,11,12,13,14 दिखा रहे हैं।

हाल के दशकों, confocal immunohistochemistry और पूर्व embedding इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) immunohistochemistry ओवर झिल्ली रिसेप्टर अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि confocal immunostaining रिसेप्टर अभिव्यक्ति की व्यापक पैटर्न का पता चलता है, इसकी कम संकल्प यह असंभव subcellular स्थान भेद करने के लिए उपयोग करने के लिए बनाता है। स्तनधारी रेटिना में प्री-embedding ईएम अध्ययन से संकेत मिलता है कि सब यूनिटों NMDAR शंकु द्विध्रुवी सेल रिबन synapses 15,16,17 पर पोस्टअन्तर्ग्रथनी तत्वों में मौजूद हैं। यह शारीरिक सबूत के लिए स्पष्ट विपरीत है। हालांकि, प्रतिक्रिया उत्पाद का प्रसार पूर्व embedding immunoperoxidase विधि में एक जाने-माने विरूपण साक्ष्य है। इसलिए, इस दृष्टिकोण आमतौर पर सांख्यिकीय रूप से विश्वसनीय आंकड़े नहीं दे करता है और बनाम extrasynaptic झिल्ली 18,19,20,21 synaptic झिल्ली को स्थानीयकरण के बीच भेद बाहर कर सकते हैं। परदूसरी ओर, शारीरिक और शारीरिक डेटा RGCs 3,5,7,9,22 पर AMPARs की एक synaptic स्थानीयकरण के साथ संगत कर रहे हैं। इस प्रकार, ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और MAGUKs रेटिना रिबन अन्तर्ग्रथन पर न केवल पोस्टअन्तर्ग्रथनी करने पर भी perisynaptic या extrasynaptic झिल्ली डिब्बों को स्थानीय कर रहे हैं। हालांकि, एक रेटिना रिबन अन्तर्ग्रथन में इन झिल्ली प्रोटीन की एक उच्च संकल्प मात्रात्मक विश्लेषण अभी भी जरूरत है।

यहाँ, हम (CTB) NMDAR सब यूनिटों, Ampar सब यूनिटों और PSD-95 चूहे RGCs पर synapses पर नंबर, घनत्व और इन प्रोटीनों की परिवर्तनशीलता का आकलन करने के बाद की sub अन्तर्ग्रथनी स्थानीयकरण की जांच करने का उपयोग लेबल हैजा विष सबयूनिट बी एक postembedding ईएम immunogold तकनीक विकसित प्रतिगामी ट्रेसिंग तरीकों।

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Protocol

देखभाल और जानवरों की हैंडलिंग एनआईएच पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार थे। 12 घंटे की प्रकाश: प्रसव के बाद दिन (पी) 15-21 Sprague-Dawley चूहों, द्विपक्षीय बेहतर colliculus के माध्यम से 1-1.2% CTB इंजेक्शन के साथ, एक 12 पर बनाए रखा गया अंधेरे चक्र।

1. रेटिना ऊतक निर्धारण

  1. एक विदारक माइक्रोस्कोप, बहुत अच्छा सुझाव, कैंची, सेल्यूलोज फिल्टर पेपर, प्लास्टिक पिपेट और एक खुर्दबीन स्लाइड के साथ 2 संदंश: निम्नलिखित सामग्री और उपकरण इकट्ठा।
  2. 2.0 मिलीलीटर halothane (एक inhalant संवेदनाहारी) के साथ एक बंद कक्ष में चूहे anesthetize। पैर की अंगुली चुटकी, या झपकी पलटा की कमी के बाद पीछे पंजा की वापसी की कमी: इन तरीकों से पर्याप्त anesthetization निर्धारित करते हैं। फिर एक गिलोटिन के साथ तुरंत सिर काटना। एक गिलास पीएच 7.4 से 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पंजाब) में 4% paraformaldehyde युक्त डिश में आईरिस कैंची की एक जोड़ी और जगह के साथ आँखें निकाल दें।
  3. विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, मक्का को दूरनेत्रगोलक के सामने काटने से ईए। संदंश के साथ भीतरी सतह से रेटिना लेंस और शीशे निकालें।
  4. दो संदंश के साथ श्वेतपटल छील जब तक रेटिना eyecup से अलग है।
  5. एक रेजर के साथ 200 माइक्रोन मोटी स्ट्रिप्स, और पीएच पारी निर्धारण करने के लिए विषय - 100 में तुरंत रेटिना कट।
  6. आरटी पर 20 मिनट - 10 के लिए 10.5 पीएच पर 30 मिनट के लिए और फिर में 4% paraformaldehyde प्लस 0.01% glutaraldehyde - 20 के लिए 6.0 पीएच 0.1 एम पंजाब में 4% paraformaldehyde में रेटिना स्ट्रिप्स को ठीक करें।
  7. (4 डिग्री सेल्सियस पर 7.4 पीएच) 0.15 मिमी 2 CaCl के साथ पंजाब में कई washes के बाद, ग्लिसरॉल के साथ रेटिना स्ट्रिप्स (प्रत्येक 10%, 20%, 30%, 60 मिनट तो हे / 30% में एन) cryoprotect 0.1 एम पंजाब प्रतिस्थापन फ्रीज करने के लिए पहले।

2. रुक प्रतिस्थापन

नोट: यह फ्रीज प्रतिस्थापन विधि एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 19,20 से संशोधित किया गया है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि उपकरणों बहुत ठंड (दस्ताने पहनते हैं) कर रहे हैं; ओtherwise, ऊतक आंशिक रूप से जब उपकरणों के साथ छुआ गल सकती है। इन सभी चरणों के एएफएस कक्ष के भीतर काम कर रहे हैं और उपकरणों चैम्बर के रिम से ऊपर ले जाने की अनुमति नहीं कर रहे हैं। इसी तरह, एएफएस में इस्तेमाल सभी रसायनों के उचित ठंडा आवश्यक है।

  1. डुबकी-फ्रीज एक ईएम cryopreservation साधन (सीपीसी) में -+१८४ डिग्री सेल्सियस पर तरल प्रोपेन में रेटिना स्ट्रिप्स। एक ठीक ब्रश का प्रयोग, धातु स्टब्स कि जल्दी से आगे बढ़नेवाला छड़ के अंत पर जाने के लिए संलग्न डबल स्टिक टेप के छोटे टुकड़े पर नमूने जगह (ब्रश का उपयोग अतिरिक्त बफर बाती)।
  2. तरल प्रोपेन में उतर रही है और छड़ के बारे में 5 सेकंड के लिए वहाँ रखने के लिए, और उसके बाद स्वत: फ्रीज प्रतिस्थापन साधन (एएफएस) एक छोटे से परिवहन चैम्बर तरल नाइट्रोजन से भर जाता है कि प्रयोग के लिए स्थानांतरण ( 'एल.एन. 2 ठंडा क्रायो हस्तांतरण कंटेनर')।
  3. एएफएस में जमे हुए नमूना और उपकरणों (संदंश और छुरी) रखने के बाद, एसई के लिए चैम्बर में उपकरणों शांतveral मिनट ऊतक स्पर्श, या उन्हें छोटे परिवहन के चेंबर में कुछ सेकंड के लिए उपकरणों के सुझावों रखकर शांत होने से पहले (तरल नाइट्रोजन से भर ( 'एल.एन. 2 ठंडा क्रायो हस्तांतरण कंटेनर'))।
  4. एएफएस में एक बार, एक ठीक छुरी का उपयोग कर ठूंठ से नमूना और टेप निकालें। इसके अलावा, नाइट्रोजन गैस के प्रवाह पर नियंत्रण रखने के लिए, टीएफ इन प्रक्रियाओं के दौरान खुला (टीएफ एक 'एल.एन. 2 vaporiser के लिए नियामक नियंत्रण' के रूप में वर्णित किया जाता है)।
  5. फ्लैट embedding धारकों में जमे हुए ऊतक रखने (यानी, एएफएस स्थापित करने से पहले) से पहले, एक स्पष्ट प्लास्टिक शीट से एक पतली सर्कल में कटौती और धारक के तल में जगह इतनी के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे लाइन के लिए। इस polymerized नमूना ब्लॉक के अपेक्षाकृत आसान हटाने जब समाप्त अनुमति देता है।
    नोट: इससे पहले, हम फ्लैट एम्बेडिंग धारकों के लिए एक वैकल्पिक विधि का इस्तेमाल किया, और डबल रीचर्ट + जिलेटिन कैप्सूल (Petralia और Wenthold, 1999 देखें) रोजगार <sup> 20।
  6. 50 घंटा, S2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस / घंटा (11.3 मानव संसाधन), टी 2 से 32 घंटा, एस 1 = वृद्धि तापमान के लिए टी 1 = -90 डिग्री सेल्सियस = -45 डिग्री सेल्सियस: एएफएस (साधन शब्दावली का उपयोग) में निम्नलिखित स्वत: अनुक्रम का प्रयोग करें = 5 डिग्री सेल्सियस / घंटा (9 घंटा), T3 = 0 ° 40 घंटा (कुल = 142.3 मानव संसाधन) के लिए सी से वृद्धि तापमान। 4 घंटा समय अनुक्रम शुरू करने से पहले (-90 डिग्री सेल्सियस) एएफएस में नमूने के लिए जगह - यह 2 लग सकता है।
  7. एएफएस में> 32 घंटे के लिए -90 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में 1.5% uranyl एसीटेट में जमे हुए वर्गों को विसर्जित कर दिया। ऊतकों (आमतौर पर) फ्लैट embedding एल्यूमीनियम धारक में सात कुओं में से प्रत्येक में के दो टुकड़े प्लेस (तीन एएफएस में फिट)।
    1. ऊतक + कुओं में uranyl एसीटेट / मेथनॉल में टेप की जगह और बाद में टेप को हटा दें, सिर्फ शुरुआत embedding मध्यम (जैसे Lowicryl HM20 के रूप में) घुसपैठ करने से पहले अगर यह टेप से ऊतकों को हटाने के लिए भी मुश्किल है।
  8. फिर तापमान में वृद्धि चरणबद्ध -45 डिग्री सेल्सियस (+ 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रति घंटा; स्वत: अनुक्रम में)।
  9. नमूने एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक फ्लैट धारक embedding से पुराने समाधान निकालने के लिए, और फिर precooled ताजा मेथनॉल जोड़ने के लिए एक और मानक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके, precooled मेथनॉल में तीन बार धोएं।
  10. 1 और 2: फिर, एक ही विधि का उपयोग, नमूने उत्तरोत्तर ऐसे में 1 मध्यम (HM20 / मेथनॉल embedding के रूप में कम तापमान embedding रेजिन के साथ घुसपैठ 2 घंटे के लिए 1, प्रत्येक 2 घंटे के लिए शुद्ध राल द्वारा पीछा किया और फिर बदल रेजिन और रख हे / एन)।
  11. राल अगले दिन फिर से बदलने के लिए, बस के कुओं के शीर्ष किनारे करने के लिए तक पहुँचने के लिए राल के स्तर का समायोजन।
  12. नमूने भाजन (-45 डिग्री सेल्सियस स्वत: अनुक्रम में 0 डिग्री सेल्सियस, मानव संसाधन प्रति + 5 डिग्री सेल्सियस) 40 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के साथ।
  13. तब एएफएस से नमूने को हटा दें। आमतौर पर, नमूना ब्लॉकों अभी भी रंग में कुछ गुलाबीपन दिखा। रासायनिक धूआं हुड में फ्लोरोसेंट प्रकाश के करीब नमूने, आरटी हे पर जगह / एन या उससे अधिक समय तक वे एप्लिकेशनकान पूरी तरह से साफ है।

3. Postembedding ईएम immunogold Immunocytochemistry

नोट: Postembedding immunocytochemistry के रूप में वर्णित 23,24,25 किया जाता है।

  1. 1% toluidine-नीले रंग के साथ ultramicrotome साथ 1 माइक्रोन वर्गों, दाग वर्गों में कटौती, और इस खंड उन्मुखीकरण के लिए उन्हें जांच; ऊतक ब्लॉक उन्मुख सेक्शनिंग का इष्टतम अनुप्रस्थ विमान प्राप्त करने के लिए।
  2. ultramicrotome के साथ 70 एनएम मोटी ultrathin वर्गों में कटौती और formvar कार्बन लेपित निकल स्लॉट ग्रिड पर उन्हें इकट्ठा।
  3. धो एक Tris बफर खारा तीन बार (टीबीएस, 0.05 एम Tris बफर, 0.7% सोडियम क्लोराइड, पीएच 7.6) धोने के द्वारा पीछा आसुत एच 2 ओ में एक बार ग्रिड।
  4. और एक NMDAR सबयूनिट (विरोधी खरगोश GluN2A 01:50 के लिए एक एंटीबॉडी: युक्त बकरी विरोधी CTB एक मिश्रण के 20 μl बूँदें (3000 1) में 30 मिनट के लिए टीबीएस में 5% BSA के 20 μl बूंदों में ग्रिड सेते हैं, और उसके बाद , GluN2B 1:30), या एक विरोधी खरगोश GluA2 / 3 (1:30)2% BSA के साथ टीबीएस ट्राइटन (TBST, 0.01% ट्राइटन X-100, पीएच 7.6) और 0.02 एम नेन में 3 हे / आरटी पर एन।
  5. 10 के लिए टीबीएस के तीन अलग-अलग बूँदें (20 μl) (पीएच 7.6), 10, और 20 मिनट पर धो ग्रिड, टीबीएस 5 मिनट के लिए (8.2 पीएच) द्वारा पीछा किया।
  6. गधा विरोधी खरगोश आईजीजी (1:20) 10 एनएम सोने के कणों और गधा विरोधी बकरी आईजीजी (1:20) TBST में 18 एनएम सोने के कणों के लिए युग्मित करने के लिए मिलकर युक्त एक मिश्रण की बूंदों पर 2 घंटा (20 μl) के लिए ग्रिड सेते (8.2 पीएच) 2% BSA और 0.02 एम NaN 3 के साथ।
  7. ग्रिड, तो ultrapure पानी में 5, 5, और 10 मिनट के लिए (7.6 पीएच) टीबीएस के 20 μl बूंदों में धो लें और फिर उन्हें सूखी।
  8. अंधेरे की शर्तों के तहत 8 और 5 मिनट के लिए क्रमश: आसुत एच 2 ओ में 5% uranyl एसीटेट और 0.3% की बढ़त के साथ साइट्रेट Counterstain ग्रिड।
  9. ट्रिपल लेबलिंग प्रयोगों के लिए, ग्रिड सेते हे / एन आरटी पर विरोधी बकरी CTB का एक मिश्रण के 20 μl बूँदें (1: 3,000) के साथ, विरोधी माउस PSD-95 (1: 100), और विरोधी खरगोश GluN2A (1 : 50)। फिर 2 पर 2 घंटे के लिए ग्रिड सेतेएक IgGs की TBST में 18, 10, और 5 एनएम सोने के कणों के लिए युग्मित (पीएच 8.2) 2% BSA और 0.02 एम NaN 3 के साथ मिश्रण के 0 μl बूँदें। धोने के लिए और के बीच और एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद counterstaining डबल लेबलिंग के रूप में एक ही प्रक्रियाओं रखें।
  10. नियंत्रण प्रदर्शन किया गया, जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी अकेले लागू किया गया।
  11. एक ईएम पर ग्रिड और छवियों डिजिटलीकरण देखें। केवल चमक और विपरीत के लिए एडोब फोटोशॉप 6.0 में अंतिम आंकड़े प्रक्रिया है अगर यह आवश्यक है 24।

4. मात्रा

  1. मैन्युअल भीतरी परत उलझन (आईपीएल) के छेद या 8,000X बढ़ाई दरारें बिना के चुनिंदा क्षेत्रों, तो बेतरतीब ढंग से 25,000X बढ़ाई आईपीएल की पूरी गहराई photomontage।
  2. कोन द्विध्रुवी dyads पर RGC डेन्ड्राइट पहचानें, जब वे एक) प्रतिगमनपूर्वक जाया CTB संकेत (बड़े सोने के कणों) होते हैं, ख) प्रदर्शनी अच्छी तरह से परिभाषित झिल्ली, clefts, और पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व, ग) में कम से कम दो छोटे सोने हिस्सा शामिलPSD के भीतर icles, या extrasynaptic प्लाज्मा झिल्ली के साथ एक से अधिक छोटे से सोने के कण।
  3. उपरोक्त मानदंडों, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आधार पर 55 RGC डेन्ड्राइट, - 45 लीजिए।
  4. PSD और एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ अलग-अलग RGC dendrites के extrasynaptic प्लाज्मा झिल्ली की लंबाई मापने। के रूप में झिल्ली के 10 एनएम के भीतर सोने के कणों गणना झिल्ली जुड़े, 7 के एक औसत मोटाई के आधार पर - प्लाज्मा झिल्ली 26 के लिए 9 एनएम।
  5. रेखीय माइक्रोमीटर (सोना / माइक्रोन) प्रति सोने के कणों की संख्या के रूप कण घनत्व की गणना। प्रत्येक सोने के कण के केंद्र और PSD के बीच (synaptic स्थान के लिए) या PSD के किनारे (extrasynaptic स्थान के लिए) के बीच की दूरी को मापने।
  6. सॉफ्टवेयर द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। साधन तुलना करने के लिए दो पूंछ टी परीक्षण का प्रयोग करें। महत्व जब पी <0.05 समाप्त। जब तक अन्यथा इंगित, रिपोर्ट मूल्यों ± SEM 18 के रूप में मतलब है।

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Representative Results

यहाँ प्रस्तुत परिणाम के रूप में पहले 24,25 वर्णित है, चूहे रेटिना में RGC dendrites पर Glua 2/3 के भिन्न sub अन्तर्ग्रथनी स्थानीयकरण पैटर्न और NMDARs प्रदर्शित करता है। RGC वृक्ष के समान प्रोफाइल Glua 2/3 immunogold कणों का 77%, सबसे केंद्रीय synapses के समान PSD (चित्रा 1 ए) के भीतर स्थित थे। हालांकि, NMDARs या तो synaptically या extrasynaptically स्थित थे। GluN2A immunogold कणों के 83% PSD में अनुवादित किया गया (चित्रा 1C, 2A, 2 बी), बंद synapses, और सोने के कणों में रियायत के तौर पर PSD (चित्रा 2 सी) के केंद्र में और अधिक ध्यान केंद्रित कर रहे थे। इसके विपरीत, GluN2B (96%) के लिए कणों लेबलिंग की बड़ी संख्या को PSD (चित्रा 1 बी, 2 ए, 2 बी) के बाहर, 180 एनएम के किनारे से स्थित थे मुख्य रूप से extrasynaptic प्लाज्मा झिल्ली के साथ वितरित चोटी कण घनत्व के साथ, PSD (चित्रा 2 बी)। विशेष रूप से, GluN2B पर synapses के लिए एक प्राथमिकता का प्रदर्शन किया। प्रयोगों, GluN2A, PSD-95 और CTB के एक साथ लेबलिंग के एक सबसेट में संकेत दिया है कि GluN2A और PSD-95 बंद RGC डेन्ड्राइट (चित्रा -1) है, जहां NR2A वृक्ष के समान झिल्ली में था की PSD में colocalized थे, जबकि PSD-95 के नीचे था झिल्ली, सुझाव है कि वे PSD पर लंगर डाले हैं। Perisynaptic झिल्ली और mitochondrial झिल्ली के बीच सोने के घनत्व में एक महत्वपूर्ण अंतर मनाया गया, पूर्व (चित्रा 2 डी) में एक विशिष्ट लेबलिंग का सुझाव दे।

आकृति 1
चित्रा 1. immunogold लेबल RGC Dendrites CTB द्वारा लेबल पर synaptic और ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की Perisynaptic स्थानीयकरण दिखा रहा है। (ए): GluA2 / 3 (10 एनएम सोना) और CTB (18 एनएम सोना) के दोहरे immunogold लेबलिंग। Presynaptic रिबन तीर द्वारा संकेत दिया। छोटे गोलडी कणों RGC की PSD प्रक्रियाओं में (तीर) clustered रहे हैं। (बी) GluN2B (10 एनएम सोना) और CTB (18 एनएम सोना) के दोहरे immunogold लेबलिंग; छोटे सोने के कणों (तीर) extrasynaptic प्लाज्मा झिल्ली पर हैं। (सी) GluN2A (10 एनएम सोना) और CTB (18 एनएम सोना) के दोहरे immunogold लेबलिंग। GluA2 / 3 के लिए इसी प्रकार, छोटे कणों PSD भीतर clustered रहे हैं। (डी) GluN2A (5 एनएम सोना) की ट्रिपल immunogold लेबलिंग, PSD-95 (10 एनएम सोना) और CTB (18 एनएम सोना)। GluN2A सोने के कणों (छोटे तीर) और PSD-95 सोने के कणों (बड़े तीर) के सह स्थानीय व्यक्ति CTB पॉजिटिव RGC dendrites पर PSD के भीतर हैं। इनसेट: PSD के उच्च बढ़ाई। स्केल पट्टी: 0.1 माइक्रोन (एक = सी = डी, बी)। ये जांग और डायमंड 24,25 में प्रकाशित आंकड़ों के आधार पर नए micrographs हैं। होड़ करने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की वा बड़ा संस्करण।

चित्र 2
के भीतर और बाहर PSD RGC dendrites में NMDAR स्थानीयकरण के चित्रा 2. मात्रात्मक तुलना। (ए) GluN2A (एन = 53 प्रोफाइल) और GluN2B (एन = 56 प्रोफाइल) के लिए immunogold की स्पर्शरेखा वितरण दिखा हिस्टोग्राम। perisynaptic क्षेत्र 60 एनएम डिब्बे में विभाजित किया गया था। (बी) GluN2A (एन = 53 प्रोफाइल) और GluN2B (एन = 56 प्रोफाइल) के लिए immunogold कणों की लेबलिंग घनत्व दिखा हिस्टोग्राम। perisynaptic क्षेत्र PSD के किनारे से 180 एनएम डिब्बे में विभाजित किया गया था। (सी) स्पर्शरेखा immunogold कणों की कुल संख्या के GluN2A (एन = 44 प्रोफाइल) और GluN2B (एन = 3 प्रोफाइल) के लिए सभी प्रोफाइल पर लेबलिंग के साथ PSD के भीतर वितरण दिखा हिस्टोग्राम। (डी) के कण घनत्व की तुलनाGluN2B (एन = 53 और 33 प्रोफाइल) और GluN2A (एन = 9 30) perisynaptic झिल्ली में और mitochondrial झिल्ली, क्रमशः के लिए immunogold कणों, CTB पॉजिटिव RGC प्रक्रियाओं में। ये histograms जांग और डायमंड 24,25 में प्रकाशित histograms से संशोधित कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम सफल मात्रात्मक के बाद embedding immunogold ईएम के लिए चार तकनीकों का वर्णन किया है: 1) छोटी और कमजोर निर्धारण, 2) फ्रीज प्रतिस्थापन, 3) के बाद embedding immunogold धुंधला हो जाना, और 4) मात्रा का ठहराव।

ईएम immunogold Ultrathin ऊतक वर्गों में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। सोने के कणों के साथ लेबल एंटीबॉडी सीधे ईएम का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं। जबकि एक झिल्ली रिसेप्टर के sub अन्तर्ग्रथनी स्थानीयकरण का पता लगाने में शक्तिशाली, ईएम immunogold तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और ऊतक निर्धारण और प्रसंस्करण विधियों के कठोर अनुकूलन की आवश्यकता कर सकते हैं।

झिल्ली अखंडता और प्रतिजनकता के बीच एक इष्टतम संतुलन कायम करने के लिए, हम अलग अलग निर्धारण के तरीकों और कई बार परीक्षण किया। उदाहरण के लिए, एक सफल केंद्रीय synapses 19,20 पर postembedding ईएम NMDAR के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल रेटिना में NMDAR immunoreactivity का पता लगाने में नाकाम रहे। इस अध्ययन के कोमल निर्धारण और कम ऊष्मायन बार नियोजितमजबूत, लंबे समय तक निर्धारण के बाद 16 NMDA रिसेप्टर प्रतिजनकता को कम करने से बचें।

फ्रीज प्रतिस्थापन विधि पहले 1990 के दशक में 27 ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की ultrastructural स्थानीयकरण के लिए विकसित की है, और एक अध्रुवीय, हाइड्रोफोबिक राल, HM20 28, इष्टतम postembedding immunogold लेबलिंग के लिए आवश्यक में कम तापमान घुसपैठ और polymerization शामिल किया गया था। विशिष्ट फ्रीज प्रतिस्थापन यहां इस्तेमाल किया विधि कोक्लीअ 29 में लेबलिंग ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए विकसित किया गया था और केंद्रीय synapses 18,19,20,30 में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के लिए अनुकूलित किया है, और यह हाल के वर्षों में आगे संशोधित किया गया है। कम तापमान घुसपैठ और राल के polymerization गर्मी अस्थिर अणुओं के प्रतिजनकता को संरक्षित करने में मदद करता है और लिपिड निष्कर्षण और राल और ऊतकों 19,31 के बीच प्रतिकूल रासायनिक प्रतिक्रियाओं को कम करता है। ऊपर वर्णित निर्धारण के तरीकों, इस फ्रीज प्रतिस्थापन विधि पी के साथ संयुक्तअच्छा प्रतिजनकता और उचित संरचनात्मक संरक्षण rovides।

postembedding immunogold यहाँ तकनीक का इस्तेमाल किया preembedding immunoperoxidase विधि के साथ तुलना में कई फायदे हैं। हालांकि preembedding immunoperoxidase विधि उच्च संवेदनशीलता 15,16,17,19,20,21 है, प्रतिक्रिया उत्पाद का प्रसार अविशिष्ट लेबलिंग 26,32, जिसके परिणामस्वरूप में अपरिहार्य है। इसके अलावा, peroxidase एंजाइम की प्रतिक्रिया 21 रैखिक नहीं है, यह मुश्किल मात्रात्मक रिसेप्टर्स 18,21 की सटीक sub अन्तर्ग्रथनी स्थानीयकरण मूल्यांकन करने के लिए कर रही है। Postembedding immunogold विधि एक गैर प्रसारण मार्कर को रोजगार और राल एम्बेडेड ऊतक, जो प्रसारण कलाकृतियों को कम कर देता है और उच्च स्थानिक संकल्प 18,33,34 परमिट की सतह पर immunoreaction प्रदर्शन करती है। सोने के कणों सीधे गिना जा सकता है, इसके अलावा, यह संभव रेटिना रिबन syn पर नंबर, घनत्व और इन रिसेप्टर्स की परिवर्तनशीलता अनुमान लगाने के लिए कर रही हैapses। इसके अलावा, postembedding immunogold कई रिसेप्टर्स के स्थानीयकरण एक साथ ईएम स्तर पर जांच की जानी सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक रेटिना रॉड द्विध्रुवी synapses 35 में अन्य झिल्ली प्रोटीन (जैसे।, गाबा रिसेप्टर्स और कैल्शियम सक्रिय पोटेशियम [बी] चैनल) का स्थानीयकरण की पहचान करने में नियोजित किया गया है।

कई कारकों इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। , पहले तेजी से और कोमल निर्धारण प्रतिजनकता और ठीक संरचना के संरक्षण के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम है। दूसरा, निर्धारण के लिए "पीएच-पाली" प्रोटोकॉल प्रतिजनी epitopes का इष्टतम का पता लगाने और अच्छा ultrastructural संरक्षण 36 के लिए फायदेमंद है। तीसरा, फ्रीज प्रतिस्थापन, रिसेप्टर्स की प्रतिजनकता को बरकरार रखता है, जबकि उचित ठीक संरचना को बनाए रखने। चौथा, immunogold धुंधला हो जाना, TBST बफर (साथ ट्राइटन X-100), एंटीबॉडी ऊष्मायन के साथ प्रयोग किया जाता है, जबकि दौरान टीबीएस बफर (बिना ट्राइटन X-100) का इस्तेमाल किया जाता हैके बीच है और एंटीबॉडी के ऊष्मायन के बाद धोने के लिए; यह ठीक संरचना में परिवर्तन को कम कर सकता है। पांचवां, समाधान के आदान-प्रदान के दौरान, वर्गों ऊतक सूखने की वजह से कलाकृतियों को कम करने के लिए गीला रखा जाता है।

postembedding immunogold यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल रेटिना रिबन अन्तर्ग्रथन पर झिल्ली रिसेप्टर्स की पहचान करने के लिए एक बढ़ाया तरीका प्रदान करता है, यह काफी के रूप में प्रतिरक्षाऊतकरसायन तरीकों preembedding के रूप में प्रति संवेदनशील नहीं है; लेकिन बाद के लिए एक अच्छा विकल्प है क्योंकि वे अपेक्षाकृत कम विशिष्टता से पीड़ित हैं और जैसा कि ऊपर उल्लेख मात्रा का ठहराव के लिए कम उत्तरदायी नहीं हैं। हमारी प्रोटोकॉल भी कुछ हद तक ठीक संरचना समझौता immunolabeling के लिए तैयार नहीं और अधिक मजबूती से तय ऊतक की तुलना में। उम्मीद है, भविष्य नवाचारों इन सीमाओं को पार करेगा।

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Acknowledgments

इस काम के मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान (NINDS) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बहरापन और अन्य संचार विकार पर (NIDCD), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (एनआईएच) के अंदर का कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया। हम NINDS ईएम सुविधा और NIDCD उन्नत इमेजिंग कोर (कोड # ZIC डीसी 000,081-03) सहायता के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde EMS 15710
Glutaraldehyde EMS 16019
NaH2PO4 Sigma S9638
Na2HPO4 Sigma 7782-85-6
CaCl2 Sigma C-8106
BSA Sigma A-7030
Triton X-100 Sigma T-8787
NaOH Sigma 221465
NaN3 JT Baker V015-05
Glycerol Gibco BRL 15514-011
Lowicryl HM 20 Polysciences 15924-1
Tris-Base Fisher BP151-500
Tris Fisher 04997-100
Anti-GluN2A Millipore AB1555P Dilution 1/50
Anti-GluN2B Millipore AB1557P Dilution 1/30
Anti-GluA2/3 Millipore AB1506 Dilution 1/30
Anti-PSD-95 Millipore MA1–046 Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles EMS 25704 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles EMS 25814 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles EMS 25812 Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles Jackson ImmunoResearch 705-215-147 Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. EMS FCF2010-Ni
Uranyl acetate EMS 22400-1
Methanol EMS 67-56-1
Lead citrate Leica
Leica EM AFS Leica
Leica EM CPC Leica
Ultramicrotome Leica
JEOL 1200 EM JEOL
liquid nitrogen  Roberts Oxygen
Propane Roberts Oxygen
CTB List Biological Laboratories 104 1 - 1.2%
Anti-CTB List Biological Laboratories 703 Dilution 1/4,000

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 108 रेटिना तंत्रिका जीव विज्ञान synaptic और perisynaptic वितरण immunogold इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल NMDA AMPA PSD-95
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Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses. J. Vis. Exp. (108), e53547, doi:10.3791/53547 (2016).

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