Introduction
글루타메이트는 망막 1에서 주요 흥분성 신경 전달 물질이다. 바이폴라 전지 (2)로부터 글루타메이트 시냅스 입력을 수신하는 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)는, 뇌 영상 정보를 전송 망막의 출력 뉴런이다. 생리 학적 연구는 망막 신경절 세포의 시냅스 여기가 NMDA 수용체 (NMDARs)와 AMPA 수용체 (AMPARs) 3,4,5에 의해 postsynaptically 매개되는 것으로 나타났다. 망막 신경절 세포의 흥분성 시냅스 후 전류 (EPSCs)가 AMPARs 및 NMDARs에 의해 매개되어 있지만 망막 신경절 세포에 3,5,6,7,8, 자연 미니어처 EPSCs (mEPSCs)는 만 AMPARs 매개 구성 요소 4,5,9을 나타낸다. 그러나, 글루타메이트 흡수를 감소시키는 것은 RGC의 수상 돌기에 NMDARs이 흥분성 시냅스의 외부에 위치 될 수 있음을 시사 자발적인 EPSCs 5 NMDAR 구성 요소를 한 것으로 밝혀졌습니다. 막 - 관련 구아닐산 키나제 등 PSD-95 (MAGUKs)이 글루타메이트 수용체 이온 채널을 포함한 클러스터 신경 전달 물질 수용체시냅스 부위에서의도 구별 subsynaptic 10,11,12,13,14 발현 패턴을 나타낸다.
최근 수십 년간, 촛점 면역 사전 매립 전자 현미경 (EM) 면역 위에 막 수용체 발현을 연구하기 위해 사용되었다. 촛점 면역 수용체 발현 넓은 패턴을 보여준다하더라도, 그 해상도가 낮은 것이 불가능 세포 내 위치를 구별하는 데 사용할 수있다. 포유 동물의 망막에 사전 내장 EM 연구는 NMDAR의 서브 유닛이 콘 바이폴라 전지 리본 시냅스 15, 16, 17에서 시냅스 요소 내에 존재 함을 나타냅니다. 이것은 생리 학적 증거 명백 대조적이다. 그러나, 반응 생성물의 확산을 미리 매립 immunoperoxidase 방법에서 공지 된 이슈이다. 따라서,이 방법은 일반적으로 통계적으로 신뢰할 수있는 데이터를 제공하지 않습니다 및 extrasynaptic 막 18,19,20,21 대 시냅스 막에 현지화 사이의 구별을 제외 할 수 있습니다. 에다른 한편으로는, 생리 및 해부학 적 데이터는 망막 신경절 세포 3,5,7,9,22에 AMPARs의 시냅스 현지화과 일치한다. 따라서, 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체와 MAGUKs는 시냅스에뿐만 아니라 perisynaptic 또는 extrasynaptic 막 구획뿐만 아니라 현지화됩니다. 그러나, 망막 리본 시냅스에서 이들의 막 단백질의 고해상도의 정량 분석이 여전히 필요하다.
여기서는 콜레라 독소 소단위 B를 사용하여 라벨 (CTB)를 래트 망막 신경절 세포 상 시냅스에서 이들 단백질의 개수 밀도 변동을 추정 하였다 NMDAR 소단위, AMPAR 소단위와 PSD-95 subsynaptic 현지화를 검사 postembedding EM의 immunogold 기술 개발 역행 추적 방법.
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Protocol
관리 및 동물의 처리는 NIH 동물 관리 및 사용위원회의 가이드 라인에 따라했다. 12 시간 빛 : 출생 후 하루 (P) 양측 우수한 둔덕을 통해 1-1.2 % CTB를 주입 15-21 흰쥐는 12 일 유지 하였다 어두운주기를.
1. 망막 조직 고정
- 해부 현미경, 아주 좋은 팁, 가위, 셀룰로오스 필터 종이, 플라스틱 피펫과 현미경 슬라이드 2 집게 다음 재료 및 도구를 조립합니다.
- 2.0 ml의 할로 탄 (흡입 마취제)와 밀폐 된 챔버에 쥐를 마취. 발가락 핀치, 또는 깜박임 반사의 부족 후 후방 발의 철회의 부족 :이 방법으로 적절한 마취를 결정합니다. 그런 다음 단두대 즉시 목을 베다. pH가 7.4에서 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 유리 접시에 홍채 가위 쌍의 장소 눈을 제거합니다.
- 해부 현미경을 사용하면, 옥수수를 제거안구의 전면을 차단하여 개. 집게와 내부 망막 표면에서 렌즈와 유리체를 제거합니다.
- 망막이 아이 컵에서 분리 될 때까지 두 집게로 공막 껍질.
- 면도기 200 μm의 두께 스트립, pH의 변화 고정 대상 - (100)에 즉시 망막을 잘라.
- 실온에서 20 분 - 10의 pH 10.5에서 30 분 다음에 4 % 파라 포름 알데히드를 더한 0.01 %의 글루 타르 알데히드 - 20 pH가 6.0에서 0.1 M PB 4 % 파라 포름 알데히드의 망막 스트립을 수정합니다.
- (4 ℃에서의 pH 7.4), 0.15 mM의 CaCl2를 가진 PB 여러 회 세척 한 후에 0.1에서 (30 %의 O / N 후, 10 %, 20 %, 30 %로 각각 60 분) M 글리세롤 망막 스트립 cryoprotect 대체를 동결하기 전에 PB.
2. 동결 대체
참고 :이 동결 대체 방법은 이전에 게시 된 프로토콜 (19, 20)에서 수정됩니다. 또한, 악기 (장갑을 착용) 매우 추운 것을 매우 중요하다; 영형악기를 터치하면 therwise, 조직을 부분적으로 해동 수 있습니다. 이 단계의 모든 AFS 챔버 내에서 수행되고 악기는 챔버의 가장자리 위의 이동이 허용되지 않습니다. 유사하게, AFS에 사용 된 모든 화학 물질의 적절한 냉각이 필요하다.
- - 플 런지 동결 EM의 냉동 보존기구 (CPC)에서 -184 ° C에서 액체 프로판의 망막 스트립. 좋은 브러시를 사용하여, (브러시를 사용하여 별도의 버퍼를 심지) 급락로드의 끝에 가서 금속 스텁에 부착 된 양면 테이프의 작은 조각에 샘플을 배치합니다.
- 액체 프로판으로 봉 런지 약 5 초 동안 거기에 유지하고, 액체 질소로 채워진다 작은 이송 챔버를 이용하여 자동 동결 교체기구 (AFS)으로 전송 ( "LN 2 크라이 이송 컨테이너를 냉각 ').
- AFS에 냉동 샘플 및 기기 (집게와 메스)를 배치 한 후, 그 자체에 대한 실에서 악기를 냉각veral 분 조직을 터치하거나 작은 이송 챔버에 몇 초 동안 기기의 팁을 배치하여 이들을 냉각하기 전에 (액체 질소 충전 () LN 2 크라이 이송 컨테이너를 냉각 ').
- AFS에서하면 벌금 메스를 사용하여 스텁에서 샘플 테이프를 제거합니다. 또한, 질소 가스의 유량 제어를 유지 TF 이러한 과정에서 오픈 (TF는 'LN이 증발기 용 조정기 제어'라고 기재 함).
- (AFS를 설정하기 전에, IE) 평면 매립 홀더에 고정 된 조직을 배치하기 전에, 투명 플라스틱 시트 얇은 원형 절단 각 웰의 바닥 라인하도록 홀더의 하부에 배치. 완료 할 때 중합 시험편 블록 비교적 쉽게 제거 할 수있다.
참고 : 이전에, 우리는 두 번 라이 헤르 + 젤라틴 캡슐 (Petralia와 Wenthold, 1999 참조) 사용하는 평면 삽입 홀더에 다른 방법을 사용하고, <SUP> 20. - = 4 ° C / 시간 (11.3 시간), T2에 의해 32 시간, S1은 = 증가 온도 T1 = -90 ° C ~ -45 ° C ~ 50 시간, S2에 대한 : AFS (악기 용어를 사용)에서 다음 자동 시퀀스를 사용하여 = 5 ° C / 시간 (9 시간), (총 = 142.3 시간) 40 시간 동안 T3 = 0 ° C로 증가 온도. 이전에 Timed 시퀀스를 시작하기 (-90 ° C에서) AFS에서 샘플을 배치하는 4 시간은 2 - 걸릴 수 있습니다.
- AFS에서> 32 시간 동안 -90 ℃에서 메탄올 1.5 % 우라 닐 아세테이트에 얼어 붙은 섹션을 담가. 평면 포함 알루미늄 홀더에 일곱 우물의 각 조직 (일반적으로) 두 가지를 놓고 (세 AFS에 맞게).
- 우물에서 우라 닐 아세테이트 / 메탄올로 조직 + 테이프를 놓고는 테이프에서 조직을 제거 너무 어려운 경우, 직전에 침투 (예 : Lowicryl HM20)를 시작 포함 매체에, 나중에 테이프를 제거합니다.
- 이어서, 온도를 단계적으로 증가 시간 당 -45 ° C (+ 4 ℃로; 자동 순서대로).
- 각 플랫 포함 홀더에서 기존의 용액을 제거하기 위해 뾰족한 플라스틱 피펫을 사용하여, 다음 예비 냉각 신선한 메탄올을 추가하는 또 다른 표준 플라스틱 피펫을 사용하여, 미리 냉각 된 메탄올의 샘플을 세 번 씻으십시오.
- 1, 2 :이어서, 동일한 방법을 사용하여 예 1의 매체 (HM20은 / 메탄올 매립 낮은 온도 매립 수지 점진적 샘플 침투 2 시간 동안 순수 수지이어서 2 시간 동안 한 각 후 수지를 변경할 등) O / N을 유지합니다.
- 단지 웰의 상단에 도달하는 수지의 레벨을 조정 다음날 다시 수지를 변경한다.
- 샘플을 중합 (-45 ° C 자동 시퀀스에서 0 ° C로, 시간 당 + 5 ° C) 40 시간 동안 UV 빛.
- 그런 다음 AFS에서 샘플을 제거합니다. 일반적으로 샘플 블록은 여전히 색상에 약간의 핑크색을 보여줍니다. RT O에서 화학 물질 흄 후드에서 형광 빛에 가까운 샘플을, 배치 / N 이상 그들이 때까지 앱귀를 완전히 취소합니다.
3. Postembedding EM Immunogold 면역 세포 화학
참고 : 23,24,25 설명 된대로 Postembedding의 면역 세포가 수행된다.
- 1 % 톨루이딘 블루와 1 ㎛을 Ultramicrotome와 부분, 얼룩 부분을 잘라 및 단면 방향을 위해 그들을 검사; 절편의 최적의 횡단면을 달성하기 위해 조직 블록의 방향.
- 을 Ultramicrotome 70 nm 두께의 얇은 부분을 잘라 Formvar - 탄소 코팅 니켈 슬롯 그리드에 그들을 수집합니다.
- 워시는 TBS 버퍼 세 번 (TBS, 0.05 M 트리스 완충액, 0.7 %의 NaCl, pH를 7.6) 세척 한 다음 증류수 H 2 O에 한 번 메쉬.
- 하나 NMDAR 소단위 (항 - 토끼 GluN2A 1:50 항체 : 염소 항 - CTB를 함유하는 혼합물을 20 μL의 방울 (3000 1)의 다음, 30 분 동안 TBS 5 % BSA 20 μL 떨어진다 그리드 부화 및 , GluN2B 1:30)을, 또는 항 - 토끼 GluA2 / 3 (1:30)을2 % BSA와 TBS-트리톤 (TBST, 0.01 % 트리톤 X-100, 산도 7.6) 및 0.02 M NaN이 3 O / RT에서 N.
- 5 분 TBS (산도 8.2) 다음 세 가지 별도의 10 TBS 방울 (20 μL) (PH 7.6), 10, 20 분에 세척 그리드.
- TBST에 18 나노 금 입자에 결합 된 10 나노 금 입자와 당나귀 방지 염소 IgG에 (1:20)을 수행 결합 당나귀 항 - 토끼 IgG를 (1:20)를 포함하는 혼합물의 방울에 2 시간 (20 μL)에 대한 그리드를 품어 2 % BSA 및 0.02 M NaN의 3 (PH 8.2).
- 초순수에 다음, 5, 5, 10 분 동안 TBS의 20 μl의 방울 (PH 7.6)에 그리드를 세척 한 다음 건조.
- 어두운 조건 하에서 각각 8 및 5 분 동안 증류하여 H 2 O 5 % 우라 닐 아세테이트 및 0.3 %의 납 시트르산 Counterstain과 그리드.
- 트리플 - 표지 실험, 그리드 부화 O / 항 - 염소 CTB의 혼합물 20 μL 방울 (1 : 3000)과 함께 RT에서 N, 항 - 마우스 PSD-95 (1 : 100), 및 항 - 토끼 GluN2A (1 : 50). 그런 다음 2를 2 시간 동안 그리드를 품다2 % BSA 및 0.02 M NaN이 3 TBST에 18, 10, 5 nm의 금 입자에 결합 된 IgG를 혼합 (PH 8.2) 0 μL 방울. 세척 사이에 항체 배양 후으로 대조 이중 라벨과 같은 절차를 유지합니다.
- 컨트롤 이차 항체 단독인가 된 수행 하였다.
- EM에보기 그리드 및 디지털화 된 이미지. 이 24 필요한 경우에만 밝기 및 대비를위한 어도비 포토샵 6.0에서 최종 수치를 처리합니다.
4. 정량
- 수동 8,000X 확대에 구멍이나 균열이없는 내부 얼기 층 (IPL)의 선택 영역은, 무작위 25000 배율에서 IPL의 전체 깊이를 합성 사진.
- 그들은) 역행 수송 CTB 신호 (큰 금 입자)가 포함되어, b)을 나타낸다 잘 정의 막은, 갈라진 틈 및 시냅스 밀도, C)는 적어도 두개의 작은 금 부분을 포함 할 때 원뿔 바이폴라 댓구에서 RGC 수지상 식별PSD 내의 icles 또는 extrasynaptic 세포막을 따라 하나 이상의 작은 금 입자.
- 정량 분석을 위해 상기 기준에 따라, 55 RGC 수지상 - (45)를 수집한다.
- PSD 및 NIH ImageJ에 소프트웨어 개별 RGC 덴 드라이트의 extrasynaptic 세포막의 길이를 측정한다. 같은 막 10 nm의 금 입자 내의 카운트 (7)의 평균 두께에 기초하여, 막 - 관련 - 세포막 26 9 내지.
- 선형 마이크로 미터 (금색 / μm의) 당 금 입자의 수가 입자 밀도를 계산한다. 각 금 입자의 중심 (시냅스 위치) PSD의 중간 또는 (extrasynaptic 위치) PSD의 가장자리 사이의 거리를 측정한다.
- 소프트웨어에 의해 통계 분석을 수행합니다. 수단을 비교하는 두 꼬리 t-테스트를 사용합니다. 의미 P <0.05 결론 지었다. 달리 명시하지 않으면, 리포트 값으로 ± SEM (18)를 의미한다.
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Representative Results
이전 24, 25 설명한 바와 같이 여기에 제시된 결과는 쥐의 망막에서 RGC의 수상 돌기에 현저하게 다른 subsynaptic 현지화 GluA 2/3의 패턴과 NMDARs을 보여줍니다. RGC 수지상 정보에 GluA 2/3 immunogold 입자의 77 %가 가장 중심 시냅스 마찬가지로, PSD (도 1a) 내에 위치 하였다. 그러나 NMDARs은 하나 시냅스 또는 extrasynaptically에 있었다. GluN2A의 immunogold 입자의 83 %가 PSD 국소화되었다 (도 1C, 2A, 2B), 우선적 OFF 시냅스 및 금 입자의 PSD (도 2C)의 중심에서 더 농축 하였다. 반대로 GluN2B (96 %)에 대한 입자 라벨의 대다수는 모서리 180 nm에서 피크 입자 밀도와 주로 extrasynaptic 세포막 따라 분포, PSD (도 1B, 2A, 2B)의 외부에 위치 된 PSD (그림 2B). 특히, GluN2B는 ON 시냅스에 대한 선호를 보였다. 실험 GluN2A, PSD-95 및 CTB의 동시 라벨의 일부에서 PSD-95가 아래에있는 동안 GluN2A 및 PSD-95 NR2A이 수지상 막에 있었다 OFF RGC의 수상 돌기 (그림 1D)의 PSD에서 colocalized 된 것으로 나타났다 멤브레인은, 그들이 PSD에서 고정되도록 제안. perisynaptic 미토콘드리아 막과 막 사이에 금 농도의 유의 한 차이는 전 (도 2D)에 고유 라벨을 제안 관찰되었다.
CTB하여 레이블이 RGC Dendrites에서에서 시냅틱과 글루타메이트 수용체의 Perisynaptic 현지화를보기 그림 1. Immunogold 라벨링. (A) : GluA2 / 3 (10 nm의 금)와 CTB (18 나노 금)의 두 배 immunogold 라벨. 시냅스 리본 화살촉으로 표시. 작은 GOLD 입자는 PSD RGC의 과정에 (화살표) 클러스터 있습니다. (B) GluN2B (10 nm의 금)와 CTB (18 나노 금)의 두 배 immunogold 라벨; 작은 금 입자 (화살표) extrasynaptic 세포막에있다. (C) GluN2A (10 nm의 금)와 CTB (18 나노 금)의 두 배 immunogold 라벨. GluA2 / 3와 유사하게, 작은 입자는 PSD에서 클러스터됩니다. (D) GluN2A (5 nm의 금) 트리플 immunogold 라벨, PSD-95 (10 nm의 금)와 CTB (18 나노 금). GluN2A 금 입자 (작은 화살표)와 PSD-95 금 입자 (큰 화살표) 공동 현지화 개인 CTB 양성 RGC의 수상 돌기에 PSD에 있습니다. 삽입 : PSD의 높은 배율. 스케일 바 : 0.1 μm의 (A = C = D, B). 이들은 장과 다이아몬드 (24, 25)에 게시 된 데이터를 기반으로 새로운 현미경 사진이다. 경쟁하려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 WA 더 큰 버전.
RGC Dendrites에서의 NMDAR 현지화 그림 2. 양적 비교. (A) GluN2A (N = 53 프로파일) 및 GluN2B (N = 56 프로파일)에 대한 immunogold의 접선 방향 분포를 나타내는 히스토그램 내부와 외부의 PSD. perisynaptic 지역은 60 나노 빈 (bin)으로 구분 하였다. (B) GluN2A (N = 53 프로파일) 및 GluN2B (N = 56 프로파일)에 대한 immunogold 입자의 라벨 밀도를 나타내는 막대 그래프. perisynaptic 영역 PSD의 에지에서 180 nm의 빈들로 분할 하였다. (C) PSD에서 라벨과 모든 프로필에서 GluN2A (N = 44 프로파일) 및 GluN2B (N = 3 프로파일)에 대한 immunogold 입자의 총 수의 접선 방향 분포를 나타내는 막대 그래프. (D)의 입자 밀도의 비교CTB 양성 RGC 공정에서 각각 GluN2B (N = 53, 33 프로파일) 및 GluN2A (N = 9, 30) perisynaptic 세포막과 미토콘드리아 막에 대한 immunogold 입자. 이 히스토그램은 장과 다이아몬드 24, 25 년에 출판 히스토그램에서 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 성공적으로 정량 후 삽입 immunogold에게 EM을 네 가지 기술을 설명했다 : 1) 짧고 약한 고정, 2) 동결 대체, 3) 포스트 포함 immunogold 염색, 4) 정량.
EM의 immunogold는 얇은 조직 섹션에서 특정 단백질의 검출을 할 수 있습니다. 금 입자로 표지 된 항체를 직접 EM을 사용하여 가시화 할 수있다. 막 수용체의 subsynaptic 현지화를 검출하는 강력한 반면, EM의 immunogold 기술적으로 도전, 그리고 조직의 고정 및 처리 방법의 엄격한 최적화를 필요로 할 수 있습니다.
막 무결성 및 항원 사이의 최적의 균형을 유지하기 위해, 우리는 다른 고정 방법과 시간을 테스트했다. 예를 들어, 중앙 시냅스 (19, 20)에 postembedding EM NMDAR에 사용되는 성공적인 프로토콜은 망막에서 NMDAR 면역 반응을 감지하지 못했습니다. 이 연구에 부드러운 고정 짧은 배양 시간을 사용강한, 장기 고정 16 후 NMDA 수용체 항원의 감소하지 마십시오.
동결 대체 방법은 먼저 1990 년대 초 27 글루타메이트 수용체의 미세 현지화를 위해 개발, 최적의 postembedding의 immunogold 라벨에 필요한 비극성, 소수성 수지, HM20 28 일에 저온 침투 중합을 포함했다. 여기에 사용 된 특정 동결 교체 방법은 달팽이관 29 라벨링 글루타메이트 수용체 개발 중앙 시냅스 18,19,20,30 글루타메이트 수용체 최적화하고 최근에는 상기 수정 된 하였다. 수지의 저온 침투하여 중합 열 불안정한 분자의 항원 성을 유지하는 데 도움 지질 추출 수지 조직 사이 19,31 유해 화학 반응을 최소화한다. 상기 정착 수단이 동결 교체 방법 (P)과 결합좋은 항원과 합리적인 구조 보존을 rovides.
여기에 사용 된 postembedding immunogold 기법 preembedding의 immunoperoxidase 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. preembedding immunoperoxidase의 방법은 고감도 15,16,17,19,20,21이 있지만, 반응 생성물의 확산은 비특이적 라벨링 26,32 결과 불가피하다. 또한, 퍼 옥시 다제 효소 반응 어려운 정량적 18,21 수용체의 정확한 위치 파악 subsynaptic을 평가하기 21 선형 아니다. postembedding immunogold의 방법은 비 - 확산 성 마커를 사용하고 확산 아티팩트를 감소시키고,보다 높은 공간 해상도 18,33,34 허용 수지 포매 조직의 표면에서 면역 반응을 수행한다. 금 입자는 직접 가능한 망막 리본 SYN 이들 수용체의 개수 밀도 변동을 추정 할 수있게, 또한 계산 될 수있다apses. 또한, immunogold을 postembedding하는 여러 수용체의 지역화가 동시에 EM 수준에서 검사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 성공적으로 망막 막대 양극 시냅스 (35)의 다른 막 단백질 (예., GABA 수용체 및 칼슘 활성화 칼륨 [BK] 채널)의 현지화를 식별에 이용되고있다.
여러 가지 요인이 프로토콜의 성공을 위해 중요하다. 첫째, 빠르고 부드러운 고정은 항원 성 및 미세 구조의 보존을위한 첫 번째 중요한 단계입니다. 둘째, 고정 용 "pH의 변화"프로토콜은 항원 에피토프의 최적의 검출 및 좋은 미세 보존 (36)에 대한 유리하다. 적당한 미세 구조를 유지하면서 제 동결 교체는 수용체의 항원 성을 보존한다. 넷째, 항체 배양에 사용됩니다 (트리톤은 X-100과) immunogold 염색, TBST 버퍼 동안 동안 사용 (트리톤 X-100은 제외) TBS 버퍼사이 항체의 배양 후 세척; 이 미세 구조의 변화를 최소화 할 수 있습니다. 다섯째, 솔루션 교환시, 섹션은 조직 건조에 의한 아티팩트를 줄일 젖은 유지됩니다.
여기에 설명 된 postembedding immunogold 프로토콜 망막 리본 시냅스에서 막 수용체를 식별하기위한 향상된 방법을 제공하는 반면, 면역 조직 화학적 방법을 preembedding 만큼은 민감하지 않다; 그들은 상대적으로 낮은 특이도 고통과 전술 한 바와 같이 정량화 덜 의무가 있기 때문에 그러나 후자는 좋은 옵션이 없습니다. immunolabeling 위해 준비하게 강하게 고정 된 조직과 비교 된 프로토콜은 또한 어느 정도의 미세 구조를 손상시킨다. 희망, 미래의 혁신은 이러한 한계를 극복합니다.
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Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원의 난청 및 기타 통신 장애의 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소 (NINDS) 및 국립 연구소 (NIDCD), (NIH)의 교내 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 NINDS EM 시설과 지원 NIDCD 고급 이미징 코어 (코드 번호 ZIC DC 000081-03)를 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
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