Introduction
Глутамат является главным возбуждающим нейротрансмиттером в сетчатке 1. Ганглиозных клеток сетчатки (РСК), получающие глутаматэргическим синаптическую вход от биполярных клеток 2, являются выходных нейронов сетчатки, которые посылают визуальную информацию в мозг. Физиологические исследования показали, что синаптические возбуждение РГК опосредуется постсинаптически рецепторами NMDA (NMDARs) и АМРА рецепторов (AMPARs) 3,4,5. Хотя возбуждающих постсинаптических токов (EPSCs) в РСК при посредничестве AMPARs и NMDARs 3,5,6,7,8, спонтанные миниатюрные EPSCs (mEPSCs) на РСК проявляют лишь AMPARs-опосредованного компонент 4,5,9. Однако уменьшение поглощения глутамата выявлены компонент NMDAR в спонтанных EPSCs 5, предполагая, что NMDARs на RGC дендритов могут быть расположены за пределами возбуждающих синапсов. Ассоциированных с мембранами гуанилатциклазы киназы (MAGUKs), такие как PSD-95, что кластер рецепторы нейротрансмиттеров, в том числе рецепторов глутамата и ионного каналас при синаптических сайтов, также демонстрируют различные subsynaptic паттерны экспрессии 10,11,12,13,14.
За последние десятилетия, конфокальной иммуногистохимии и предварительной вложения электронного микроскопа (ЭМ) иммуногистохимии были использованы для изучения экспрессии мембранных рецепторов. Хотя конфокальной иммунное показывает широкие паттерны экспрессии рецептора, его низкое разрешение делает невозможным использование отличить внутриклеточной локализации. Предварительно вложения исследования ЭМ в сетчатке млекопитающих показывают, что NMDA-субъединицы присутствуют в постсинаптических элементов на конусных биполярных клеток синапсах ленточного 15,16,17. Это очевидной отличие от физиологического доказательств. Однако диффузия продукта реакции является известный артефакт в предварительно вложения методом иммунопероксидазной. Следовательно, этот подход обычно не дают статистически достоверных данных и может исключить различие между локализацией в синаптической мембране против внесинаптического мембраны 18,19,20,21. НаС другой стороны, физиологические и анатомические данные согласуются с синаптической локализации AMPARs на РСК 3,5,7,9,22. Таким образом, глутамат рецепторов и MAGUKs на сетчатке лентой синапса локализованы не только постсинаптической но и к perisynaptic или внесинаптических мембранных отсеков. Тем не менее, с высокой разрешающей способностью количественный анализ этих мембранных белков в сетчатке лентой синапса по-прежнему необходима.
Здесь мы разработали методику postembedding EM immunogold для изучения subsynaptic локализацию NMDA-субъединиц, Ампар подразделений и PSD-95 с последующим оценки числа, плотность и изменчивость этих белков в синапсах на РСК крыс помечены с использованием холерного токсина субъединицы B (CTB) ретроградные методы трассировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход и обработка животных проводились в соответствии с NIH уходу за животными и правила использования Комитетом. Постнатальный день (Р) 15-21 Sprague-Dawley крыс, которым вводили 1-1,2% CTB билатерально через верхний бугорок, содержали в 12: 12-часового свет: темнота цикл.
1. Фиксация ткани сетчатки
- Соберите следующие материалы и инструменты: вскрытии микроскопом, 2 пинцета с очень мелкими советы, ножницы, фильтровальную бумагу целлюлозы, пластиковой пипетки и предметное стекло.
- Обезболить крысу в закрытой камере с 2,0 мл галотана (средство для ингаляции анестетика). Определить адекватную обезболивания с помощью этих методов: отсутствие вывода задней лапы после схождения крайнем случае, или отсутствие мерцания рефлекса. Тогда обезглавить сразу с гильотины. Удалить глаза с парой ножниц радужной оболочки и поместите в стеклянную посуду, содержащей 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (PB) при рН 7,4.
- Использование рассекает микроскопом, удалить мозольеа, отрезав переднюю часть глазного яблока. Удалите хрусталик и стекловидное от внутренней сетчатки поверхности щипцами.
- Пил склеры с двумя щипцами, пока сетчатка не изолирован от окуляра.
- Вырезать сетчатки сразу в 100 - 200 мкм толщиной полос с бритвой, и при условии рН-сдвига фиксации.
- Устранить сетчатки полосы в 4% параформальдегид в 0,1 М PB при рН 6,0 в течение 20 - 30 мин, а затем в 4% параформальдегид плюс 0,01% глутаральдегида при рН 10,5 в течение 10 - 20 мин при комнатной температуре.
- После нескольких промываний в РВ с 0,15 мМ CaCl 2 (рН 7,4 при 4 ° С), cryoprotect полоски сетчатки с глицерином (60 мин каждый в 10%, 20%, 30%, то О / N в 30%) в 0,1 М PB перед сублимационной замене.
2. Замораживание-подстановки
Примечание: Этот метод сублимационной замещение модифицируется из ранее опубликованного протокола 19,20. Кроме того, очень важно, что инструменты очень холодно (в перчатках); оtherwise, ткань может оттаивать частично при прикосновении с инструментами. Все эти шаги выполняются внутри камеры AFS и инструменты никогда не может перемещаться над краем камеры. Точно так же, нормальному охлаждению всех химических веществ, используемых в AFS необходимо.
- Окунитесь заморозить полоски сетчатки жидкого пропана при -184 ° С в EM криоконсервации инструмента (КТК). Используя тонкую кисть, поместите образцы на небольшие кусочки двойной палки лентой, присоединенного к металлу окурков, которые идут на конце погружаясь стержней (фитиль лишнюю буфер, используя кисть).
- Окунитесь стержни в жидком пропане и держать там в течение приблизительно 5 сек, а затем передать в автоматическом приборе сублимационной заместительной (AFS) с использованием небольшого транспортного камеру, которая заполняется жидким азотом ( 'LN 2 охлаждают контейнер передачи крио ").
- После размещения замороженных образцов и инструменты (щипцы и скальпель) в AFS, охлаждает инструменты в камере для SEVeral минут, прежде чем прикасаться ткани, или охладить их, поместив кончики инструментов в течение нескольких секунд в небольшом транспортном камеры (заполняется жидким азотом ( 'LN 2 охлаждают контейнер передачи крио ")).
- После того как в AFS, удалить образец и ленту с заглушкой с помощью тонкой скальпель. Кроме того, сохранить контроль расхода газа азота, TF (TF описывается как "контроля регулятора для Л.Н. 2 испарителя ') открытой во время этих процедур.
- До размещения замороженной ткани в плоские-вложение держателей (т.е. перед настройкой AFS), вырезать тонкий круг из прозрачного пластикового листа и поместите его в нижней части держателя таким образом, чтобы выровнять дно каждой лунки. Это позволяет сравнительно легче удаление полимерных блоков образцов, когда закончите.
Примечание: Ранее мы использовали альтернативный способ плоских держателей вложения, а также используя двойные Reichert + желатиновых капсул (см Petralia и Wenthold, 1999) <SUP> 20. - Используйте следующую автоматическую последовательность в AFS (используя терминологию инструмент): T1 = -90 ° С в течение 32 ч, S1 = повышение температуры на 4 ° С / ч (11,3 ч), T2 = -45 ° С в течение 50 ч, S2 = повышение температуры на 5 ° с / ч (9 ч), T3 = 0 ° с в течение 40 ч (всего = 142,3 ч). Это может занять 2 - 4 ч разместить образцы в AFS (на -90 ° C) до начала временной последовательности.
- Погрузите замороженные срезы в 1,5% ацетата уранила в метаноле при -90 ° С в течение> 32 ч в AFS. Поместите два куска ткани (как правило) в каждой из семи скважин в держателе плоской встраивания алюминия (три вписаться в AFS).
- Поместите ткань + ленту в уранилацетате / метанол в скважинах и удалить ленту позже, незадолго до начала внедрения среды (например, Lowicryl HM20) инфильтрации, если это слишком сложно, чтобы удалить ткань с ленты.
- Затем увеличивают температуру ступенчато до -45 ° C (+ 4 ° С в час; в автоматическом последовательности).
- Вымойте образцов три раза в предварительно охлажденной метанолом, с помощью остроконечного пластиковой пипетки, чтобы удалить старую решение от каждой плоской вложения держателя, а затем с использованием другой стандартной пластиковой пипетки, чтобы добавить предварительно охлажденного свежий метанол.
- Затем, используя тот же способ, проникнуть образцы постепенно с низким смол температурных встраивания таких как вложение среды (Н m20 / метанол в отношении 1: 1 и 2: 1, каждой в течение 2 ч, после чего чистой пластмассы в течение 2 ч, а затем изменить смолы и держать O / N).
- Изменение смолу снова на следующий день, регулируя уровень смолы достигнет только к верхнему краю лунки.
- Полимеризоваться образцы (-45 ° С до 0 ° С в автоматическом последовательности; + 5 ° C за час) с УФ-светом в течение 40 ч.
- Затем извлеките образцы из AFS. Как правило, блоки образцов до сих пор показывают некоторую розовость в цвете. Поместите образцы, близкие к флуоресцентным светом в химическом вытяжном шкафу при КТ O / N или больше, пока они приложениеуха совершенно ясно.
3. Postembedding EM Immunogold Иммуноцитохимическая
Примечание: Postembedding иммуноцитохимия выполняется, как описано 23,24,25.
- Вырезать разделы 1 мкм с ультрамикротоме, секции окрашиваются 1% толуидиновым-синий, и изучить их для ориентации раздела; ориентировать блок ткани, чтобы достичь оптимального поперечной плоскости срезов.
- Вырезать 70 нм ультратонких срезов с ультрамикротоме и собрать их на формвар-углерод-покрытых игровых сеток на никель.
- Промыть решетки один раз в дистиллированной H 2 O с последующим Трис-солевом буфере три раза (TBS, 0,05 М Трис-буфер, 0,7% NaCl, рН 7,6) для промывки.
- Инкубируйте сеток в 20 мкл капель 5% БСА в TBS в течение 30 мин, а затем в 20 мкл капель смеси, содержащей антитела из козы против CTB (1: 3000) и антитела к одному NMDA-субъединица (анти-кроличьего GluN2A 1:50 , GluN2B 1:30), или анти-кролик GluA2 / 3 (1:30)в TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, рН 7,6) с 2% BSA и 0,02 М NaN 3 O / N при КТ.
- Мойка сетки на трех отдельных капель (20 мкл) TBS (рН 7,6) в течение 10, 10 и 20 мин, а затем TBS (рН 8,2) в течение 5 мин.
- Инкубируйте сеток в течение 2 ч на каплях (20 мкл) смеси, содержащей осла анти-кроличьего IgG (1:20), соединенный с 10 нм золотых частиц и осел анти-козьего IgG (1:20), соединенных с частицами золота 18 нм в TBST (рН 8,2) с 2% BSA и 0,02 М NaN 3.
- Промыть сеток в 20 мкл капель TBS (рН 7,6) в течение 5, 5 и 10 мин, затем в сверхчистой воде, а затем высушить их.
- Контрастное сетки с 5% ацетата уранила и 0,3% цитратом свинца в дистиллированной H 2 O для 8 и 5 мин в условиях низкой освещенности, соответственно.
- Для экспериментов тройной маркировки, инкубировать сеток O / N при КТ с 20 мкл капель смеси анти-козьего CTB (1: 3000), анти-мыши PSD-95 (1: 100), и анти-кроличьим GluN2A (1 : 50). Тогда инкубировать сеток в течение 2 часов на 20 мкл капель смеси IgG, соединенного с 18, 10, и 5 золотых частиц нм в TBST (рН 8,2) с 2% BSA и 0,02 М NaN 3. Держите те же процедуры, двойной маркировки для мытья и counterstaining между и после инкубации антител.
- Органы управления выполнены в котором вторичные антитела были применены в покое.
- Посмотреть сетки на ЭМ и графическую информацию изображения. Процесс окончательные цифры в Adobe Photoshop 6.0 только для яркости и контрастности, если это необходимо 24.
4. Количественная
- Вручную выбрать участки внутреннего слоя плексиформной (IPL) без отверстий или трещин на 8,000X увеличении, а затем случайным образом фотомонтаж всю глубину IPL на 25,000X увеличении.
- Определить РГК дендриты на конусных биполярных двоек, когда они а) содержать ретроградно транспортируется CTB сигнал (крупные частицы золота), б) обнаруживают четко определены мембраны, щелях, так постсинаптические плотности, в) содержат по меньшей мере два маленький золотой частьicles внутри PSD или более чем один маленький золотой частиц вдоль внесинаптического мембране.
- Собрать 45 - 55 РГК дендриты, на основе вышеуказанных критериев, для количественного анализа.
- Измерьте длину СДП и внесинаптического мембране отдельных дендритов RGC с программным обеспечением NIH ImageJ. Граф частицы золота в пределах 10 нм мембраны как ассоциированный с мембранами, на основе средней толщиной 7 - 9 нм для плазматической мембраны 26.
- Рассчитать плотность частиц, как число частиц золота на линейный микрометр (золото / мкм). Измерьте расстояние между центром каждого золотого частицы и середине PSD (для синаптической месте) или краю PSD (для внесинаптического месте).
- Выполнить статистический анализ с помощью программного обеспечения. Используйте два Стьюдента тесты, чтобы сравнить средства. Заключить значение, когда P <0,05. Если не указано иное, значения отчета как среднее ± SEM 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленные здесь результаты демонстрируют поразительно различные узоры subsynaptic локализации GluA 2/3 и NMDARs на RGC дендритов в сетчатке крыс, как описано ранее 24,25. 77% GluA 2/3 частиц immunogold в RGC дендритных профилей были расположены в PSD (рис 1А), по аналогии с большинством центральных синапсах. Тем не менее, NMDARs были расположены либо синаптически или extrasynaptically. 83% частиц GluN2A immunogold были локализованы в PSD (рис 1С, 2А, 2Б), преимущественно в синапсах прочь, и золотых частиц были более концентрированным в центре PSD (рис 2С). В противоположность этому, большинство маркировки частиц для GluN2B (96%) были расположены вне PSD (рис 1B, 2A, 2B), распространяемой преимущественно вдоль внесинаптического плазматической мембране, с пиковой плотностью частиц при 180 нм от краю PSD (2В). В частности, GluN2B выставлены предпочтение ПО синапсов. В подгруппе экспериментов, одновременно маркировки GluN2A, PSD-95 и СТВ показали, что GluN2A и PSD-95 были локализуется в СПМ ВЫКЛ RGC дендритов (рис 1D), где NR2A был в дендритной мембраны в то время как PSD-95 был под мембрана, предполагая, что они крепятся на PSD. Наблюдалось значительное различие в плотности золота между perisynaptic мембраны и мембран митохондрий, предполагая определенную маркировку в бывшем (рис 2D).
Рисунок 1. метки антител Показаны Synaptic и Perisynaptic Локализация рецепторов глутамата на RGC дендритов помечены CTB. (А): двойной маркировки immunogold из GluA2 / 3 (10 нм золота) и CTB (18 нм золота). Пресинаптические ленты обозначено стрелками. Малый голD частицы группируются (стрелка) в PSD РГК процессов. (B) дважды маркировки immunogold из GluN2B (10 нм золота) и CTB (18 нм золота); мелкие частицы золота (стрелка) находятся на внесинаптического мембране. (С) дважды маркировки immunogold из GluN2A (10 нм золота) и CTB (18 нм золота). Подобно GluA2 / 3, мелкие частицы группируются в PSD. (D) Тройной метки антител из GluN2A (5 нм золото), PSD-95 (10 нм золота) и CTB (18 нм золота). Частицы GluN2A золотые (мелкие стрелки) и PSD-95 частицы золота (крупные стрелки) колокализуются в PSD на отдельных СТВ-положительных дендритов RGC. Врезка: более высокое увеличение СДП. Измерительная линейка: 0,1 мкм (A = C = D, B). Это новые микрофотографии на основе данных, опубликованных в Zhang и бриллиант 24,25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы соперничатьва крупная версия этой фигуре.
Рисунок 2. Количественное сравнение NMDAR локализация в RGC дендритов. (A) гистограмму, показывающую распределение по касательной immunogold для GluN2A (п = 53 анкет) и GluN2B (п = 56 профилей) в пределах и за пределами PSD. Perisynaptic область была разделена на 60 нм бункеров. (B) гистограмму, показывающую плотность маркировка immunogold частиц для GluN2A (п = 53 анкет) и GluN2B (п = 56 анкет). Perisynaptic область была разделена на 180 нм бункеров от края PSD. (C) Гистограмма показывает тангенциальное распределение общего количества частиц immunogold для GluN2A (п = 44 анкет) и GluN2B (п = 3 профиля) на всех профилях с маркировкой внутри PSD. (D) Сравнение плотности частицimmunogold частицы для GluN2B (п = 53 и 33 анкет) и GluN2A (п = 9 и 30) в perisynaptic мембран и мембраны митохондрий, соответственно, в CTB-позитивных процессов RGC. Эти гистограммы редактировался гистограмм, опубликованных в Zhang и бриллиант 24,25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали четыре способа для успешного количественного после встраивания immunogold EM: 1) короткие и слабые крепление, 2) заморозить замещением, 3) после встраивания immunogold окрашивание, и 4) количественная.
EM immunogold позволяет обнаруживать специфических белков в ультратонких срезов тканей. Антитела, меченные золотых частиц могут быть непосредственно визуализировали с использованием EM. В то время как мощный в обнаружении subsynaptic локализацию мембранного рецептора, Е.М. immunogold может быть технически сложным и требует строгого оптимизацию фиксации и обработки тканей методами.
Для оптимального баланса между целостности мембраны и антигенных свойств, мы протестировали различные методы фиксации и раз. Например, успешным протокол, используемый для postembedding EM NMDA-на центральных синапсах 19,20 удалось обнаружить NMDAR иммунореактивности в сетчатке. Это исследование используется нежный фиксацию и короткое время инкубации сВо избежание снижения антигенности рецептора NMDA после сильного, длительного фиксации 16.
Способ сублимационной замена была впервые разработана для ультраструктурным локализации рецепторов глутамата в начале 1990-х 27, и включает в себя низкую инфильтрацию температуры и полимеризации в неполярной, гидрофобной смолой, HM20 28, необходимая для оптимального маркировки postembedding immunogold. Конкретный способ замораживания-замещения используется здесь была разработана для маркировки глутаматных рецепторов в улитке 29 и оптимизированы для глутаматных рецепторов в центральных синапсах 18,19,20,30, и она была модифицирована в последние годы. Инфильтрации низкая температура и полимеризации смолы помогает сохранить антигенность термолабильных молекул и минимизирует экстракцию липидов и неблагоприятные химические реакции между смолой и ткани 19,31. В сочетании с методами, описанными выше крепежными, этот метод замораживания-заместительной рrovides хорошую антигенность и разумную структурную сохранность.
Методика postembedding immunogold используется здесь имеет ряд преимуществ по сравнению с методом preembedding иммунопероксидазной. Хотя метод preembedding иммунопероксидазного имеет более высокую чувствительность 15,16,17,19,20,21, диффузия продуктов реакции неизбежно, в результате чего неспецифической маркировки 26,32. Кроме того, ферментативную реакцию пероксидаза не является линейным 21, что делает его трудно оценить количественно точно subsynaptic локализацию рецепторов 18,21. Способ postembedding immunogold использует не-диффундирующего маркер и выполняет иммунную реакцию на поверхности смолы встраиваемый ткани, что уменьшает содержание диффундирующего артефакты и позволяет более высокое пространственное разрешение 18,33,34. Частицы золота могут быть непосредственно подсчитаны, кроме того, делает возможным оценить число, плотность и изменчивость этих рецепторов на сетчатке глаза лентой синапсиды. Кроме того, postembedding immunogold позволяет локализация нескольких рецепторов, которые будут одновременно рассмотрены на уровне ЭМ. Этот протокол был успешно применен при определении локализации других мембранных белков (например., ГАМК-рецепторов и кальций-активируемых калиевых [BK] каналов) в стержневых сетчатки биполярные синапсов 35.
Несколько факторов имеют решающее значение для успеха этого протокола. Во-первых, быстро и нежно фиксация является первым важным шагом для сохранения антигенности и тонкой структуры. Во-вторых, протокол "рН-сдвиг" для фиксации выгодно для оптимального обнаружения антигенных эпитопов и хорошей ультраструктурным сохранения 36. В-третьих, сублимационной замещение сохраняет антигенность рецепторов, сохраняя достаточную тонкую структуру. В-четвертых, во immunogold окрашивания, TBST буфером (с Тритон Х-100) используется с инкубации антитела, в то время как TBS буфера (без Тритон Х-100) используетсядля стирки между и после инкубации антител; это может свести к минимуму изменения в тонкой структуре. В-пятых, при обмене решений, секции поддерживаться во влажном состоянии, чтобы уменьшить помехи, вызванные сушки ткани.
Хотя протокол immunogold postembedding описано здесь обеспечивает повышенную способ идентификации мембранные рецепторы на сетчатке глаза лентой синапса, это не совсем так чувствительны, как preembedding иммуногистохимических методов; но последние не является хорошим вариантом, потому что они страдают от относительно низкой специфичности и менее поддается количественной как отмечалось выше. Наш протокол также компрометирует тонкую структуру, в некоторой степени, по сравнению с более сильно фиксированной ткани не подготовленной к иммунноокрашивания. Надеемся, что будущие нововведения преодолеть эти ограничения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана очный программ Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS) и Национального института глухоты и других расстройств связи (NIDCD), Национальных институтов здравоохранения (NIH). Мы благодарим центр NINDS EM и расширенным ядро NIDCD томография (код # ZIC DC 000081-03) для помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
- Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
- Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
- Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
- Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
- Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
- Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
- Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
- Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
- Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
- Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
- Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
- Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
- Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
- Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
- Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
- Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
- Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
- Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
- Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
- Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
- Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
- Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).
