Introduction
El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en la retina 1. Las células ganglionares de la retina (CGR), que reciben la entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares 2, son las neuronas de salida de la retina que envían información visual al cerebro. Los estudios fisiológicos mostraron que la excitación sináptica de CGR está mediado por los receptores NMDA postsináptico (NMDAR) y los receptores de AMPA (AMPAR) 3,4,5. Aunque las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en CGR están mediados por AMPAR y NMDAR EPSCs 3,5,6,7,8, miniatura espontáneas (mEPSCs) en CGR exhiben solamente un componente mediada por AMPAR 4,5,9. Sin embargo, la reducción de la captación de glutamato reveló un componente NMDAR EPSCs en 5 espontáneas, lo que sugiere que los NMDAR en las dendritas de CGR, pueden estar situados fuera de las sinapsis excitatorias. guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUKs) como PSD-95 que los receptores de neurotransmisores clúster, incluidos los receptores de glutamato y del canal iónicos en los sitios sinápticos, también presentan distintos patrones de expresión subsináptica 10,11,12,13,14.
En las últimas décadas, la inmunohistoquímica confocal y pre-incrustación de microscopio electrónico de inmunohistoquímica (EM) se han empleado para estudiar la expresión del receptor de membrana. Aunque inmunotinción confocal revela patrones amplios de la expresión del receptor, su resolución más baja hace que sea imposible utilizar para distinguir localización subcelular. EM estudios pre-incrustación en la retina de mamíferos indican que las subunidades NMDAR están presentes en elementos postsinápticos en el cono bipolares sinapsis cinta celular 15,16,17. Esto está en contraste con aparente evidencia fisiológica. Sin embargo, la difusión de producto de reacción es un artefacto bien conocido en el método de inmunoperoxidasa pre-incrustación. Por lo tanto, este enfoque no suele dar datos estadísticamente fiables y puede excluir distinción entre la localización en la membrana sináptica frente 18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EnPor otro lado, los datos fisiológicos y anatómicos son consistentes con una localización sináptica de AMPARs en CGR 3,5,7,9,22. Por lo tanto, los receptores de glutamato y MAGUKs en sinapsis cinta de la retina se localizan no sólo a la postsináptica, pero también a los compartimentos de membrana perisynaptic o extrasinápticos. Sin embargo, aún es necesario un análisis cuantitativo de alta resolución de estas proteínas de membrana en una sinapsis cinta de la retina.
Aquí, hemos desarrollado una técnica postembedding EM inmunoelectrónica para examinar la localización subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades de AMPAR y PSD-95, seguido de la estimación del número, la densidad y la variabilidad de estas proteínas en las sinapsis Onto CGR de rata marcado utilizando la toxina del cólera subunidad B (CTB) métodos de rastreo retrógrado.
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Protocol
El cuidado y manejo de los animales estaban en conformidad con el NIH Cuidado de Animales y directrices del Comité de Uso. el día postnatal (P) 15-21 ratas Sprague-Dawley, inyectados con 1-1,2% CTB bilateral a través del colículo superior, se mantuvieron en un 12: 12 horas de luz: oscuridad ciclo.
1. Fijación tejido de la retina
- Reúna los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, 2 fórceps con puntas muy finas, tijeras, papel de filtro de celulosa, pipeta de plástico y un portaobjetos de microscopio.
- Anestesiar la rata en una cámara cerrada con 2,0 ml halotano (un anestésico por inhalación). Determinar la anestesia adecuada por estos métodos: la falta de retirada de la pata trasera después pizca dedo del pie, o la falta de reflejo de parpadeo. Entonces decapitar inmediatamente con una guillotina. Quitar los ojos con un par de tijeras de iris y colocar en un recipiente de vidrio que contenía paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
- Utilizando el microscopio de disección, retire el maízea cortando la parte frontal del globo ocular. Retire la lente y el vítreo de la superficie de la retina interna con fórceps.
- Pelar la esclerótica con las dos pinzas hasta que la retina se aísla de la copa ocular.
- Cortar la retina inmediatamente en 100 - 200 tiras micras de espesor con una navaja de afeitar, y sujeto a la fijación cambio de pH.
- Fijar tiras retina en 4% de paraformaldehído en 0,1 M PB a pH 6,0 para 20 - 30 min y después en paraformaldehído al 4% más 0,01% de glutaraldehído a pH 10,5 para 10 a 20 min a TA.
- Después de varios lavados en PB con 0,15 mM CaCl 2 (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect las tiras de la retina con glicerol (60 min cada uno en 10%, 20%, 30%, a continuación, O / N en 30%) en 0,1 M PB antes de congelar sustitución.
2. Congelación de sustitución
NOTA: Este método de congelación-sustitución es una modificación de un protocolo publicado anteriormente 19,20. Además, es fundamental que los instrumentos son muy fríos (use guantes); otherwise, el tejido puede descongelarse parcialmente cuando se toca con los instrumentos. Todos estos pasos se ejecutan dentro de la cámara de AFS y los instrumentos no se les permite moverse por encima del borde de la cámara. Del mismo modo, una refrigeración adecuada de todos los productos químicos utilizados en la AFS es necesario.
- Sumir a congelar las tiras en la retina de propano líquido a -184 ° C en un instrumento de EM criopreservación (CPC). Usando un pincel fino, colocar las muestras en pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara unidos a los trozos de metal que van en el extremo de las barras se hunden (absorbe y expulsa fuera de amortiguación adicional con el pincel).
- Sumir las varillas en el propano líquido y mantenerlo allí durante aproximadamente 5 segundos, y luego transferir al instrumento de congelación-sustitución automática (AFS), utilizando una pequeña cámara de transporte que se llena con nitrógeno líquido ( 'LN 2 enfrió recipiente de transferencia crio').
- Después de colocar la muestra congelada e instrumentos (fórceps y bisturí) en el AFS, enfriar los instrumentos en la cámara para SEminutos Veral antes de tocar el tejido, o enfriarlas mediante la colocación de las puntas de los instrumentos durante unos segundos en la cámara de transporte pequeño (lleno de nitrógeno líquido ( 'LN 2 enfrió recipiente de transferencia crio')).
- Una vez en la AFS, retire la muestra y el precinto de la colilla utilizando un bisturí fino. Además, mantener el control de flujo de gas de nitrógeno, TF (TF se describe como un "control regulador de LN 2 vaporizador ') abierta durante estos procedimientos.
- Antes de colocar el tejido congelado en los soportes-incrustación planas (es decir, antes de configurar el AFS), cortar un círculo delgada de una hoja de plástico transparente y colocarlo en la parte inferior del soporte de manera que se cubra el fondo de cada pocillo. Esto permite la eliminación relativamente fácil de los bloques de muestras polimerizadas cuando haya terminado.
NOTA: Anteriormente, hemos utilizado un método alternativo a los titulares de incrustación planas, y el empleo de dobles cápsulas de gelatina + Reichert (véase Petralia y Wenthold, 1999) <sup> 20. - Utilice la siguiente secuencia automática en el AFS (usando la terminología de instrumentos): T1 = -90 ° C durante 32 h, S1 = aumento de la temperatura en un 4 ° C / h (11,3 horas), T2 = -45 ° C durante 50 h, S2 = aumento de la temperatura en 5 ° C / h (9 horas), T3 = 0 ° C durante 40 horas (total = 142,3 horas). Se puede tomar de 2 - 4 horas para colocar muestras en el AFS (a -90 ° C) antes de comenzar la secuencia cronometrada.
- Sumergir las secciones congeladas en acetato de uranilo al 1,5% en metanol a -90 ° C durante> 32 h en la AFS. Coloque dos piezas de tejidos (por lo general) en cada uno de los siete pozos en el soporte de aluminio-incrustación plana (tres encajar en el AFS).
- Coloque el tejido + cinta en la uranilo de etilo / metanol en los pocillos y se retire la cinta más tarde, justo antes de comienzo medio de inclusión (tales como Lowicryl HM20) infiltración, si es demasiado difícil de eliminar el tejido de la cinta.
- A continuación, aumentar la temperatura por etapas a -45 ° C (+ 4 ° C por hora; en la secuencia automática).
- Lavar las muestras tres veces en metanol preenfriada, mediante el uso de una pipeta de plástico de punta fina para eliminar la solución de edad de cada soporte de la incrustación de plano, y a continuación, utilizando otra pipeta de plástico estándar de añadir el metanol fresco enfriado previamente.
- Luego, utilizando el mismo método, infiltrarse en las muestras progresivamente con resinas incrustación de baja temperatura como medio de inclusión (HM20 / metanol a 1: 1 y 2: 1, cada uno por 2 hr, seguido de resina pura durante 2 horas y a continuación, cambiar las resinas y mantener O / N).
- Cambie la resina de nuevo el día siguiente, el ajuste del nivel de la resina para alcanzar sólo para el borde superior de los pocillos.
- Polimerizar las muestras (-45 ° C a 0 ° C en secuencia automática; + 5 ° C por hora) con luz UV durante 40 h.
- A continuación, retire las muestras de la AFS. Normalmente, los bloques de muestras todavía muestran cierta coloración rosada en color. Colocar las muestras cercanas a la luz fluorescente en la campana de humos química, a TA S / N o más tiempo hasta que la aplicaciónoído del todo claro.
3. Postembedding EM Inmunoelectrónica La inmunocitoquímica
NOTA: inmunocitoquímica Postembedding se lleva a cabo como se describe 23,24,25.
- Cortar 1 micras secciones con ultramicrotomo, secciones de la mancha con un 1% de toluidina-azul, y examinarlas para la orientación de la sección; orientar el bloque de tejido para alcanzar el plano transversal óptima de corte.
- Cortar 70 cortes ultrafinos nm de grosor con ultramicrotomo y recogerlos en rejillas de ranura de níquel recubiertas de Formvar-carbono.
- Lavar las rejillas una vez en H2O destilada seguido de una solución salina tamponada con Tris (TBS tres veces, tampón Tris 0,05 M, NaCl al 0,7%, pH 7,6) de lavado.
- Incubar rejillas en 20 gotas mu l de BSA al 5% en TBS durante 30 min, y después en 20 gotas mu l de una mezcla que contiene de cabra anti-CTB (1: 3.000) y un anticuerpo para GluN2A una subunidad NMDAR (anti-conejo de 1:50 , GluN2B 1:30), o un anti-conejo GluA2 / 3 (1:30)en TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3 O / N a TA.
- rejillas de lavado en tres gotas separadas (20 l) de TBS (pH 7,6) para 10, 10, y 20 min, seguido de TBS (pH 8,2) durante 5 min.
- Incubar rejillas durante 2 horas en gotas (20 l) de una mezcla que contiene IgG anti-conejo de burro (01:20) acoplado a 10 partículas nm de oro y IgG de burro anti-cabra (1:20) acoplados a partículas de oro 18 nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3.
- Lávese las rejillas en 20 gotas l de TBS (pH 7,6) durante 5, 5 y 10 minutos, a continuación, en agua ultrapura y luego secarlos.
- Rejillas contratinción con acetato de uranilo al 5% y 0,3% de citrato de plomo en H 2 O destilada para 8 y 5 min en condiciones de oscuridad, respectivamente.
- Para los experimentos de etiquetado triple, incubar las redes de O / N a TA con 20 gotas mu l de una mezcla de anti-cabra de CTB (1: 3.000), anti-ratón de PSD-95 (1: 100) y anti-conejo GluN2A (1 : 50). A continuación se incuban las redes durante 2 horas el 2 de0 gotas mu l de una mezcla de IgG acoplado a 18, 10, y 5 partículas de oro nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN 3. Mantener los mismos procedimientos que el doble etiquetado para el lavado y tinción de contraste entre y después de la incubación del anticuerpo.
- Los controles se realizaron en el que los anticuerpos secundarios se aplicaron solos.
- Ver cuadrículas en una EM y digitalizar imágenes. Procesar cifras finales en Adobe Photoshop 6.0 sólo por el brillo y el contraste si es necesario 24.
4. Cuantificación
- Seleccione manualmente las zonas de la capa plexiforme interna (IPL) y sin agujeros o grietas en la ampliación 8,000X, a continuación, el fotomontaje al azar en toda la profundidad del IPL con una ampliación 25,000X.
- Identificar las dendritas de RGC en diadas cono bipolares cuando a) contienen la señal CTB retrógradamente transportado (partículas de oro de gran tamaño), b) las membranas exhiben bien definido, hendiduras, y las densidades postsinápticas, c) contienen al menos dos pequeña parte del oroicles dentro del PSD, o más de una partícula de oro a pequeña a lo largo de la membrana plasmática extrasináptico.
- Recoger 45 - 55 dendritas de CGR, en base a criterios anteriores, para el análisis cuantitativo.
- Medir las longitudes de la PSD y la membrana plasmática de las dendritas extrasynaptic RGC individuales con software ImageJ NIH. Contar partículas de oro dentro de 10 nm de la membrana como asociada a membrana, en base a un espesor promedio de 7-9 nm para la membrana de plasma 26.
- Calcular la densidad de partícula como el número de partículas de oro por micrómetro lineal (oro / m). Medir la distancia entre el centro de cada partícula de oro y el centro de la PSD (para la localización sináptica) o el borde de la PSD (para la ubicación extrasynaptic).
- Realizar análisis estadísticos mediante el software. Utilice dos colas pruebas t para comparar las medias. La conclusión de significación de p <0,05. A menos que se indique lo contrario, los valores del informe como media ± SEM 18.
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Representative Results
Los resultados presentados aquí demuestran sorprendentemente diferentes patrones de localización subsináptica de GluA 2/3 y NMDARs en dendritas de CGR en retina de rata, como se describe previamente 24,25. 77% de GluA 2/3 partículas de inmunomarcaje en los perfiles dendríticas RGC se encuentra dentro de la PSD (Figura 1A), similar a la mayoría de las sinapsis centrales. Sin embargo, NMDARs estaban ubicadas sinápticamente o extrasynaptically. 83% de las partículas de inmunomarcaje GluN2A se localiza en el PSD (Figura 1C, 2A, 2B), preferentemente en las sinapsis OFF y las partículas de oro eran más concentrada en el centro de la PSD (Figura 2C). Por el contrario, la gran mayoría de etiquetado partículas para GluN2B (96%) se encuentra fuera de la PSD (Figura 1B, 2A, 2B), distribuidos principalmente a lo largo de la membrana plasmática extrasynaptic, con la densidad de partículas pico a 180 nm desde el borde de la PSD (Figura 2B). En particular, GluN2B exhibió una preferencia por las sinapsis EN. En un subgrupo de los experimentos, el etiquetado simultáneo de GluN2A, PSD-95 y CTB indicaron que GluN2A y PSD-95 fueron colocalized en el PSD de dendritas OFF de CGR (Figura 1D), donde NR2A estuvo en la membrana dendrítica mientras PSD-95 estaba por debajo de la membrana, lo que sugiere que están anclados en el PSD. Se observó una diferencia significativa en la densidad de oro entre la membrana perisynaptic y las membranas mitocondriales, lo que sugiere un etiquetado específico en la antigua (Figura 2D).
Figura 1. Etiquetado Inmunoelectrónica Mostrando Synaptic y Perisynaptic La localización de los receptores de glutamato en las dendritas de las CGR Etiquetados por CTB. (A): etiquetado doble inmunomarcaje de GluA2 / 3 (10 nm de oro) y la CTB (18 nm de oro). cintas presinápticos indican mediante puntas de flecha. Pequeño gold partículas se agrupan (flecha) en los procesos de PSD RGC. (B) el etiquetado doble inmunomarcaje de GluN2B (10 nm de oro) y la CTB (18 nm de oro); pequeñas partículas de oro (flecha) se encuentran en la membrana plasmática extrasináptico. (C) el etiquetado doble inmunomarcaje de GluN2A (10 nm de oro) y la CTB (18 nm de oro). Al igual que en GluA2 / 3, las pequeñas partículas se agrupan dentro del PSD. (D) inmunomarcaje triple de GluN2A (5 nm de oro), PSD-95 (10 nm de oro) y la CTB (18 nm de oro). GluN2A partículas de oro (flechas pequeñas) y partículas de oro PSD-95 (grandes flechas) son co-localizados dentro del PSD en las dendritas de CGR CTB-positivas individuales. Recuadro: aumento mayor del PSD. Barra de escala: 0,1 micras (A = C = D, B). Estos son nuevos micrografías en base a los datos publicados en Zhang y Diamond 24,25. Por favor, haga clic aquí para competirwa versión más grande de esta figura.
Figura 2. Comparación cuantitativa de NMDAR Localización en RGC dendritas. (A) un histograma que muestra la distribución tangencial de inmunomarcaje para GluN2A (n = 53 perfiles) y GluN2B (n = 56 perfiles) dentro y fuera de la PSD. La región perisynaptic se dividió en 60 recipientes de nm. (B) un histograma que muestra la densidad de etiquetado de partículas de inmunomarcaje para GluN2A (n = 53 perfiles) y GluN2B (n = 56 perfiles). La región perisynaptic se dividió en 180 nm contenedores desde el borde de la PSD. (C) un histograma que muestra la distribución tangencial del número total de partículas de inmunomarcaje para GluN2A (n = 44 perfiles) y GluN2B (n = 3 perfiles) en todos los perfiles con el etiquetado dentro del PSD. (D) Comparación de la densidad de las partículas departículas de inmunomarcaje para GluN2B (n = 53 y 33 perfiles) y GluN2A (n = 9 y 30) en las membranas perisynaptic y la membrana mitocondrial, respectivamente, en los procesos de CGR CTB-positivas. Estos histogramas se modifican a partir de histogramas publicados en Zhang y Diamond 24,25. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito cuatro técnicas para el éxito post incrustar inmunoelectrónica EM cuantitativa: 1) la fijación corta y débil, 2) congelación-sustitución, 3) 4) la cuantificación posterior a la incorporación de tinción inmunoelectrónica, y.
EM inmunoelectrónica permite la detección de proteínas específicas en las secciones de tejido ultrafinas. Anticuerpos marcados con partículas de oro se pueden visualizar directamente mediante EM. Mientras potente en la detección de la localización subsináptica de un receptor de membrana, EM inmunoelectrónica puede ser técnicamente difícil, y requiere la optimización rigurosa de los métodos de fijación de tejidos y de procesamiento.
Para lograr un equilibrio óptimo entre la integridad de la membrana y antigenicidad, hemos probado diferentes métodos de fijación y tiempos. Por ejemplo, un protocolo exitoso usado para postembedding EM NMDAR en las sinapsis centrales 19,20 no pudo detectar inmunorreactividad de NMDAR en la retina. Este estudio empleó fijación suave y tiempos de incubación cortos paraevitar la reducción de la antigenicidad del receptor de NMDA después de fuerte, la fijación prolongada 16.
El método de congelación-sustitución se desarrolló por primera vez para la localización ultraestructural de los receptores de glutamato a principios de 1990 27, y consiste en la infiltración de baja temperatura y la polimerización en una resina no polar, hidrofóbico, HM20 28, necesaria para el etiquetado óptima postembedding inmunoelectrónica. El método de congelación-sustitución específica utilizada aquí fue desarrollado para los receptores de glutamato de etiquetado en la cóclea 29 y optimizado para receptores de glutamato en las sinapsis centrales 18,19,20,30, y se ha modificado adicionalmente en los últimos años. La infiltración baja temperatura y la polimerización de la resina ayuda a conservar la antigenicidad de las moléculas termolábiles y minimiza la extracción de lípidos y las reacciones químicas adversas entre la resina y el tejido 19,31. En combinación con los métodos de fijación descrito anteriormente, esta congelación-sustitución método provides buena antigenicidad y conservación estructural razonable.
La técnica postembedding inmunoelectrónica utilizado aquí tiene varias ventajas en comparación con el método de inmunoperoxidasa preembedding. Aunque el método de inmunoperoxidasa preembedding tiene mayor sensibilidad 15,16,17,19,20,21, la difusión de producto de la reacción es inevitable, lo que resulta en el etiquetado no específica 26,32. Por otra parte, la reacción de la enzima peroxidasa no es lineal 21, por lo que es difícil evaluar cuantitativamente la localización precisa de subsináptica receptores 18,21. El método postembedding inmunoelectrónica emplea un marcador no difusible y realiza la inmunoreacción en la superficie de tejido embebido en resina, lo que reduce artefactos difusibles y permite una mayor resolución espacial 18,33,34. Las partículas de oro pueden ser contados directamente, por otra parte, por lo que es posible estimar el número, la densidad y la variabilidad de estos receptores en syn cinta retinalábsides. Además, postembedding inmunoelectrónica permite la localización de múltiples receptores a ser examinado de forma simultánea en el nivel EM. Este protocolo se ha empleado con éxito en la identificación de la localización de otras proteínas de membrana (por ejemplo., Los receptores de GABA y de potasio [BK] canales de calcio activados) en la barra de la retina sinapsis bipolares 35.
Hay varios factores que son cruciales para el éxito de este protocolo. En primer lugar, rápida y cuidadosa de fijación es el primer paso importante para la preservación de antigenicidad y estructura fina. En segundo lugar, el protocolo de "cambio de pH" para la fijación es beneficioso para la detección óptima de los epítopos antigénicos y buena conservación ultraestructural 36. En tercer lugar, congelación-sustitución conserva la antigenicidad de los receptores, mientras que el mantenimiento de estructura fina razonable. En cuarto lugar, durante la tinción inmuno, tampón TBST (con Triton X-100) se usa con la incubación de anticuerpos, mientras tampón TBS (sin Triton X-100) se utilizapara el lavado entre y después de la incubación de los anticuerpos; esto puede reducir al mínimo las alteraciones en la estructura fina. En quinto lugar, durante el intercambio de soluciones, las secciones se mantienen húmedo para reducir los artefactos causados por el secado del tejido.
Aunque el protocolo inmunoelectrónica postembedding descrito aquí proporciona un método mejorado para la identificación de receptores de membrana en la sinapsis de la cinta de la retina, que no es tan sensible como preembedding métodos inmunohistoquímicos; pero estos últimos no son una buena opción porque sufren de especificidad relativamente bajo y son menos susceptibles de cuantificación como se señaló anteriormente. El protocolo también compromete la estructura fina, en cierta medida, en comparación con el tejido con más fuerza fija no preparado para immunolabeling. Con suerte, las futuras innovaciones superar estas limitaciones.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los programas internos del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) y el Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación (NIDCD), de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Agradecemos a la instalación NINDS EM y el núcleo NIDCD avanzada de imagen (código # ZIC DC 000081-03) para obtener ayuda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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