Introduction
Glutamat ist der hauptsächliche exzitatorische Neurotransmitter im Netzhaut 1. Retinalen Ganglienzellen (RGC), glutamatergen synaptischen Input von bipolaren Zellen 2 sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut erhalten, die visuelle Information an das Gehirn senden. Physiologische Untersuchungen zeigten, dass die synaptische Erregung von RGCs vermittelt wird postsynaptisch von NMDA-Rezeptoren (NMDARs) und AMPA-Rezeptoren (AMPARs) 3,4,5. Obwohl exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in RGCs durch AMPARs und NMDARs 3,5,6,7,8, zeigen spontane Miniatur EPSCs (mEPSCs) auf RGCs vermittelt werden nur eine AMPARs vermittelte Komponente 4,5,9. Allerdings ergab Glutamataufnahme Reduktion eines NMDAR Komponente in spontanen EPSCs 5, was darauf hindeutet, dass NMDARs auf RGC Dendriten können außerhalb von Synapsen befinden. Membranassoziierten Guanylat-Kinasen (MAGUKs) wie PSD-95, dass Cluster Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich Glutamat-Rezeptoren und Ionenkanals bei synaptischen Websites, auch deutliche subsynaptischen Expressionsmuster 10,11,12,13,14 aufweisen.
In den letzten Jahrzehnten konfokalen Immunhistochemie und Pre-Einbettung Elektronenmikroskop (EM) Immunhistochemie wurden zu studieren Membran-Rezeptor-Expression eingesetzt. Obwohl konfokalen Immunfärbung breites Muster der Rezeptorexpression offenbart, macht seine geringere Auflösung unmöglich subzellulären Ort zu unterscheiden zu können. Pre-Einbettung EM-Studien in Säugernetzhaut zeigen, dass NMDAR Untereinheiten in postsynaptischen Elemente bei Konus Bipolarzelle Band Synapsen 15,16,17 vorhanden sind. Dies ist in der scheinbaren Gegensatz zu physiologischen Beweise. Jedoch Diffusion von Reaktionsprodukt ist ein bekannter Artefakt in der Pre-Einbettungs Immunperoxidase-Verfahren. Daher ist dieser Ansatz nicht in der Regel statistisch verlässliche Daten geben und Unterscheidung zwischen Lokalisierung zu synaptischen Membran gegen extrasynaptischen Membran 18,19,20,21 ausschließen. Aufdie andere Hand, physiologischen und anatomischen Daten sind mit einem synaptischen Lokalisation von AMPARs auf RGCs 3,5,7,9,22 konsistent. Somit Glutamatrezeptoren und MAGUKs bei Netzhautband Synapse nicht nur lokalisiert der postsynaptischen sondern auch auf die perisynaptic oder extrasynaptischen Membran Fächern. Jedoch ist ein hochauflösender quantitative Analyse dieser Membranproteine in einer Netzhautband Synapse wird noch benötigt.
Hier entwickelten wir ein postembedding EM Immunogold Technik die subsynaptischen Lokalisierung von NMDAR-Untereinheiten, AMPAR Untereinheiten und PSD-95, gefolgt von der Schätzung der Anzahl, Dichte und die Variabilität dieser Proteine an Synapsen auf Ratten RGCs untersucht markierten Choleratoxin-Untereinheit B mit (CTB) Rückverfolgung Methoden.
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Protocol
Pflege und Betreuung von Tieren waren nach NIH Animal Care und Use Committee Guidelines. 12-Stunden-Licht: postnatalen Tag (P) 15-21 Sprague-Dawley-Ratten injiziert mit 1-1,2% CTB bilateral durch den Colliculus superior, wurden auf einem 12 gehalten Dunkel-Zyklus.
1. Netzhautgewebe Fixation
- Setzen Sie die folgenden Materialien und Werkzeuge: einem Binokular, 2 Zangen mit sehr feinen Spitzen, Schere, Zellulosefilterpapier, Plastikpipette und einem Objektträger.
- Anesthetize die Ratte in einer geschlossenen Kammer mit 2,0 ml Halothan (ein Inhalationsanästhesie). Bestimmen ausreichende Betäubung mit diesen Methoden: Mangel Zurücknahme der Hinterpfote nach Zeh Prise, oder das Fehlen von Blinkreflex. Dann enthaupten sofort mit einer Guillotine. Entfernen Sie die Augen mit einem Paar von Iris Schere und in eine Glasschale mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) bei pH 7,4.
- das Binokular Entfernen Sie mit den Maisea durch die Vorderseite des Augapfels abzuschneiden. Entfernen Sie die Linse und Glas von der inneren Netzhautoberfläche mit einer Pinzette.
- Ziehen Sie die Lederhaut mit den beiden Zangen, bis die Netzhaut von der Augenmuschel isoliert ist.
- Schneiden Sie die Netzhaut sofort in 100 bis 200 & mgr; m-dicke Streifen mit einer Rasierklinge, und je nach pH-Shift-Fixierung.
- Fix Retina Streifen in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB bei pH 6,0 für 20 - 30 min und dann in 4% Paraformaldehyd und 0,01% Glutaraldehyd bei pH 10,5 für 10 - 20 min bei RT.
- Nach mehrmaligem Waschen in PB mit 0,15 mM CaCl 2 (pH 7,4 bei 4 ° C), cryoprotect die Netzhautstreifen mit Glycerin (60 min jeweils in 10%, 20%, 30%, dann O / N in 30%) in 0,1 M PB vor Substitution einzufrieren.
2. Gefriersubstitution
HINWEIS: Diese gefrierSubstitutionsMethode aus einer früheren veröffentlichten Protokoll 19,20 modifiziert wird. Auch ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Instrumente sehr kalt sind (Handschuhe); Otherwise, kann das Gewebe teilweise aufzutauen, als mit den Instrumenten berührt. Alle diese Schritte werden in der AFS Kammer und der sie durchgeführt werden niemals über den Rand der Kammer bewegen kann. In ähnlicher Weise eine ausreichende Kühlung aller im AFS verwendeten Chemikalien notwendig.
- Stech einfrieren die Netzhautstreifen in flüssigem Propan bei -184 ° C in einem EM Kryokonservierung Instrument (CPC). Mit einem feinen Pinsel, legen Sie die Proben auf kleine Stücke von doppelseitigem Klebeband auf die Metallstümpfe befestigt, die auf dem Ende der Eintauchstangen gehen (Docht aus zusätzlichen Puffer mit dem Pinsel).
- Tauchen Sie die Stangen in die flüssige Propan und halten es für ca. 5 sec, und dann übertragen auf die automatische gefrier Substitution Instrument (AFS) ein kleines Transportkammer verwenden, die mit flüssigem Stickstoff ( "LN 2 gekühlt Kryo Transferbehälter ') gefüllt ist.
- die gefrorene Probe und Instrumente (Zange und Skalpell) in den AFS, kühlen die Instrumente in der Kammer nach der Platzierung für seVeral Minuten, bevor Sie das Gewebe zu berühren, oder sie kühlen, indem die Spitzen der Instrumente für ein paar Sekunden in die kleine Transportkammer platzieren (gefüllt mit flüssigem Stickstoff ( "LN 2 gekühlt Kryo Transferbehälter ')).
- Einmal in der AFS, entfernen Sie die Probe und das Klebeband von der Stummel einer feinen Skalpell. Auch halten die Stickstoffgasflusssteuerung, TF (TF wird als "Regler-Steuerung für LN2 Verdampfer" bezeichnet) geöffnet während dieser Vorgänge.
- Vor dem gefrorenen Gewebe in die Flach Einbettung Halter zu platzieren (dh vor den AFS-Einrichtung), Schnitt einen dünnen Kreis aus einem klaren Kunststofffolie und legen Sie sie in den unteren Teil der Halterung, um den Boden jeder Vertiefung zu füllen. Auf diese Weise können relativ leichteres Entfernen der polymerisierten Blöcken Probe, wenn Sie fertig.
HINWEIS: Früher haben wir genutzt, ein alternatives Verfahren zu den flachen Einbettung Halter und Doppel Reichert + Gelatinekapseln unter Verwendung (siehe Petralia und Wenthold, 1999) <sup> 20. - Verwenden Sie die folgende automatische Sequenz in der AFS (unter Verwendung Instrument Terminologie): T1 = -90 ° C für 32 h, S1 = Zunahme Temperatur von 4 ° C / h (11,3 h), T2 = 45 ° C für 50 h, S2 = Temperaturanstieg von 5 ° C / h (9 hr), T3 = 0 ° C für 40 Stunden (gesamt = 142,3 h). 4 Stunden Proben in der AFS zu platzieren (bei -90 ° C), bevor die Zeitabfolge beginnen - Es kann 2 nehmen.
- Tauchen die Gefrierschnitte in 1,5% Uranylacetat in Methanol bei -90 ° C für> 32 Stunden in dem AFS. Legen Sie zwei Stücke von Gewebe (in der Regel) in jedem der sieben Brunnen im Flach Einbettung Aluminiumhalter (drei passen in die AFS).
- Platzieren der Gewebe + Band in das Uranylacetat / Methanol in den Vertiefungen und entfernen das Band später, unmittelbar vor dem Beginn Einbettungsmedium (zB Lowicryl HM20) Infiltration, wenn es zu schwierig ist, das Gewebe von dem Band zu entfernen.
- Dann wird die Temperatur schrittweise erhöhen bis -45 ° C (+ 4 ° C pro Stunde; in der automatischen Sequenz).
- Waschen Sie die Proben dreimal in vorgekühlte Methanol, um einen spitzen Plastikpipette mit der alten Lösung von jedem Flach Einbettung Halter, und dann mit einem anderen Standard-Kunststoff-Pipette zu entfernen Sie die vorgekühlt frischem Methanol hinzuzufügen.
- Dann mit der gleichen Methode, infiltrieren die Proben schrittweise mit niedriger Temperatur Einbettung Harze wie Einbettungsmedium (HM20 / Methanol im Verhältnis 1: 1 und 2: 1, jeweils für 2 Stunden, gefolgt von Reinharz für 2 Stunden und dann die Harze ändern und halten O / N).
- Ändern Sie den Harz am nächsten Tag wieder, das Niveau des Harzes Einstellung nur bis zur Oberkante der Brunnen zu erreichen.
- Polymerisation der Proben (-45 ° C bis 0 ° C in automatischer Folge; + 5 ° C pro h) mit UV-Licht für 40 Stunden.
- Dann entfernen Sie die Proben aus der AFS. Typischerweise zeigen Probenblöcke noch etwas rosa Haut und in Farbe. Legen Sie die Proben der Nähe des Leuchtstofflampe in der chemischen Abzugshaube, bei RT O / N oder mehr, bis sie AppOhr ganz klar.
3. Postembedding EM Immungold Immunzytochemie
HINWEIS: Postembedding Immunzytochemie wird wie beschrieben durchgeführt 23,24,25.
- Cut 1 & mgr; m Abschnitte mit Ultramikrotoms, Fleck Abschnitte mit 1% Toluidin-Blau, und untersuchen sie für Abschnitt Orientierung; Ausrichten der Gewebeblock, um die optimale Querebene Schnitt erreichen.
- Cut 70 nm dicke Ultradünnschnitten mit Ultramikrotoms und sammeln sie auf Formvar-Kohlenstoff beschichteten Nickel-Spiel Gitter.
- Wash Gitter einmal in destilliertem H 2 O durch eine Tris-gepufferte Kochsalzlösung, gefolgt dreimal (TBS, 0,05 M Tris-Puffer, 0,7% NaCl, pH 7,6) waschen.
- Inkubieren Gitter in 20 ul Tropfen 5% BSA in TBS für 30 min und dann in 20 ul Tropfen einer Mischung Ziegen-Anti-CTB (1: 3000) enthält, und ein Antikörper gegen ein NMDAR-Untereinheit (anti-rabbit GluN2A 1.50 , GluN2B 1:30) oder ein Anti-Kaninchen GluA2 / 3 (1:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) mit 2% BSA und 0,02 M NaN & sub3; O / N bei RT.
- Wash Gitter auf drei getrennte Tropfen (20 ul) von TBS (pH 7,6) für 10, 10 und 20 min, gefolgt von TBS (pH 8,2) für 5 min.
- Inkubieren Gitter für 2 h auf Tropfen (20 ul) einer Mischung Esel-anti-Kaninchen-IgG (1:20), der mit 10 nm Goldpartikel und Esel anti-Ziege IgG (1:20), der mit 18 nm Goldpartikel in TBST enthaltend (pH 8,2) mit 2% BSA und 0,02 M NaN 3.
- Waschen Sie Netze in 20 ul Tropfen TBS (pH 7,6) für 5, 5 und 10 Minuten, dann in ultrareinem Wasser und trocknen Sie sie dann.
- Gegenfärbung Gitter mit 5% Uranylacetat und 0,3% Blei Citrat in destilliertem H 2 O 8 und 5 min bei schlechten Lichtverhältnissen auf.
- Für Dreifachmarkierungsexperimente, inkubieren Gitter O / N bei RT mit 20 ul Tropfen einer Mischung von Anti-Ziege-CTB (1: 3000), anti-Maus-PSD-95 (1: 100) und anti-Kaninchen GluN2A (1 : 50). Dann brüten Gitter für 2 Stunden auf 20 ul Tropfen einer Mischung von IgGs gekoppelt bis 18, 10 und 5 nm Goldpartikel in TBST (pH 8,2) mit 2% BSA und 0,02 M NaN 3. Halten Sie die gleichen Verfahren wie Doppelmarkierung zum Waschen und Gegenfärbung zwischen und nach Antikörper-Inkubation.
- Die Kontrollen wurden in dem die sekundären Antikörpern durchgeführt wurden allein aufgebracht.
- Ansicht Gitter auf einem EM und digitalisieren Bilder. Prozess endgültigen Zahlen in Adobe Photoshop 6.0 nur für Helligkeit und Kontrast, wenn es notwendig ist 24.
4. Quantifizierung
- Zur manuellen Einstellung der Bereiche der inneren plexiformen Schicht (IPL), ohne Löcher oder Risse an 8,000X Vergrößerung, dann Fotomontage zufällig die volle Tiefe von IPL in 25,000X Vergrößerung.
- Identifizieren RGC Dendriten an Konus bipolaren Dyaden, wenn sie a) enthalten die retrograd transportiert CTB Signal (große Goldpartikel), b) zeigen wohldefinierte Membranen, Spalten und postsynaptischen Dichte, c) mindestens zwei kleine Gold Teil enthaltenicles innerhalb des PSD, oder mehr als eine kleine Goldpartikel entlang der extrasynaptischen Plasmamembran.
- Sammeln Sie 45 - 55 RGC Dendriten, basierend auf obigen Kriterien, für die quantitative Analyse.
- Messen der Längen der PSD und dem extrasynaptischen Plasmamembran von einzelnen RGC Dendriten mit NIH ImageJ Software. Graf Goldpartikel innerhalb von 10 nm der Membran als Membran-assoziierte, basierend auf einer durchschnittlichen Dicke von 7-9 nm für die Plasmamembran 26.
- Berechnen Partikeldichte als die Anzahl von Goldpartikeln pro linearem Mikrometer (gold / um). Den Abstand zwischen der Mitte jedes Goldpartikel und der Mitte des PSD (für synaptische Ort) oder den Rand des PSD (für extrasynaptischen location).
- Führen Sie eine statistische Analyse von Software. Verwenden zweiseitigen t-Tests Mittel zu vergleichen. Folgern Bedeutung, wenn P <0,05. Wenn nicht anders angegeben, Bericht Werte als Mittelwert ± SEM 18.
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Representative Results
Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen deutlich unterschiedliche subsynaptischen Lokalisierungsmuster GluA 2/3 und NMDARs auf RGC Dendriten in Rattennetzhaut, wie zuvor 24,25 beschrieben. 77% der GluA 2/3 Immunogold Partikel in RGC dendritischen Profile wurden in der PSD (1A) befindet, ähnlich wie die meisten zentralen Synapsen. Allerdings wurden NMDARs sich entweder synaptisch oder extrasynaptically. 83% der GluN2A Immunogold Teilchen wurden in dem PSD lokalisiert (1C, 2A, 2B), bevorzugt an Synapsen OFF, und die Goldpartikel waren konzentrierter in der Mitte des PSD (2C). Im Gegensatz dazu waren die große Mehrheit der Teilchen Kennzeichnung GluN2B (96%) außerhalb des PSD (1B, 2A, 2B), hauptsächlich entlang der extrasynaptischen Plasmamembran verteilt, wobei die Spitzenpartikeldichte bei 180 nm von der Kante des PSD (2B). Insbesondere zeigte GluN2B eine Vorliebe für ON Synapsen. In einer Untergruppe von Experimenten gleichzeitige Kennzeichnung GluN2A, PSD-95 und CTB zeigten, dass GluN2A und PSD-95 in der PSD von OFF RGC Dendriten (Figur 1D) kolokalisiert wurden, wo NR2A in dem dendritischen Membran war während PSD-95 unter war die Membran darauf hindeutet, dass sie an der PSD verankert sind. Ein signifikanter Unterschied in der Dichte zwischen Gold perisynaptic Membran und mitochondrialen Membranen beobachtet wurde, eine spezifische Markierung in der früheren (2D) hindeutet.
Abbildung 1. Immunogoldmarkierung Zeige Synaptic und Perisynaptic Lokalisierung von Glutamatrezeptoren bei RGC Dendriten beschriftet von CTB. (A): double Immunogoldmarkierung von GluA2 / 3 (10 nm Gold) und CTB (18 nm Gold). Präsynaptischen Bänder durch Pfeilspitzen markiert. kleine gold Partikel Clustered (Pfeil) in den PSD von RGC Prozesse. (B) Doppel Immunogoldmarkierung von GluN2B (10 nm Gold) und CTB (18 nm Gold); kleine Goldpartikel (Pfeil) sind auf der extrasynaptischen Plasmamembran. (C) Doppel Immunogoldmarkierung von GluN2A (10 nm Gold) und CTB (18 nm Gold). Ähnlich GluA2 / 3 werden kleine Partikel innerhalb des PSD geclustert. (D) Dreibettzimmer Immunogoldmarkierung von GluN2A (5 nm Gold), PSD-95 (10 nm Gold) und CTB (18 nm Gold). GluN2A Goldteilchen (kleine Pfeile) und PSD-95 Goldpartikel (große Pfeile) sind co-lokalisiert innerhalb der PSD auf einzelne CTB-positive RGC Dendriten. Einschub: stärkere Vergrößerung des PSD. Maßstab: 0,1 um (A = C = D, B). Das sind neue mikroskopische Aufnahmen basiert auf Daten veröffentlicht in Zhang und Diamant 24,25. Bitte klicken Sie hier um zu wetteifernwa größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. quantitativen Vergleich von NMDAR Lokalisierung in RGC Dendriten. (A) Ein Histogramm der tangentialen Verteilung von Immun für GluN2A zeigt (n = 53 Profile) und GluN2B (n = 56 Profile) innerhalb und außerhalb des PSD. Die perisynaptic Region wurde in 60 nm Bins aufgeteilt. (B) Ein Histogramm Markierungsdichte von Immunogold Teilchen für GluN2A zeigt (n = 53 Profile) und GluN2B (n = 56 Profile). Die perisynaptic Region wurde in 180 nm Bins vom Rand des PSD unterteilt. (C) ein Histogramm, das die tangentiale Verteilung der Gesamtzahl der Teilchen für Immunogold GluN2A (n = 44 Profile) und GluN2B (n = 3 Profile) bei allen Profilen mit Kennzeichnung im PSD zeigt. (D) Vergleich der TeilchendichteImmungoldpartikel für GluN2B (n = 53 und 33 Profile) und GluN2A (n = 9 und 30) in den Membranen und perisynaptic Mitochondrienmembran, jeweils in den CTB-positive RGC Prozesse. Diese Histogramme werden aus Histogrammen veränderte veröffentlichte in Zhang und Diamant 24,25. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir haben vier beschriebenen Techniken für eine erfolgreiche quantitative Post-Einbettung Immun EM: 1) kurze und schwache Fixierung, 2) Gefriersubstitution, 3) nach dem Einbetten von Immunfärbung und 4) Quantifizierung.
EM Immunogold ermöglicht den Nachweis von spezifischen Proteinen in ultradünne Gewebeschnitten. Markierte Antikörper mit Goldpartikeln kann direkt unter Verwendung von EM visualisiert werden. Während mächtig in die subsynaptischen Lokalisierung eines Membranrezeptors zu erfassen, kann EM Immun technisch anspruchsvoll sein und erfordert konsequente Optimierung von Methoden der Fixierung und Verarbeitung Gewebe.
Um eine optimale Balance zwischen Membranintegrität und Antigenität schlagen, testeten wir verschiedene Befestigungsmethoden und Zeiten. Zum Beispiel für postembedding EM NMDAR ein erfolgreiches Protokoll an zentralen Synapsen 19,20 verwendet fehlgeschlagen NMDAR Immunreaktivität in der Netzhaut zu erfassen. Diese Studie sanfte Fixierung und kurze Inkubationszeiten eingesetztReduzierung von NMDA-Rezeptor-Antigenität vermeiden, nachdem starke, lang anhalt Fixierung 16.
Das gefrierSubstitutionsMethode wurde erstmals für ultrastrukturelle Lokalisierung von Glutamat-Rezeptoren in den frühen 1990er Jahren 27 entwickelt und beinhaltet niedriger Temperatur Infiltration und Polymerisation in einem unpolaren, hydrophoben Harz, HM20 28, erforderlich für eine optimale postembedding Immunogoldmarkierung. Die spezifische gefrierSubstitutionsMethode hier verwendet wurde für die Markierung Glutamat-Rezeptoren in der Cochlea für Glutamat-Rezeptoren im zentralen Synapsen 18,19,20,30, 29 und optimiert entwickelt, und es hat in den letzten Jahren weiter modifiziert. Die niedrige Temperatur Infiltration und Polymerisation des Harzes hilft Antigenität von hitzelabile Moleküle zu erhalten und minimiert Lipidextraktion und unerwünschte chemische Reaktionen zwischen Harz und Gewebe 19,31. In Kombination mit den oben beschriebenen Methoden Fixierung dieses gefrierSubstitutionsMethode provides gut Antigenität und vernünftige Strukturerhaltung.
Die postembedding Immunogold Technik verwendet hier hat mehrere Vorteile gegenüber dem preembedding Immunperoxidase-Verfahren. Obwohl die preembedding Immunperoxidase Methode höhere Empfindlichkeit 15,16,17,19,20,21 hat die Diffusion von Reaktionsprodukt ist unvermeidlich, was zu unspezifische Markierung 26,32. Darüber hinaus wird das Peroxidase-Enzym 21 Reaktion nicht linear, es schwierig quantitativ zu 18,21 die genaue Lokalisierung von Rezeptoren subsynaptischen Herstellung bewerten. Die postembedding Immunogold Verfahren verwendet eine nicht-diffusionsfähige Marker und führt die Immunreaktion auf der Oberfläche des Harz-eingebettetem Gewebe, die diffusionsfähige Artefakte und ermöglicht eine höhere räumliche Auflösung 18,33,34 reduziert. Goldpartikel direkt gezählt werden können, Darüber hinaus ist es möglich macht, die Anzahl, Dichte und die Variabilität dieser Rezeptoren bei Netzhautband syn zu schätzenApsiden. Zusätzlich Immunogold postembedding ermöglicht die Lokalisierung von mehreren Rezeptoren gleichzeitig an der EM-Ebene untersucht werden. Dieses Protokoll wurde bei der Identifizierung Lokalisierung von anderen Membranproteinen (z. B. GABA-Rezeptoren und Calcium-aktivierten Kalium [BK] Kanäle) in retinalen bipolaren Stange Synapsen 35 erfolgreich eingesetzt.
Mehrere Faktoren sind für den Erfolg dieses Protokolls entscheidend. Erstens, schnelle und schonende Fixierung ist der erste wichtige Schritt für die Erhaltung der Antigenität und Feinstruktur. Zweitens, die "pH-Verschiebung" Protokoll für die Fixierung ist für eine optimale Erkennung der antigenen Epitope und gute ultrastrukturelle Konservierung 36 von Vorteil. Drittens Gefriersubstitution erhält die Antigenität der Rezeptoren, während angemessene Feinstruktur erhalten bleibt. Viertens, während Immungoldfärbung, TBST-Puffer (mit Triton X-100) mit Antikörper-Inkubation verwendet wird, während TBS-Puffer (ohne Triton X-100) verwendet wird,zum Waschen zwischen und nach der Inkubation von Antikörpern; Dies kann Veränderungen in der Feinstruktur zu minimieren. Fünftens, während Austausch von Lösungen, Abschnitte sind feucht gehalten Artefakte, die durch Gewebe Trocknung zu reduzieren.
Während die postembedding Immunogold hier beschriebene Protokoll zur Identifizierung von Membranrezeptoren auf der Netzhaut-Farbband Synapse ein verbessertes Verfahren bereitstellt, ist es nicht ganz so empfindlich wie preembedding immunhistochemische Methoden; aber diese sind keine gute Wahl, da sie aus relativ geringere Spezifität leiden und sind weniger zugänglich für die Quantifizierung, wie oben erwähnt. Unser Protokoll beeinträchtigt auch Feinstruktur zu einem gewissen Grad im Vergleich zu stärker fixierten Gewebes nicht für Immunmarkierung hergestellt. Wir hoffen, dass zukünftige Innovationen diese Einschränkungen zu überwinden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Interne Programme des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) und National Institute on Taubheit und andere Communication Disorders (NIDCD), von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Wir danken dem NINDS EM Anlage und die NIDCD Advanced Imaging-Kern (Code # ZIC DC 000081-03) um Hilfe.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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