Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

Published: February 18, 2016 doi: 10.3791/53547
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

Introduction

الغلوتامات هو ناقل عصبي مثير رئيسيا في شبكية العين 1. خلايا الشبكية العقدة (RGCs)، وتلقي مدخلات متشابك glutamatergic من خلايا القطبين 2، هي الخلايا العصبية الناتج من شبكية العين التي ترسل المعلومات البصرية إلى الدماغ. وأظهرت الدراسات الفسيولوجية التي الإثارة متشابك من RGCs وتتوسط postsynaptically بواسطة مستقبلات NMDA (NMDARs) ومستقبلات أمبا (AMPARs) 3،4،5. وعلى الرغم من توسط التيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) في RGCs بواسطة AMPARs وNMDARs 3،5،6،7،8، عفوية EPSCs مصغرة (mEPSCs) على RGCs يحمل فقط عنصرا بوساطة AMPARs-4،5،9. ومع ذلك، والحد من امتصاص الغلوتامات كشف عنصرا NMDAR في EPSCs عفوية 5، مما يشير إلى أن NMDARs على التشعبات RGC قد تكون موجودة خارج نقاط الاشتباك العصبي مثير. تحركات guanylate غشاء المرتبطة (MAGUKs) مثل PSD-95 أن مستقبلات الناقل العصبي العنقودية، بما في ذلك مستقبلات الغلوتامات والقناة الايونيةالصورة في مواقع متشابك، أيضا يحمل متميزة أنماط التعبير تحت المشبك 10،11،12،13،14.

وعلى مدى العقود الأخيرة، المناعية مبائر وقبل تضمين المجهر الإلكتروني (EM) المناعية المستخدمة لدراسة التعبير مستقبلات الغشاء. على الرغم من أن المناعية متحد البؤر يكشف أنماط واسعة من التعبير مستقبلات، أقل قرارها يجعل من المستحيل استخدامها لتمييز موقع التحت خلوية. وتشير تضمين مسبقة الدراسات EM في شبكية العين الثدييات أن مفارز NMDAR موجودة في العناصر بعد المشبكي في مخروط القطبين نقاط الاشتباك العصبي خلية الشريط 15،16،17. هذا هو على النقيض الواضح على الأدلة الفسيولوجية. ومع ذلك، نشر ناتج التفاعل هو قطعة أثرية معروفة في طريقة المناعي قبل التضمين. وبالتالي، فإن هذا النهج لا تعطي عادة بيانات موثوقة إحصائيا وقد تستبعد التمييز بين التعريب لغشاء متشابك مقابل 18،19،20،21 غشاء extrasynaptic. علىمن ناحية أخرى، البيانات الفسيولوجية والتشريحية تتفق مع التعريب متشابك من AMPARs على RGCs 3،5،7،9،22. وبالتالي، يتم ترجمة مستقبلات الغلوتامات وMAGUKs في المشبك الشريط شبكية العين ليس فقط على بعد المشبكي ولكن أيضا لالمقصورات غشاء perisynaptic أو extrasynaptic. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تحليل كمي عالية الدقة من هذه البروتينات الغشاء في المشبك الشريط في شبكية العين.

هنا، قمنا بتطوير تقنية postembedding EM immunogold لدراسة توطين تحت المشبك من مفارز NMDAR، مفارز AMPAR وPSD-95 تليها تقدير عدد وكثافة وتنوع هذه البروتينات في نقاط الاشتباك العصبي على RGCs الفئران المعنون باسم باستخدام الكوليرا السم الوحيدات ب (CTB) طرق تتبع الوراء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الرعاية وكان التعامل مع الحيوانات وفقا المعاهد الوطنية للصحة ورعاية الحيوان والمبادئ التوجيهية للجنة استخدام. واستمرت يوم بعد الولادة (P) 15-21 الفئران سبراغ داولي، حقن 1-1،2٪ CTB ثنائيا من خلال أكيمة متفوقة، على 12: ضوء لمدة 12 ساعة: دورة الظلام.

1. الشبكية تثبيت الأنسجة

  1. تجميع المواد التالية وأدوات: مجهر تشريح، 2 ملقط مع نصائح جيدة جدا، ومقص، ورقة فلتر السليلوز، ماصة بلاستيكية وشريحة المجهر.
  2. تخدير الفئران في غرفة مغلقة مع 2.0 مل الهالوثان (مخدر نشوق). تحديد التخدير الكافي من هذه الأساليب: عدم الانسحاب من مخلب الخلفي بعد قرصة أخمص القدمين، أو عدم وجود رد فعل طرفة. ثم قطع رأس مباشرة مع المقصلة. إزالة العينين مع مقص القزحية ووضعها في وعاء زجاجي يحتوي على 4٪ لامتصاص العرق في 0.1 م العازلة الفوسفات (PB) في 7.4 درجة الحموضة.
  3. باستخدام مجهر تشريح، وإزالة الذرةعصام بقطع الجزء الأمامي من مقلة العين. إزالة العدسة والجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية مع ملقط.
  4. قشر الصلبة مع ملقط اثنين حتى يتم عزل شبكية العين من فنجان العين.
  5. قطع شبكية العين على الفور إلى 100-200 ميكرون شرائح سميكة بشفرة الحلاقة، وتخضع لتثبيت الرقم الهيدروجيني التحول.
  6. إصلاح شرائط شبكية العين في 4٪ امتصاص العرق في 0.1 م PB في درجة الحموضة 6.0 ل 20 - 30 دقيقة ثم في 4٪ امتصاص العرق بالإضافة إلى 0.01٪ غلوتارالدهيد في درجة الحموضة 10.5 عن 10-20 دقيقة في RT.
  7. بعد عدة غسلات في الجريدة الرسمية مع 0.15 ملي CaCl 2 (7.4 درجة الحموضة في 4 درجة مئوية)، cryoprotect شرائح الشبكية مع الجلسرين (60 دقيقة لكل منهما في 10٪، 20٪، 30٪، ثم O / N في 30٪) في 0.1 م قبل PB تجميد تبديل.

2. تجميد إحلال

ملاحظة: يتم تعديل هذا الأسلوب تجميد الإحلال من السابق بروتوكول المنشورة 19،20. أيضا، من الأهمية بمكان أن الصكوك هي باردة جدا (ارتداء قفازات)؛ سtherwise، والأنسجة قد يذوب جزئيا عند لمسها مع الصكوك. تتم كل هذه الخطوات داخل غرفة AFS ويسمح الصكوك أبدا للتحرك فوق حافة الغرفة. وبالمثل، والتبريد المناسب لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في المؤسسة أمر ضروري.

  1. يغرق-تجميد شرائح الشبكية في البروبان السائل عند -184 درجة مئوية في صك EM الحفظ بالتبريد (CPC). باستخدام فرشاة ناعمة، ووضع العينات على قطع صغيرة من الشريط المزدوج عصا تعلق على بذرة المعادن التي تدخل في نهاية قضبان تغرق (الفتيل قبالة عازلة إضافية باستخدام فرشاة).
  2. يغرق القضبان في البروبان السائل والحفاظ على وجود نحو 5 ثوان، ثم نقل إلى أداة تجميد استبدال تلقائي (AFS) باستخدام غرفة النقل الصغيرة التي هي شغلها مع النيتروجين السائل ( 'LN 2 تبريد البرد نقل الحاويات').
  3. بعد وضع العينة المجمدة وأدوات (ملقط ومشرط) في AFS، تبريد الآلات في غرفة على الدقائق veral قبل لمس الأنسجة، أو تبريدها عن طريق وضع نصائح من الصكوك لبضع ثوان في غرفة النقل الصغيرة (مليئة النيتروجين السائل ( 'LN 2 تبريد البرد نقل الحاويات')).
  4. مرة واحدة في المؤسسة، وإزالة عينة والشريط من كعب باستخدام مشرط على ما يرام. أيضا، والحفاظ على السيطرة على تدفق غاز النيتروجين، TF (TF يوصف بأنه 'السيطرة منظم لLN 2 vaporiser') مفتوحة خلال هذه الإجراءات.
  5. قبل وضع الأنسجة المجمدة في أصحاب تضمين مسطحة (أي قبل إنشاء AFS)، وقطع دائرة رقيقة من البلاستيك ورقة واضحة ووضعه في الجزء السفلي من حامل بحيث تبطن الجزء السفلي من كل بئر. وهذا يسمح إزالة أسهل نسبيا من الكتل عينة بلمرة عند الانتهاء.
    ملاحظة: في السابق، استخدمنا طريقة بديلة لأصحاب التضمين شقة، وتوظيف مزدوجة رايشرت + الجيلاتين كبسولات (انظر بيتراليا وWenthold، 1999) <سوب> 20.
  6. استخدام التسلسل التالي التلقائي في AFS (باستخدام المصطلحات الصك): T1 = -90 درجة مئوية لمدة 32 ساعة، S1 = زيادة درجة الحرارة بمقدار 4 درجات مئوية / ساعة (11.3 ساعة)، T2 = -45 درجة مئوية لمدة 50 ساعة، S2 = زيادة درجة الحرارة بمقدار 5 درجات مئوية / ساعة (9 ساعة)، T3 = 0 درجة مئوية لمدة 40 ساعة (مجموع = 142.3 ساعة). قد يستغرق 2-4 ساعة لوضع العينات في AFS (في -90 درجة مئوية) قبل بدء تسلسل توقيت.
  7. تزج أقسام المجمدة في 1.5٪ خلات اليورانيل في الميثانول في -90 درجة مئوية لمدة> 32 ساعة في AFS. وضع قطعتين من الأنسجة (عادة) في كل من الآبار السبعة في حامل الألومنيوم تضمين شقة (ثلاث تنسجم مع AFS).
    1. وضع الأنسجة + الشريط في اليورانيل خلات / الميثانول في الآبار وإزالة الشريط في وقت لاحق، فقط قبل بداية تضمين المتوسطة (مثل Lowicryl HM20) تسلل، إذا كان من الصعب جدا لإزالة الأنسجة من الشريط.
  8. ثم زيادة التدريجية في درجة الحرارة إلى -45 درجة مئوية (+ 4 ° C لكل ساعة. في تسلسل تلقائي).
  9. غسل العينات ثلاث مرات في الميثانول precooled، باستخدام ماصة بلاستيكية يميل غرامة لإزالة الحل القديم من كل صاحب شقة التضمين، وبعد ذلك باستخدام ماصة بلاستيكية واضحة أخرى لإضافة الميثانول النقي precooled.
  10. ثم، وذلك باستخدام نفس الأسلوب، التسلل العينات تدريجيا مع انخفاض درجات الحرارة تضمين الراتنجات مثل تضمين المتوسطة (HM20 / الميثانول في 1: 1 و 2: 1، كل لمدة 2 ساعة، تليها الراتنج النقي لمدة 2 ساعة وبعد ذلك تغيير راتنجات والحفاظ O / N).
  11. تغيير الراتنج مرة أخرى في اليوم التالي، وتعديل مستوى من الراتنج للوصول فقط إلى الحافة العليا من الآبار.
  12. بلمرة العينات (-45 درجة مئوية إلى 0 درجة مئوية في تسلسل التلقائي؛ + 5 ° C لكل ساعة) مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 40 ساعة.
  13. ثم إزالة عينات من AFS. عادة، وكتل عينة لا تزال تظهر بعض الوردية اللون. وضع العينات على مقربة من ضوء الفلورسنت في غطاء الدخان الكيميائية، في RT O / N أو لفترة أطول حتى التطبيقالأذن واضحة تماما.

3. Postembedding EM Immunogold سيتولوجية مناعية

يتم تنفيذ Postembedding مناعية كما هو موضح 23،24،25: ملاحظة.

  1. قطع 1 ميكرون المقاطع مع مشراح مستدق، وصمة عار المقاطع مع طولويدين الأزرق 1٪، ودراستها لقسم التوجيه. توجيه كتلة الأنسجة لتحقيق الطائرة عرضية مثالية من باجتزاء.
  2. قطع 70 نانومتر أقسام سامسونج سميكة مع مشراح مستدق وجمعها على شبكات فتحة النيكل المطلي Formvar الكربون.
  3. غسل الشبكات مرة واحدة في H المقطر 2 O تليها مخزنة المالحة تريس، ثلاث مرات (TBS، 0.05 عازلة M تريس، 0.7٪ كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.6) غسل.
  4. احتضان شبكات في 20 قطرات ميكرولتر من 5٪ BSA في TBS لمدة 30 دقيقة، ثم في 20 قطرات ميكرولتر من مزيج يحتوي على الماعز المضادة للCTB (1: 3000) وأجسام مضادة لواحد NMDAR فرعية (المضادة للأرنب GluN2A 01:50 ، GluN2B 01:30)، أو مضاد للأرنب GluA2 / 3 (1:30)في TBS-تريتون (TBST، 0.01٪ تريتون X-100، ودرجة الحموضة 7.6) مع 2٪ BSA و 0.02 M نان 3 O / N في RT.
  5. شبكات غسيل على ثلاث قطرات منفصلة (20 ميكرولتر) من TBS (الرقم الهيدروجيني 7.6) لمدة 10، 10، و 20 دقيقة، تليها TBS (الرقم الهيدروجيني 8.2) لمدة 5 دقائق.
  6. احتضان شبكات لمدة 2 ساعة على قطرات (20 ميكرولتر) من مزيج يحتوي على حمار مفتش المضادة للأرنب (01:20) بالإضافة إلى 10 نانومتر جزيئات الذهب ومفتش حمار المضادة للماعز (01:20) بالإضافة إلى جزيئات الذهب 18 نانومتر في TBST (درجة الحموضة 8.2) مع 2٪ BSA و 0.02 M نان 3.
  7. غسل شبكات في 20 قطرات ميكرولتر من TBS (الرقم الهيدروجيني 7.6) لمدة 5 و 5 و 10 دقيقة، ثم في الماء عالى النقاء وثم تجفيفها.
  8. شبكات مباين مع 5٪ خلات اليورانيل و 0.3٪ من الرصاص سترات في H المقطر 2 O لمدة 8 و 5 دقائق في ظل ظروف مظلمة، على التوالي.
  9. للتجارب الثلاثي وضع العلامات، واحتضان شبكات O / N في RT مع 20 قطرات ميكرولتر من خليط من مكافحة الماعز CTB (1: 3000)، ومكافحة فأر PSD-95 (1: 100)، والمضادة للأرنب GluN2A (1 : 50). ثم احتضان شبكات لمدة 2 ساعة في 20 قطرات ميكرولتر من خليط من الجماعات الحكومية الدولية بالإضافة إلى 18، و 10، و 5 جزيئات الذهب نانومتر في TBST (درجة الحموضة 8.2) مع 2٪ BSA و 0.02 M نان 3. الحفاظ على نفس إجراءات وضع العلامات مزدوج لغسيل وcounterstaining بين وبعد حضانة الأضداد.
  10. تم تنفيذ الضوابط التي تم تطبيقها على الأجسام المضادة الثانوية وحدها.
  11. عرض الشبكات على EM ورقمنة الصور. معالجة الأرقام النهائية في أدوبي فوتوشوب 6.0 فقط من أجل السطوع والتباين إذا كان ذلك ضروريا (24).

4. الكمي

  1. يدويا مناطق مختارة من طبقة ضفيري الداخلية (IPL) بدون ثقوب أو تشققات في 8،000X التكبير، ثم تركيب الصورة بشكل عشوائي عمق الكامل للIPL في 25،000X التكبير.
  2. تحديد التشعبات RGC في مخروط dyads القطبين عندما أ) تحتوي على إشارة CTB نقل retrogradely (جزيئات الذهب الكبيرة)، ب) المعرض واضحة المعالم الأغشية، وشقوق، وكثافة بعد المشبكي، ج) تحتوي على اثنين على الأقل صغير جزء الذهبicles في مديرية الأمن العام، أو الجسيمات صغيرة من الذهب أكثر من واحد على طول الغشاء البلازمي extrasynaptic.
  3. جمع 45 - 55 التشعبات RGC، استنادا إلى المعايير المذكورة أعلاه، للتحليل الكمي.
  4. قياس أطوال مديرية الأمن العام وغشاء البلازما extrasynaptic من التشعبات RGC الفردية مع برامج المعاهد الوطنية للصحة يماغيج. عدد جزيئات الذهب في غضون 10 نانومتر الغشاء كما غشاء المرتبطة، على أساس سمك متوسط ​​من 7-9 نانومتر للغشاء البلازما 26.
  5. حساب كثافة الجسيمات حيث بلغ عدد جزيئات الذهب في ميكرومتر الخطي (الذهب / ميكرون). قياس المسافة بين مركز كل الجسيمات الذهب ووسط مديرية الأمن العام (للموقع متشابك) أو على حافة مديرية الأمن العام (للموقع extrasynaptic).
  6. إجراء تحليل إحصائي من قبل البرامج. استخدام اثنين من الذيل تي الاختبارات لمقارنة الوسائل. نستنتج أهمية عند P <0.05. ما لم يذكر خلاف ذلك، قيم التقرير بأنه يعني ± SEM 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج المعروضة هنا تظهر مختلفة لافت للنظر أنماط توطين تحت المشبك من GluA 2/3 وNMDARs على التشعبات RGC في شبكية العين الفئران، كما هو موضح سابقا 24،25. وتقع 77٪ من GluA 2/3 الجسيمات immunogold في لمحات شجيري RGC في مديرية الأمن العام (الشكل 1A)، على غرار معظم نقاط الاشتباك العصبي المركزي. ومع ذلك، كانت تقع NMDARs إما synaptically أو extrasynaptically. 83٪ من الجزيئات immunogold GluN2A ومحلية في مديرية الأمن العام (الشكل 1C، 2A، 2B)، بشكل تفضيلي في نقاط الاشتباك العصبي OFF، وجزيئات الذهب كان أكثر تركيزا في مركز مديرية الأمن العام (الشكل 2C). في المقابل، كانت تقع غالبية كبيرة من الجسيمات وضع العلامات لGluN2B (96٪) خارج مديرية الأمن العام (الشكل 1B، 2A، 2B)، وزعت في المقام الأول على طول غشاء البلازما extrasynaptic، مع كثافة الذروة الجسيمات في 180 نانومتر من حافة مديرية الأمن العام (الشكل 2B). على وجه الخصوص، عرضت GluN2B تفضيل لنقاط الاشتباك العصبي ON. في مجموعة فرعية من التجارب، ووضع العلامات في وقت واحد GluN2A، PSD-95 و CTB أشار إلى أن GluN2A وPSD-95 تم colocalized في مديرية الأمن العام من التشعبات OFF RGC (1D الشكل)، حيث كان NR2A في غشاء شجيري بينما كان PSD-95 تحت الغشاء، مما يوحي بأن وأنها ترتكز في مديرية الأمن العام. ولوحظ وجود اختلاف كبير في كثافة الذهب بين غشاء perisynaptic والأغشية الميتوكوندريا، مما يشير إلى وضع العلامات المحددة في السابق (الشكل 2D).

الشكل 1
الشكل 1. Immunogold صفها عرض متشابك وPerisynaptic توطين جلوتاماتي المستقبلات في RGC التشعبات إعتبر التي كتبها CTB. (A): ضعف وضع العلامات immunogold من GluA2 / 3 (10 نانومتر الذهب) وCTB (18 نانومتر الذهب). أشرطة قبل المشبكي أشارت من قبل رؤوس سهام. غول صغيرتتجمع جزيئات د (السهم) في مديرية الأمن العام من RGC العمليات. (ب) وضع العلامات مزدوج immunogold من GluN2B (10 نانومتر الذهب) وCTB (18 نانومتر الذهب)؛ جزيئات الذهب الصغيرة (السهم) هي على غشاء البلازما extrasynaptic. (C) مزدوجة وضع العلامات immunogold من GluN2A (10 نانومتر الذهب) وCTB (18 نانومتر الذهب). على غرار GluA2 / 3، تتجمع جزيئات صغيرة داخل مديرية الأمن العام. (D) الثلاثي immunogold وسم GluN2A (5 نانومتر الذهب)، PSD-95 (10 نانومتر الذهب) وCTB (18 نانومتر الذهب). الجسيمات GluN2A الذهب (الأسهم الصغيرة) وPSD-95 جزيئات الذهب (الأسهم الكبيرة) شارك في محلية داخل مديرية الأمن العام على التشعبات RGC CTB الإيجابية الفردية. أقحم: التكبير أعلى من مديرية الأمن العام. شريط مقياس: 0.1 ميكرون (A = C = D، B). هذه هي الميكروسكوب جديدة تقوم على بيانات نشرت في تشانغ والماس 24،25. الرجاء انقر هنا للتنافسوا نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. مقارنة الكمية من NMDAR التعريب في RGC التشعبات. (A) رسم بياني يوضح توزيع عرضية من immunogold لGluN2A (ن = 53 الشخصية) وGluN2B (ن = 56 لمحات) داخل وخارج مديرية الأمن العام. تم تقسيم المنطقة perisynaptic إلى 60 صناديق نانومتر. (ب) رسم بياني يبين كثافة وسم جزيئات immunogold لGluN2A (ن = 53 الشخصية) وGluN2B (ن = 56 الشخصية). تم تقسيم المنطقة perisynaptic إلى 180 نانومتر صناديق من حافة مديرية الأمن العام. (ج) والرسم البياني يبين توزيع عرضية من العدد الكلي للجسيمات immunogold لGluN2A (ن = 44 الشخصية) وGluN2B (ن = 3 لمحات) في كل التشكيلات مع وضع العلامات في مديرية الأمن العام. (د) مقارنة كثافة الجسيماتالجسيمات immunogold لGluN2B (ن = 53 و 33 الشخصية) وGluN2A (ن = 9 و 30) في الأغشية perisynaptic وغشاء الميتوكوندريا، على التوالي، في عمليات RGC CTB إيجابية. يتم تعديل هذه رسوم بيانية من رسوم بيانية نشرت في تشانغ والماس 24،25. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفناها أربع تقنيات لنجاح الكمي بعد تضمين immunogold م: 1) تثبيت القصير والضعيف، 2) تجميد الاستبدال، 3) بعد دمج تلطيخ immunogold، و 4) الكمي.

EM immunogold يسمح للكشف عن بروتينات معينة في قطاعات النسيج سامسونج. الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات الذهب يمكن تصور مباشرة باستخدام EM. في حين قوية في الكشف عن توطين تحت المشبك من مستقبلات الغشاء، يمكن EM immunogold تكون صعبة من الناحية الفنية، ويتطلب تحسين دقيق لطرق تثبيت الأنسجة وتجهيزها.

لضرب التوازن الأمثل بين سلامة الغشاء واستضداد، نحن اختبار طرق التثبيت المختلفة والأوقات. على سبيل المثال، فشل بروتوكول ناجحة تستخدم لpostembedding EM NMDAR في نقاط الاشتباك العصبي المركزي 19،20 للكشف عن NMDAR مناعية في شبكية العين. هذه الدراسة استخدمت تثبيت لطيف والأوقات حضانة قصيرة لتجنب الحد من NMDA مستقبلات استضداد بعد القوي، وتثبيت لفترة طويلة (16).

وقد وضعت طريقة تجميد استبدال أولا لتوطين التركيبية مستقبلات الغلوتامات في 1990s في وقت مبكر 27، وينطوي على انخفاض تسلل درجة الحرارة والبلمرة في اقطبي، الراتنج مسعور، HM20 28، اللازمة لوضع العلامات الأمثل postembedding immunogold. تم تطوير طريقة تجميد استبدال المحددة المستخدمة هنا لمستقبلات الغلوتامات وضع العلامات في القوقعة 29 والأمثل لمستقبلات الغلوتامات في نقاط الاشتباك العصبي المركزي 18،19،20،30، وقد مزيد من التعديل عليه في السنوات الأخيرة. تسلل درجة حرارة منخفضة وبلمرة الراتنج يساعد على الحفاظ على استضداد من الجزيئات للحرارة عطوب، ويقلل من استخلاص الدهون والتفاعلات الكيميائية الضارة بين الراتنج والأنسجة 19،31. جنبا إلى جنب مع طرق التثبيت المذكورة أعلاه، هذا التجميد استبدال طريقة عrovides استضداد جيدة والحفاظ عليها الهيكلي معقول.

تقنية postembedding immunogold المستخدمة هنا ديها العديد من المزايا مقارنة مع أسلوب preembedding المناعي. على الرغم من أن طريقة preembedding المناعي لديه حساسية أعلى 15،16،17،19،20،21، نشر ناتج التفاعل أمر لا مفر منه، مما أدى إلى وضع العلامات غير محددة 26،32. وعلاوة على ذلك، والبيروكسيديز رد فعل الانزيم ليس خطيا 21، مما يجعل من الصعب تقييم كمي لتوطين تحت المشبك الدقيق للمستقبلات 18،21. طريقة postembedding immunogold يستخدم علامة غير إنتشاري وينفذ تفاعل مناعي على سطح الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الراتنج، مما يقلل من التحف إنتشاري ويسمح أعلى المكاني قرار 18،33،34. جزيئات الذهب يمكن عدها مباشرة، وعلاوة على ذلك، مما يجعل من الممكن لتقدير عدد وكثافة وتنوع هذه المستقبلات في اصطناعي الشريط الشبكيةالصدور. وبالإضافة إلى ذلك، postembedding immunogold يتيح توطين مستقبلات متعددة ليتم فحصها في وقت واحد على مستوى EM. وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح في تحديد توطين البروتينات الأخرى غشاء (على سبيل المثال، مستقبلات GABA والبوتاسيوم [BK] قنوات تنشيط الكالسيوم) في قضيب الشبكية نقاط الاشتباك العصبي بين القطبين 35.

وهناك عدة عوامل حاسمة لنجاح هذا البروتوكول. التثبيت الأول، سريع ولطيف هو خطوة أولى مهمة للحفاظ على استضداد وهيكل غرامة. وثانيا، فإن بروتوكول "الرقم الهيدروجيني التحول" لتثبيت مفيد للكشف عن الأمثل للالحواتم المستضدية والحفاظ التركيبية جيد 36. الثالث، وتجميد إحلال يحافظ على استضداد من المستقبلات، مع الحفاظ على هيكل غرامة معقول. رابعا، خلال تلطيخ immunogold، عازلة TBST (مع تريتون X-100) يستخدم مع حضانة الأجسام المضادة، في حين العازلة TBS (بدون تريتون X-100) يستخدملغسل بين وبعد الحضانة من الأجسام المضادة. هذا قد تقليل تغييرات في هيكل غرامة. خامسا، خلال تبادل الحلول، يتم الاحتفاظ أقسام الرطب للحد من الأعمال الفنية الناجمة عن تجفيف الأنسجة.

في حين أن بروتوكول immunogold postembedding الموصوفة هنا يوفر وسيلة معززة لتحديد مستقبلات الغشاء في المشبك الشريط شبكية العين، فإنه ليس تماما حساسة مثل preembedding أساليب المناعى. ولكن هذه الأخيرة ليست خيارا جيدا لأنهم يعانون من انخفاض نسبيا خصوصية وأقل قابلية للالكمي كما ذكر أعلاه. كما يهدد بروتوكول لدينا هيكل جيد إلى حد ما، بالمقارنة مع الأنسجة ثابتة بقوة أكبر ليست مستعدة لimmunolabeling. ونأمل أن الابتكارات المستقبلية التغلب على هذه القيود.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل برامج جماعية من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) والمعهد الوطني للاضطرابات التواصل الأخرى الصمم و(NIDCD)، من المعاهد الوطنية للصحة (NIH). نشكر منشأة NINDS EM وNIDCD متقدمة الأساسية التصوير (رمز # شركة زيورخ للتأمين العاصمة 000081-03) للحصول على المساعدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde EMS 15710
Glutaraldehyde EMS 16019
NaH2PO4 Sigma S9638
Na2HPO4 Sigma 7782-85-6
CaCl2 Sigma C-8106
BSA Sigma A-7030
Triton X-100 Sigma T-8787
NaOH Sigma 221465
NaN3 JT Baker V015-05
Glycerol Gibco BRL 15514-011
Lowicryl HM 20 Polysciences 15924-1
Tris-Base Fisher BP151-500
Tris Fisher 04997-100
Anti-GluN2A Millipore AB1555P Dilution 1/50
Anti-GluN2B Millipore AB1557P Dilution 1/30
Anti-GluA2/3 Millipore AB1506 Dilution 1/30
Anti-PSD-95 Millipore MA1–046 Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles EMS 25704 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles EMS 25814 Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles EMS 25812 Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles Jackson ImmunoResearch 705-215-147 Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. EMS FCF2010-Ni
Uranyl acetate EMS 22400-1
Methanol EMS 67-56-1
Lead citrate Leica
Leica EM AFS Leica
Leica EM CPC Leica
Ultramicrotome Leica
JEOL 1200 EM JEOL
liquid nitrogen  Roberts Oxygen
Propane Roberts Oxygen
CTB List Biological Laboratories 104 1 - 1.2%
Anti-CTB List Biological Laboratories 703 Dilution 1/4,000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

Tags

علم الأعصاب، العدد 108، البيولوجيا العصبية في شبكية العين، ومتشابك توزيع perisynaptic، immunogold المجهر الإلكتروني، الخلايا العقدية للشبكية، NMDA، أمبا، PSD-95
عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. … More

Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses. J. Vis. Exp. (108), e53547, doi:10.3791/53547 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter