Introduction
谷氨酸是在视网膜1中的主要兴奋性神经递质。视网膜神经节细胞（RGC）中，从双极电池 2接收的谷氨酸突触输入，是视网膜的输出神经元发送视觉信息到大脑。生理学研究表明，视网膜神经节细胞突触激励是通过NMDA受体（NMDA受体）和AMPA受体（的AMPARs）3,4,5突触后介导的。虽然在视网膜神经节细胞兴奋性突触后电流（EPSCS）通过的AMPARs NMDA受体和介导视网膜神经节细胞-1,3,5,6,7,8-，自发微型EPSCS（mEPSCs）只呈现一个的AMPARs介导的分量4,5,9。然而，减少摄取谷氨酸自发EPSCS 5透露出一股NMDA受体成分，这表明在研资局树突NMDA受体可能位于兴奋性突触之外。膜相关鸟苷酸激酶（MAGUKs）如PSD-95该集群神经递质受体，包括谷氨酸盐受体和离子通道■在突触部位，也表现出明显的subsynaptic表达模式10,11,12,13,14。
近几十年来，共焦免疫组织化学和预嵌入型电子显微镜（EM）的免疫组化已被用于研究膜受体的表达。虽然共焦免疫染色揭示受体表达的宽图案，其较低的分辨率使得不可能使用来区分的亚细胞位置。在哺乳动物视网膜预嵌入-EM研究表明NMDA受体亚基存在于视锥双极细胞带状突触15,16,17突触后的元件。这是明显的对比，以生理学证据。然而，反应产物的扩散是在预嵌入免疫过氧化物酶方法的公知的构件。因此，这种方法通常不会给统计上可靠的数据和可以排除国产化的区分突触膜与膜突触外18,19,20,21。上另一方面，生理和解剖数据与的AMPARs对视网膜神经节细胞3,5,7,9,22突触定位相一致。因此，谷氨酸受体和MAGUKs在视网膜色带突触本地化不仅对突触后也给perisynaptic或突触外膜隔室。然而，仍然需要在视网膜色带突触这些膜蛋白的高分辨率定量分析。
在这里，我们开发了一种postembedding EM免疫技术检测NMDA受体亚基，AMPAR亚基和PSD-95接着在突触到大鼠视网膜神经节细胞估算这些蛋白的数量，密度和可变性的subsynaptic定位用霍乱毒素B亚基标记的（CTB）逆行追踪方法。
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Protocol
保养和动物的处理均符合NIH动物护理和使用委员会的准则。产后天（P）15-21 SD大鼠，通过双边上丘用1-1.2％CTB注入，维持在12：12小时光照：黑暗周期。
1.视网膜组织固定
- 组装以下材料和工具：解剖显微镜，2钳很细的技巧，剪刀，纤维素滤纸，塑料吸管和显微镜载玻片。
- 麻醉大鼠与2.0毫升氟烷（吸入剂麻醉剂）的密闭室。确定由这些方法适当麻醉：缺少脚趾捏，或缺乏瞬目反射的后爪后撤回。然后用断头台斩首立即。有一对虹膜剪的并发生在在pH7.4含0.1M磷酸盐缓冲液（PB）的4％多聚甲醛的玻璃培养皿中移除眼睛。
- 使用解剖显微镜，取出玉米通过切断眼球的前面EA。移除钳的内视网膜表面的晶状体和玻璃体。
- 剥离与两个镊子巩膜直至视网膜被从眼罩隔离。
- 立即切断视网膜为100 - 200微米厚的带用剃刀，并受pH值移固定。
- 在20 pH 6.0的固定在4％低聚甲醛视网膜条在0.1M PB - 30分钟，然后在4％多聚甲醛加0.01％戊二醛在10 pH值10.5 - 在RT 20分钟。
- 在PB中几次洗涤用0.15毫氯化钙 （pH为7.4，在4℃）后，加入（每次60分钟，在10％，20％，30％，然后在30％的O / N）的cryoprotect与甘油视网膜带M在0.1 PB冻结取代前。
2.冻结替代
注：此冷冻替代法从早期公布的协议19,20修改。此外，它是至关重要的工具是非常冷（戴手套） Øtherwise，当与文书触摸的组织可以部分解冻。所有这些步骤都在AFS室中完成，该仪器是决不允许移动腔室的边缘的上方。同样地，在AFS中使用的所有化学品的适当的冷却是必要的。
- 切入冻结在冷冻保存EM仪（CPC）的液态丙烷视网膜条在-184℃。用细刷，放置在小片双面胶带附着到去推插杆的端部的金属短截线的样品（使用刷子灯芯关闭额外缓冲液）。
- 扎杆进入液体丙烷，并保持在那里大约5秒，然后转移到使用填充有液氮的小传输室中的自动冷冻替代仪（AFS）（'LN 2冷却冷冻传送容器'）。
- 将冷冻的样品和仪器（镊子和手术刀）进入AFS后，冷却仪器在室本身veral分钟触摸组织，或通过将仪器的提示几秒钟到小型运输腔冷却之前（充满液氮（“LN 2冷却冷冻集装箱转移'））。
- 一旦在AFS，用细手术刀去除存根样品和磁带。另外，保持氮气流控制，TF（TF被描述为“调节器控制为LN 2汽化器'）在这些过程中打开。
- 之前放置冷冻组织成平嵌入持有者（即，设置在AFS之前），切细圆由透明塑料片材，将其放入保持器的底部，以便行的每个孔的底部。这使得相对容易去除聚合标本块完成时。
注意：在此之前，我们使用的另一种方法的扁平包埋持有者，并采用双赖克特+明胶胶囊（见佩特拉里亚和Wenthold，1999）<SUP> 20。 - 使用在AFS（使用仪器术语）以下自动序列：T 1 = -90℃，32小时，S1 =增加温度由4℃/小时（11.3小时），T 2 = -45℃，50小时，S2 =增加温度由5℃/小时（9小时），T3 = 0℃下40小时（总共= 142.3小时）。它可能需要2 - 4小时放置在AFS样品（在-90℃）开始的定时序列之前。
- 沉浸在甲醇1.5％乙酸双氧铀的冷冻切片在-90℃下，在与AFS> 32小时。将组织（典型值）在每一个七口井在平嵌入铝制支架的两片（三级融入AFS）。
- 放置组织+磁带入孔中的乙酸双氧铀/甲醇和后来除去胶带，只是之前开始包埋介质（如Lowicryl HM20）渗透，如果太难以从磁带除去组织。
- 然后增加温度逐步提高至-45°C（+ 4°每个小时Ç;在自动序列）。
- 洗样品三次在预冷的甲醇，通过使用细尖塑料吸管除去从每个平嵌入支架旧溶液，然后使用另一标准塑料吸管添加预冷新鲜甲醇。
- 1和2：然后，用同样的方法，用低温包埋树脂，例如在1包埋介质（HM20 /甲醇逐渐渗入试样1，每2小时，接着纯树脂2小时，然后改变树脂并保持O / N）。
- 第二天再次改变树脂，调整树脂的水平，以达到刚好至孔的顶部边缘。
- 聚合样品（-45℃至0℃下在自动序列;每小时+ 5℃）用UV光40小时。
- 然后从AFS样本。通常情况下，样本块仍然显示的颜色一定的粉红色。放置靠近的荧光在化学通风橱的样品中，在室温O / N或更长，直到它们的应用耳朵完全清楚。
3. Postembedding EM免疫免疫细胞化学
如上所述23,24,25进行Postembedding免疫组化：注意 。
- 切1微米的部分具有超薄，染色切片用1％甲苯胺蓝，检查是否有部分定位;东方的组织块，实现切片的最佳横向平面。
- 削减70纳米厚的超薄切片与超薄和收集他们对涂层的Formvar碳镍槽网格。
- 洗涤栅格在蒸馏水2 O一次后跟的Tris缓冲盐水三次（TBS，0.05M的Tris缓冲液，0.7％氯化钠，pH值7.6）洗涤。
- 孵育在TBS中的5％牛血清白蛋白的20微升液滴栅格30分钟，然后在含有山羊抗CTB的混合物的20微升液滴（1：3,000）和抗体的一个NMDA受体亚基（抗兔GluN2A一点50分，GluN2B 1:30），或抗兔GluA2 / 3（1:30）在TBS-的Triton（TBST，0.01％的Triton X-100，pH值7.6），用2％BSA和0.02M的NaN 3的O / N在室温。
- 在TBS的三个独立的滴（20微升）（pH为7.6）为10，10和20分钟的洗涤网格，随后的TBS（pH为8.2）中5分钟。
- 孵育网格包含耦合到耦合到在TBST 18nm的金颗粒为10nm的金颗粒和驴抗山羊IgG（1:20）驴抗兔IgG（1:20）的混合物中的上滴2小时（20微升） （pH值8.2），用2％BSA和0.02M的NaN 3的。
- 洗网格在TBS的20微升液滴（pH为7.6）为5,5，和10分钟，然后在超纯水中，然后干燥。
- 染液电网用5％的醋酸铀和0.3％的柠檬酸铅蒸馏水2 O分别为黑暗条件下8和5分钟。
- 为三重标记实验，孵化网格O / N在室温用抗山羊CTB的混合物20微升滴（1：3000），抗小鼠的PSD-95（1：100），和抗 - 兔GluN2A（1 ：50）。然后孵育电网为2 2小时0的IgG耦合至18，10和5纳米的金颗粒在TBST（pH值8.2），用2％BSA和0.02M的NaN 3的混合物的微升液滴。保持相同的程序作为双标记用于洗涤和之间和抗体孵育后复染。
- 进行控制，其中二次抗体单独施用。
- 在一个EM查看网格和数字化图像。处理在Adobe Photoshop 6.0 最后数字仅用于亮度和对比度如果需要24。
4.量化
- 手动将内网层（IPL），而不在8,000X放大小孔或裂缝选择区域，然后随机蒙太奇IPL在25,000X放大倍率的全部深度。
- 确定RGC树突在锥双极二人组合时，他们一）含有逆向转移CTB信号（大的金颗粒），B）表现出明确的膜裂，和突触后密度，C）至少包含两个小部分黄金PSD内icles，或沿突触外质膜多个小的金颗粒。
- 收集45 - 55 RGC树突，根据上述条件，进行定量分析。
- 测量PSD和个人RGC树突与美国国立卫生研究院的ImageJ软件的突触外质膜的长度。该膜作为10nm内计数的金颗粒膜结合的基础上，7的平均厚度- 9纳米为质膜26。
- 计算颗粒密度为每线性微米（金/微米）的金颗粒的数量。测量每个金颗粒的中心，并在PSD的中间（突触位置）或PSD的边缘（对于突触外位置）之间的距离。
- 通过软件进行统计分析。使用双尾t检验来比较的手段。总结意义时，P <0.05。除非另有说明，报告值作为平均±SEM 18。
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Representative Results
此处呈现的结果表明对大鼠视网膜RGC树突GluA 2/3的显着的不同subsynaptic本地化模式和NMDA受体，如先前24,25说明。在RGC树突型材GluA 2/3免疫颗粒的77％分别位于所述PSD（图1A）内，类似于大多数中央突触。然而，NMDA受体都位于突触两种或extrasynaptically。 GluN2A免疫颗粒的83％在PSD分别定位（图1C，2A，2B），优先在关突触，而金颗粒更集中在所述PSD（图2C）的中心。相反，对于GluN2B（96％）的大多数颗粒标记的分别位于所述PSD（图1B，2A，2B）的外部，主要沿突触外质膜分布，峰值粒子密度，在180处从所述的边缘PSD（图2B）。特别是，GluN2B展出ON突触的偏好。在实验中，GluN2A，PSD-95和CTB的同时标记的一个子集表示GluN2A和PSD-95在关RGC树突（图1D），其中NR2A是树枝状膜的PSD被共定位而PSD-95为下膜，这表明它们在PSD锚。在perisynaptic膜和线粒体膜间金密度的显著差异观察到，这表明在前者（图2D）的特定标记。
图1.免疫标记显示突触和谷氨酸受体的Perisynaptic本地化的RGC树突由CTB标记 。 （A）：GluA2 / 3（10纳米金）和CTB（18纳米金）的双重免疫标记。突触前丝带由箭头指示。小GOL为d的粒子在RGC的PSD进程聚集（箭头）。 （B）GluN2B（10纳米金）和CTB（18纳米金）的双重免疫胶体金标记;小的金颗粒（箭头）是对突触外质膜。 （C）GluN2A（10纳米金）和CTB（18纳米金）的双重免疫标记。类似于GluA2 / 3，小颗粒的PSD中聚集。 （D）GluN2A（5纳米金）的三重免疫标记，PSD-95（10纳米金）和CTB（18纳米金）。 GluN2A金颗粒（小箭头）和PSD-95金颗粒（大箭头）的共定位个人CTB阳性RGC树突PSD内。插图：PSD的高倍。比例尺：0.1微米（A = C = D，B）。这些都是新的显微照片的基础上出版了张钻石24,25数据。 请点击此处争夺WA更大的版本这个数字。
图2. NMDA受体本土化RGC树突的定量比较。（A） 显示免疫对GluN2A（N = 53配置文件）和GluN2B（N = 56配置文件）的切向分布的直方图内和外PSD。该perisynaptic地区被分为60纳米箱。 （B）表示GluN2A（N = 53配置文件）和GluN2B（N = 56配置文件）免疫粒子密度标签直方图。该perisynaptic区域分成180纳米仓从PSD的边缘。 （C）显示出免疫粒子总数为GluN2A（N = 44配置文件）和GluN2B（N = 3配置文件）的所有配置文件的PSD内切向分布带标签的直方图。 （D）的粒子密度的比较免疫粒子为GluN2B（53和33配置文件）和GluN2A（9和30）中的perisynaptic膜和线粒体膜，分别在CTB-阳性RGC流程。这些直方图刊登在张钻石24,25直方图修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们已经描述了四种技术对于成功的定量后包埋免疫EM：1）短和弱固定，2）冷冻取代，3）后包埋免疫染色，以及4）定量。
EM免疫允许在超薄组织切片的特定蛋白质的检测。标记有金颗粒的抗体可以用EM直接可视化。而在检测细胞膜受体的subsynaptic本地化功能强大，EM免疫可以技术上具有挑战性，并要求组织固定和加工方法严谨的优化。
罢工膜的完整性和抗原性之间的最佳平衡，我们测试了不同的固定方法和时间。例如，在中央突触19,20用于postembedding EM NMDAR成功协议未能检测在视网膜NMDAR免疫反应性。本研究采用温和的固定和潜伏期短次避免后强，长时间固定16 NMDA受体抗原性降低。
冷冻替代法最初是为谷氨酸受体的超微结构定位开发了20世纪90年代初27，并涉及低温渗透和聚合在非极性，疏水性树脂，HM20 28日，为了得到理想的postembedding免疫标记。这里使用的特定冷冻置换法是在耳蜗29用于标记谷氨酸受体开发并在中央突触18,19,20,30谷氨酸受体进行了优化，并已在最近几年进一步改性。的树脂的温度低的浸润和聚合有助于保持热不稳定分子的抗原性和脂质提取和树脂和组织19,31之间的不利的化学反应最小化。与上述的固定方法，该冷冻替代方法P合并rovides良好的抗原性和合理的结构保存。
这里使用的postembedding免疫技术具有与preembedding免疫过氧化物酶方法相比若干优点。虽然preembedding免疫过氧化物酶方法具有更高的灵敏度15,16,17,19,20,21，反应产物的扩散是不可避免的，导致非特异性标记26,32。此外，过氧化物酶反应不是线性21，使得它难以定量评估受体18,21的精确subsynaptic定位。所述postembedding免疫方法使用非扩散性标记物，并进行树脂包埋的组织，从而降低扩散工件并允许更高的空间分辨率18,33,34的表面上的免疫反应。金颗粒可直接进行计数，此外，使得能够估计这些受体的数量，密度和可变性在视网膜色带顺近星点。此外，postembedding免疫使得在EM层面同时考察多个受体的定位。该协议在查明视网膜杆双极突触35其他膜蛋白（如，GABA受体和钙激活钾[BK]通道）的定位中成功应用。
有几个因素是该协议的成功是至关重要的。首先，快速，温和的固定是抗原性和精细结构的保存重要的第一步。二，“pH值移”协议固定是该抗原表位的最佳检测和良好的超微结构保存36有益的。第三，冷冻置换保留受体的抗原性，同时保持合理的精细结构。第四，免疫染色，TBST缓冲液（用Triton X-100）与抗体孵育使用，在此期间而TBS缓冲液（不含Triton X-100）被用于之间和抗体的孵育后洗涤;这可能会减少在精细结构的改变。第五，解决方案的交换过程中，部分保持湿润，以减少因干燥组织文物。
而这里描述的postembedding免疫协议提供了在视网膜色带突触识别膜受体的增强的方法，它并不像preembedding免疫组织化学方法如敏感;但后者并不是一个很好的选择，因为它们从相对较低的特异性受苦，不太适合进行量化如上所述。相比，对免疫标记没有准备更牢固地固定的组织提供了协议也损害微细结构在一定程度上。我们希望，未来的创新将克服这些限制。
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Acknowledgments
这项工作是由神经疾病与中风国家研究所（NINDS）和国立耳聋与其他交流障碍（NIDCD），美国国立卫生研究院（NIH）的校内方案的支持。我们感谢NINDS EM设施和援助NIDCD先进的成像核心（代号＃ZIC DC 000081-03）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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