Introduction
Glutamaat is de belangrijkste exciterende neurotransmitter in de retina 1. Retinale ganglioncellen (RGC's), het ontvangen glutamaat synaptische input van bipolaire cellen 2, zijn de output vormen van de retina die visuele informatie naar de hersenen sturen. Fysiologische studies toonden aan dat synaptische excitatie van RGC postsynaptisch wordt gemedieerd door NMDA-receptoren (NMDARs) en AMPA receptoren (AMPARs) 3,4,5. Hoewel prikkelende postsynaptische stromingen (EPSCs) in RGC worden gemedieerd door AMPARs en NMDARs 3,5,6,7,8, spontane miniatuur EPSCs (mEPSCs) op RGC vertonen slechts een AMPARs-gemedieerde component 4,5,9. Echter, het verminderen glutamaat opname onthulde een NMDAR component spontane EPSCs 5 suggereert dat NMDARs op RGC dendrieten buitenzijde van exciterende synapsen kunnen bevinden. Membraan-geassocieerde guanylate kinases (MAGUKs), zoals PSD-95 dat cluster neurotransmitter receptoren, met inbegrip van glutamaat receptoren en ionkanaals bij synaptische plaatsen, vertonen ook duidelijke subsynaptic expressiepatronen 10,11,12,13,14.
In de afgelopen decennia, confocale immunohistochemie en pre-inbedding elektronenmicroscoop (EM) immunohistochemie werden gebruikt om het membraan receptor expressie te bestuderen. Hoewel confocale immunokleuring onthult brede patronen van receptor expressie, de lagere resolutie niet mogelijk is om te onderscheiden subcellulaire locatie. Pre-inbedding EM studies in zoogdieren netvlies geven aan dat NMDAR subeenheden aanwezig in postsynaptische elementen op kegel bipolaire cel lint synapsen 15,16,17 zijn. Dit is in duidelijke tegenstelling tot fysiologische gegevens. Echter diffusie van reactieproduct een bekende artefact in de pre-inbedding immunoperoxidase methode. Daarom is deze benadering niet geven meestal statistisch betrouwbare gegevens en kunnen onderscheid tussen lokalisatie uitsluiten synaptische membraan versus extrasynaptic membraan 18,19,20,21. OpAnderzijds fysiologische en anatomische gegevens in overeenstemming met een lokalisatie van synaptische AMPARs op RGC 3,5,7,9,22. Aldus glutamaatreceptoren en MAGUKs bij retinale lint synaps gelokaliseerd niet alleen de postsynaptische maar ook de perisynaptic of extrasynaptic membraancompartimenten. Echter, een hoge-resolutie kwantitatieve analyse van deze membraaneiwitten in een retinale lint synaps nog steeds nodig.
Hier hebben we een postembedding EM immunogold techniek om de subsynaptic lokalisatie van NMDAR subeenheden, Ampar subeenheden en PSD-95, gevolgd door een schatting van het aantal, de dichtheid en de veranderlijkheid van deze eiwitten bij synapsen op rat RGC onderzoeken geëtiketteerd met choleratoxine subunit B (CTB) retrograde tracing methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zorg en behandeling van de dieren waren in overeenstemming met de NIH Animal Care and Guidelines gebruik Comite. Postnatale dag (P) 15-21 Sprague-Dawley ratten geïnjecteerd met 1-1,2% CTB bilateraal door de superieure colliculus, werden gehandhaafd op een 12: 12-uur licht: donker cyclus.
1. netvliesweefsel Fixatie
- Monteer de volgende materialen en hulpmiddelen: een dissectie microscoop, 2 tangen met zeer fijne tips, schaar, cellulose filterpapier, kunststof pipet en een microscoopglaasje.
- Verdoven van de rat in een gesloten kamer met 2,0 ml halothaan (een inhalatie verdoving). Bepaal adequate verdoving door deze methoden: het ontbreken van de terugtrekking van de achterste poot na teen knijpen, of gebrek aan knipperreflex. onthoofden vervolgens onmiddellijk met een guillotine. Verwijder de ogen met een paar irisschaar en in een glazen schaaltje met 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) bij pH 7,4.
- Met behulp van de microscoop ontleden, verwijder de maïsea door het afsnijden van de voorzijde van de oogbol. Verwijder de lens en glasvocht van het binnenste netvlies oppervlak met een pincet.
- Schil de sclera met de twee tang totdat de retina is geïsoleerd van de oogschelp.
- Snijd het netvlies onmiddellijk in 100-200 urn dikke stroken met een scheermes, en onder voorbehoud van de pH-shift fixatie.
- Fix retina strips in 4% paraformaldehyde in 0,1 M PB bij pH 6,0 gedurende 20-30 minuten en vervolgens in 4% paraformaldehyde plus 0,01% glutaaraldehyde bij pH 10,5 gedurende 10-20 minuten bij kamertemperatuur.
- Na verscheidene wassingen in PB met 0,15 mM CaCl2 (pH 7,4 bij 4 ° C), cryoprotect de retinale stroken met glycerol (60 minuten elk in 10%, 20%, 30%, vervolgens O / N bij 30%) in 0,1 M PB voorafgaand aan vervanging bevriezen.
2. Freeze-substitutie
LET OP: Deze vries-substitutie methode is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerde protocol 19,20. Ook is het van cruciaal belang dat de instrumenten zijn erg koud (draag handschoenen); Otherwise, het weefsel kan gedeeltelijk ontdooien bij aanraking met de instrumenten. Al deze stappen zijn gedaan binnen het AFS kamer en de instrumenten mogen nooit boven de rand van de kamer te bewegen. Op dezelfde manier, een goede koeling van alle chemicaliën die worden gebruikt in de AFS is noodzakelijk.
- Neem een duik-bevriezing van de retinale strips in vloeibaar propaan bij -184 ° C in een EM cryopreservatie instrument (CPC). Met een fijne kwast, plaatst de monsters op kleine stukjes double-plakband bevestigd aan de metalen stompjes die gaan op het einde van het dompelen staafjes (lont uit extra buffer met de borstel).
- Dompelen de staven in de vloeibare propaan en blijven daar ongeveer 5 seconden, en vervolgens over naar de automatische freeze-substitutie instrument (AFS) met een kleine transportkamer die is gevuld met vloeibare stikstof (LN 2 afgekoeld cryo overdrachthouder).
- Na het plaatsen van de bevroren monster en instrumenten (pincet en scalpel) in de AFS, koelen van de instrumenten in de kamer voor seVeral minuten voor het aanraken van het weefsel of koelen ze door het plaatsen van de uiteinden van de instrumenten voor een paar seconden in de kleine transport kamer (gevuld met vloeibare stikstof (LN 2 gekoeld cryo overdracht container ')).
- Eenmaal in de AFS, verwijder het monster en de tape van de stomp met een fijn scalpel. Houd ook het stikstofgas flow control, TF (TF wordt omschreven als een 'regulator control voor LN 2 verdamper') geopend tijdens deze procedures.
- Voorafgaand aan het plaatsen van het bevroren weefsel in het vaste inbedding houders (dat wil zeggen, voordat de AFS), snijd een dunne cirkel van een heldere kunststof folie en plaats deze in de bodem van de houder teneinde de bodem van elk putje lijn. Dit maakt het mogelijk relatief gemakkelijker verwijdering van het gepolymeriseerde specimen blokken als u klaar bent.
LET OP: Voorheen gebruikten we een alternatieve methode om de platte inbedding houders, met gebruikmaking van dubbele Reichert + gelatine capsules (zie Petralia en Wenthold, 1999) <sup> 20. - Gebruik de volgende automatische sequentie in de AFS (met behulp van instrument terminologie): T1 = -90 ° C gedurende 32 uur, S1 = temperatuurstijging van 4 ° C / uur (11,3 uur), T2 = -45 ° C gedurende 50 uur, S2 = temperatuurstijging van 5 ° C / uur (9 uur), T3 = 0 ° C gedurende 40 uur (totaal = 142,3 uur). 4 uur om monsters in de AFS te plaatsen (bij -90 ° C) voor het starten van de getimede volgorde - Het kan 2 duren.
- Dompel de bevroren secties in 1,5% uranylacetaat in methanol bij -90 ° C gedurende> 32 uur in de AFS. Plaats twee stukjes weefsel (typisch) in elk van de zeven putjes van het vaste inbedding aluminium houder (drie passen in de AFS).
- Plaats het weefsel + tape in het uranyl acetaat / methanol in de putjes en later verwijder de tape, net voor aanvang inbedmedium (zoals Lowicryl HM20) infiltratie, als het te moeilijk is om het weefsel van de band te verwijderen.
- Verhoog dan de temperatuur stapsgewijs tot -45 ° C (+ 4 ° C per uur; in de automatische volgorde).
- Was de monsters drie keer in voorgekoelde methanol, met behulp van een fijne punt plastic pipet om de oude oplossing uit elke platte inbedding houder te verwijderen, en vervolgens met behulp van een andere standaard plastic pipet om de voorgekoeld verse methanol toe te voegen.
- Vervolgens worden met dezelfde methode, infiltreren monsters geleidelijk met lage temperatuur inbedden harsen zoals de inbedding (HM20 / methanol 1: 1 en 2: 1, elk voor 2 uur, gevolgd door pure hars gedurende 2 uur en vervolgens de harsen en houd O / N).
- Verander het hars de volgende dag, kan het niveau van de hars te bereiken alleen maar de bovenrand van de putjes.
- Polymeriseren de monsters (-45 ° C tot 0 ° C in automatische volgorde, + 5 ° C per uur) met UV licht gedurende 40 uur.
- Verwijder vervolgens de monsters uit de AFS. Typisch, sample blokken vertonen nog steeds een aantal pinkness in kleur. Plaats de monsters in de buurt van de tl-licht in de chemische zuurkast, bij RT O / N of langer totdat ze appoor helemaal duidelijk.
3. Postembedding EM immunogold Immunocytochemie
OPMERKING: Postembedding immunocytochemie werd uitgevoerd zoals beschreven 23,24,25.
- Snijd 1 micrometer secties met ultramicrotoom, vlek secties met 1% toluidine-blauw, en onderzoeken ze voor sectie geaardheid; oriënteren het weefsel blok naar de optimale dwarsvlak van snijden te bereiken.
- Snijd 70 nm dik ultradunne secties met ultramicrotoom en verzamel ze op Formvar-koolstof-beklede nikkel slot grids.
- Wassen roosters eenmaal in gedestilleerd H2O, gevolgd door een Tris-gebufferde zoutoplossing driemaal (TBS, 0,05 M Tris buffer, 0,7% NaCl, pH 7,6) was.
- Incubeer roosters in 20 ul druppels 5% BSA in TBS gedurende 30 minuten, en vervolgens in 20 ul druppels van een mengsel dat geit anti-CTB (1: 3000) en een antilichaam tegen een NMDAR subeenheid (anti-konijn GluN2A 1:50 , GluN2B 01:30), of een anti-konijn GluA2 / 3 (01:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) met 2% BSA en 0,02 M NaN3 O / N bij kamertemperatuur.
- Wassen roosters drie afzonderlijke druppels (20 pl) van TBS (pH 7,6) voor 10, 10 en 20 min, gevolgd door TBS (pH 8,2) gedurende 5 min.
- Incubeer roosters 2 uur op druppels (20 pl) van een mengsel dat ezel anti-konijnen IgG (01:20) gekoppeld aan 10 nm gouddeeltjes en ezel anti-geit IgG (01:20) gekoppeld aan 18 nm gouddeeltjes in TBST (pH 8,2) met 2% BSA en 0,02 M NaN3.
- Wassen roosters in 20 pl druppels TBS (pH 7,6) gedurende 5, 5 en 10 minuten, daarna in ultrazuiver water en vervolgens drogen.
- Tegenkleuring grids met 5% uranyl acetaat en 0,3% lood citraat in gedestilleerd H 2 O voor 8 en 5 minuten onder donkere omstandigheden, respectievelijk.
- Voor triple-markeringsexperimenten Incubeer grids O / N bij kamertemperatuur met 20 pl druppels van een mengsel van anti-geit CTB (1: 3000), anti-muis PSD-95 (1: 100) en anti-konijn GluN2A (1 : 50). incubeer dan grids gedurende 2 uur op 20 ul druppels van een mengsel van IgG gekoppeld aan 18, 10 en 5 nm gouddeeltjes in TBST (pH 8,2) met 2% BSA en 0,02 M NaN3. Behoud van dezelfde procedures als dubbele labeling voor het wassen en tegenkleuring tussen antilichaam en na incubatie.
- Controles werden uitgevoerd waarbij de secundaire antilichamen alleen werd toegepast.
- Bekijk grids op een EM en digitaliseren beelden. Proces definitieve cijfers in Adobe Photoshop 6.0 alleen voor de helderheid en het contrast als het nodig is 24.
4. kwantificering
- Handmatig te selecteren gebieden van de binnenste plexiforme laag (IPL) zonder gaten of scheuren in 8,000X vergroting, vervolgens willekeurig fotomontage de volledige diepte van IPL op 25,000X vergroting.
- Identificeer RGC dendrieten op kegel bipolaire tweetallen wanneer ze a) bevat de retrograde getransporteerd CTB signaal (grote gouddeeltjes), b) vertonen welomschreven membranen, kloven en postsynaptische dichtheid, c) ten minste twee kleine gouden gedeelte bevattenicles binnen de PSD of meerdere kleine gouden deeltjes langs de extrasynaptic plasmamembraan.
- Verzamel 45-55 RGC dendrieten, gebaseerd op de criteria voor kwantitatieve analyse.
- Meet de lengte van de PSD en de extrasynaptic plasmamembraan individuele RGC dendrieten met NIH ImageJ software. Aantal gouddeeltjes binnen 10 nm van het membraan als membraan-geassocieerde, op basis van een gemiddelde dikte van 7-9 nm voor de 26 plasmamembraan.
- Bereken deeltjesdichtheid het aantal gouddeeltjes per lineaire micrometer (goud / um). Meet de afstand tussen het midden van elke gouddeeltje en het midden van de PSD (voor synaptische locatie) of de rand van de PSD (voor extrasynaptic locatie).
- Voer een statistische analyse door software. Gebruik tweezijdige t-toetsen om gemiddelden te vergelijken. Concluderen betekenis wanneer p <0,05. Tenzij anders aangegeven, rapportwaarden als gemiddelde ± SEM 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier gepresenteerde resultaten tonen opvallend anders subsynaptic lokalisatie patronen van gluA 2/3 en NMDARs op RGC dendrieten in rat retina, zoals eerder beschreven 24,25. 77% van gluA 2/3 immunogold deeltjes RGC dendritische profielen bevinden zich binnen de PSD (figuur 1A), vergelijkbaar met de meeste centrale synapsen. Werden echter NMDARs ofwel synaptisch of extrasynaptically gelegen. 83% van GluN2A immunogold deeltjes werden gelokaliseerd in de PSD (Figuur 1C, 2A, 2B), bij voorkeur in OFF synapsen en de gouddeeltjes waren geconcentreerd in het midden van de PSD (figuur 2C). In tegenstelling, de overgrote meerderheid van de deeltjes etikettering van GluN2B (96%) bevonden zich buiten de PSD (Figuur 1B, 2A, 2B), opgericht en hoofdzakelijk langs de extrasynaptic plasmamembraan, met de piek deeltjesdichtheid van 180 nm vanaf de rand van de PSD (Figuur 2B). Vooral GluN2B vertoonde een voorkeur voor ON synapsen. In een subset van experimenten gelijktijdige vermelding van GluN2A, PSD-95 en CTB aangegeven dat GluN2A en PSD-95 in de PSD van OFF RGC dendrieten (Figuur 1D), waarbij NR2A was in de dendritische membraan werden colocalized terwijl PSD-95 eronder was het membraan, wat suggereert dat ze zijn verankerd aan de PSD. Een significant verschil in dichtheid tussen goud perisynaptic membraan en membranen werd waargenomen, wat suggereert een specifieke labeling in de eerstgenoemde (Figuur 2D).
Figuur 1. immunogoud Labeling Resultaat Synaptic en Perisynaptic lokalisatie van glutamaatreceptoren bij RGC Dendrieten gelabeld door CTB. (A): dubbele immunogold etikettering van GluA2 / 3 (10 nm goud) en CTB (18 nm goud). Presynaptische linten aangegeven met pijlpunten. kleine gold deeltjes worden geclusterd (pijl) in de PSD van RGC processen. (B) double immunogold etikettering van GluN2B (10 nm goud) en CTB (18 nm goud); kleine gouddeeltjes (pijl) op de extrasynaptic plasmamembraan. (C) dubbele immunogold etikettering van GluN2A (10 nm goud) en CTB (18 nm goud). Net als bij GluA2 / 3, zijn kleine deeltjes geclusterd binnen de PSD. (D) Triple immunogold etikettering van GluN2A (5 nm goud), PSD-95 (10 nm goud) en CTB (18 nm goud). GluN2A gouddeeltjes (kleine pijltjes) en de PSD-95 gouddeeltjes (grote pijlen) zijn co-gelokaliseerd binnen de PSD op de individuele CTB-positieve RGC dendrieten. Inzet: hogere vergroting van de PSD. Schaal bar: 0,1 micrometer (A = C = D, B). Dit zijn nieuwe micrografische op basis van gegevens die zijn gepubliceerd in Zhang en Diamond 24,25. Klik hier om viewa grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Vergelijking van kwantitatieve NMDAR Localization in RGC dendrieten. (A) Een histogram dat de tangentiële verdeling van immunogoud voor GluN2A (n = 53 profielen) en GluN2B (n = 56 profielen) binnen en buiten de PSD. De perisynaptic gebied werd verdeeld in 60 nm bakken. (B) Een histogram dat etikettering dichtheid van immunogoud deeltjes voor GluN2A (n = 53 profielen) en GluN2B (n = 56 profielen). De perisynaptic gebied werd verdeeld in 180 nm bakken van de rand van de PSD. (C) Een histogram dat de tangentiële verdeling van het totale aantal deeltjes immunogoud voor GluN2A (n = 44 profielen) en GluN2B (n = 3 profielen) en alle profielen met kenmerken in de PSD. (D) Vergelijking van deeltjesdichtheidimmunogoud deeltjes voor GluN2B (n = 53 en 33 profielen) en GluN2A (n = 9 en 30) in de perisynaptic membranen en mitochondria, respectievelijk in de CTB-positieve RGC processen. Deze histogrammen zijn gewijzigd ten opzichte van histogrammen gepubliceerd in Zhang en Diamond 24,25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben beschreven vier technieken voor een succesvolle kwantitatieve post-inbedding immunogold EM: 1) korte en zwakke fixatie, 2) te bevriezen-substitutie, 3) post-inbedding immunogoudkleuring, en 4) kwantificering.
EM immunogoud maakt de detectie van specifieke eiwitten in ultradunne weefselcoupes. Antilichamen gelabeld met gouddeeltjes kunnen direct worden gevisualiseerd middels EM. Terwijl krachtig in het opsporen van de subsynaptic lokalisatie van een membraan receptor, kan EM immunogold technisch uitdagend zijn, en vereist strikte optimalisatie van het weefsel fixatie en verwerkingsmethoden.
Om een optimale balans tussen membraan integriteit en antigeniciteit te slaan, we getest verschillende fixatie methoden en tijden. Bijvoorbeeld, een succesvol protocol voor postembedding EM NMDAR op centrale synapsen 19,20 niet NMDAR immunoreactiviteit gedetecteerd in de retina. Deze studie gebruikt zachte fixatie en korte incubatietijden tevoorkomen dat het verminderen van de NMDA-receptor antigeniciteit na een sterke, langdurige fixatie 16.
De vries-substitutie-methode werd voor het eerst ontwikkeld voor ultrastructurele lokalisatie van glutamaat receptoren in de vroege jaren 1990 27, en het gaat om lage temperatuur infiltratie en polymerisatie in een niet-polaire, hydrofobe hars, HM20 28, die nodig zijn voor een optimale postembedding immunogold labeling. De specifieke vries-substitutie hier gebruikte methode ontwikkeld voor het labelen glutamaatreceptoren in het slakkenhuis 29 en geoptimaliseerd voor glutamaatreceptoren in centrale synapsen 18,19,20,30, en is verder gemodificeerd afgelopen jaren. De lage temperatuur infiltratie en polymerisatie van de hars helpt om de antigeniciteit van warmte-labiele moleculen te behouden en minimaliseert vetextractie en ongewenste chemische reacties tussen hars en weefsel 19,31. In combinatie met de bevestiging werkwijzen hierboven beschreven, deze freeze-substitutiemethode provides goede antigeniciteit en redelijke structurele bewaring.
De postembedding immunogoud hier gebruikte techniek heeft een aantal voordelen ten opzichte van de preembedding immunoperoxidase methode. Hoewel de preembedding immunoperoxidase werkwijze een hogere gevoeligheid 15,16,17,19,20,21 diffusie van reactieproduct onvermijdelijk, waardoor niet-specifieke labeling 26,32. Bovendien wordt het peroxidase enzymreactie niet lineair 21, waardoor het moeilijk kwantitatief te evalueren subsynaptic precieze lokalisatie receptoren 18,21. De postembedding immunogoud werkwijze past een diffusievaste marker en voert de immuunreactie op het oppervlak van hars ingebedde weefsel, dat diffundeerbare voorwerpen vermindert en maakt hogere ruimtelijke resolutie 18,33,34. Gouddeeltjes direct geteld Bovendien maakt het mogelijk om het aantal, dichtheid en variabiliteit van deze receptoren berekend bij retinale lint synapses. Bovendien maakt postembedding immunogoud lokalisatie van meerdere receptoren gelijktijdig worden onderzocht op het niveau EM. Dit protocol is met succes toegepast bij het identificeren lokalisatie van andere membraaneiwitten (bijv., GABA receptoren en calcium geactiveerde kalium [BK] kanalen) retinadegeneratie stang 35 bipolaire synapsen.
Verschillende factoren zijn van cruciaal belang voor het welslagen van dit protocol. Eerste, snelle en zachte fixatie de eerste belangrijke stap voor het behoud van antigeniciteit en fijne structuur. Ten tweede, de "pH-shift" protocol voor bevestiging is gunstig voor een optimale detectie van de antigene epitopen en ultrastructurele goede bewaring 36. Ten derde, vries-substitutie behoudt de antigeniciteit van de receptoren, bij redelijke fijnstructuur. Ten vierde, tijdens immunogoudkleuring, TBST buffer (met Triton X-100) wordt gebruikt met antilichaam incubatie, terwijl TBS-buffer (zonder Triton X-100) wordt gebruiktvoor het wassen tussen en na de incubatie van antilichamen; Dit kan veranderingen in de fijne structuur zoveel mogelijk te beperken. Ten vijfde, tijdens de uitwisseling van oplossingen, secties zijn nat artefacten veroorzaakt door weefsel te drogen te verminderen gehouden.
Terwijl de postembedding immunogoud hier beschreven protocol verschaft een verbeterde werkwijze voor het identificeren membraanreceptoren op het netvlies lint synaps, is niet zo gevoelig als preembedding immunohistochemie; maar deze vormen geen goede optie omdat zij lijden relatief lagere specificiteit en minder vatbaar voor kwantificering zoals hierboven opgemerkt. Ons protocol nadelig effect fijnstructuur enigszins in vergelijking sterker vaste weefsel niet voorbereid immunokleuring. Hopelijk zullen toekomstige innovaties deze beperkingen te overwinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Intramurale Programma's van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NINDS) en het National Institute on Doofheid en andere Communication Disorders (NIDCD), van de National Institutes of Health (NIH). Wij danken de NINDS EM-faciliteit en de NIDCD geavanceerde imaging kern (code # ZIC DC 000081-03) voor hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
- Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
- Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
- Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
- Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
- Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
- Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
- Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
- Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
- Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
- Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
- Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
- Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
- Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
- Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
- Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
- Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
- Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
- Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
- Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
- Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
- Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
- Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).
