Introduction
Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur majeur dans la rétine 1. Ganglionnaires rétiniennes de cellules (CGR), recevoir une entrée synaptique glutamatergique de cellules bipolaires 2, les neurones de la rétine de sortie qui envoient des informations visuelles au cerveau. Des études physiologiques ont montré que l'excitation synaptique du CGR est médiée par postsynaptique récepteurs NMDA (de NMDARs) et les récepteurs AMPA (AMPA) 3,4,5. Bien que les courants post-synaptiques excitateurs (de EPSCs) dans CGR sont médiés par des récepteurs AMPA et NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs miniatures spontanés (mEPSCs) sur CGR présentent seulement une composante AMPA médiation 4,5,9. Toutefois, la réduction glutamate absorption révélé une composante de NMDAR dans EPSCs spontanées 5, ce qui suggère que NMDARs sur dendrites RGC peuvent être situés à l'extérieur des synapses excitateurs. guanylate kinase associée à la membrane (de MAGUKs) tels que PSD-95 que les récepteurs de neurotransmetteurs grappe, y compris les récepteurs de glutamate et de canal ioniques sur les sites synaptiques, présentent également des profils d'expression subsynaptic distinctes 10,11,12,13,14.
Au cours des dernières décennies, l'immunohistochimie confocale et-enrobage pré microscope électronique (EM) immunohistochimie ont été employés pour étudier l'expression du récepteur de la membrane. Bien immunocoloration confocal révèle les grandes tendances de l'expression du récepteur, sa résolution inférieure, il est impossible d'utiliser de distinguer localisation subcellulaire. Pré-enrobage des études de Em In rétine des mammifères indiquent que les sous-unités NMDAR sont présents dans les éléments post-synaptiques à cônes bipolaires synapses à ruban de cellules 15,16,17. Ceci est en contraste apparent à l'évidence physiologique. Toutefois, la diffusion du produit de réaction est un artefact bien connue dans la méthode de pré-enrobage immunoperoxydase. Par conséquent, cette approche ne donne généralement pas de données statistiques fiables et peut exclure distinction entre la localisation de membrane synaptique par rapport extrasynaptique 18,19,20,21 de la membrane. SurD'autre part, les données physiologiques et anatomiques sont compatibles avec une localisation synaptique des récepteurs AMPA sur CGR 3,5,7,9,22. Ainsi, les récepteurs du glutamate et à la rétine MAGUKs ruban synapse sont localisés, non seulement pour le post-synaptiques, mais aussi dans les compartiments membranaires ou périsynaptiques extrasynaptiques. Cependant, une analyse quantitative à haute résolution de ces protéines membranaires dans un ruban synapse rétine est encore nécessaire.
Ici, nous avons développé une technique postembedding EM immunologique d'examiner la localisation subsynaptic de sous-unités NMDAR, sous-unités AMPAR et PSD-95 puis en estimant le nombre, la densité et la variabilité de ces protéines au niveau des synapses SUR DES CGR de rat marquée en utilisant la sous-unité de la toxine cholérique B (CTB) méthodes de traçage rétrograde.
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Protocol
Soin et la manipulation des animaux étaient conformes aux NIH de protection des animaux et les lignes directrices utilisation Comité. jour postnatal (P) 15-21 Les rats Sprague-Dawley, injectés avec 1-1,2% CTB bilatéralement par le colliculus supérieur, ont été maintenus sur un 12: la lumière de 12 h: cycle d'obscurité.
1. Fixation de tissu rétinien
- Assembler les matériaux et outils suivants: Un microscope à dissection, 2 pinces avec des pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre de cellulose, pipette en plastique et une lame de microscope.
- Anesthésier le rat dans une chambre fermée avec 2,0 ml halothane (e anesthésique pour inhalation). Déterminer anesthésie suffisante par ces méthodes: l'absence de retrait de la patte arrière après pincement de l'orteil, ou le manque de réflexe de clignement. Puis décapiter immédiatement avec une guillotine. Retirez les yeux avec une paire de ciseaux de l'iris et les placer dans un plat en verre contenant du paraformaldéhyde 4% dans 0,1 M de tampon phosphate (PB) à pH 7,4.
- Utilisation du microscope à dissection, retirez le maïsea en coupant l'avant du globe oculaire. Retirer la lentille et vitré de la surface de la rétine interne avec une pince.
- Peler la sclérotique avec les deux pinces jusqu'à ce que la rétine est isolé de la bonnette.
- Couper la rétine immédiatement en 100 - 200 bandes um d'épaisseur avec un rasoir, et sous réserve de la fixation de changement de pH.
- Fixer des bandes de la rétine dans 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de PB à pH 6,0 pendant 20 à 30 minutes, puis dans du paraformaldehyde à 4%, plus 0,01% de glutaraldéhyde à un pH de 10,5 pendant 10 à 20 min à température ambiante.
- Après plusieurs lavages dans du PB avec 0,15 mM de CaCl2 (pH 7,4 à 4 ° C), cryoprotect les bandes de la rétine avec la glycérine (60 minutes à chaque fois dans 10%, 20%, 30%, O / N à 30%) dans 0,1 M PB avant le gel substitution.
2. Gel de substitution
NOTE: Cette méthode de congélation-substitution est modifié à partir d'un protocole publié plus tôt 19,20. En outre, il est crucial que les instruments sont très froids (porter des gants); oinon, le tissu peut décongeler partiellement au toucher avec les instruments. Toutes ces étapes sont effectuées dans la chambre AFS et les instruments ne sont jamais autorisés à se déplacer au-dessus du bord de la chambre. De même, le refroidissement correct de tous les produits chimiques utilisés dans l'AFS est nécessaire.
- Plongez-geler les bandes de la rétine dans le propane liquide à -184 ° C dans un instrument EM de cryoconservation (PCC). L'utilisation d'un pinceau fin, placer les échantillons sur de petits morceaux de ruban adhésif double-bâton attachés aux moignons métalliques qui vont à l'extrémité des tiges plongeant (évacuent tampon en utilisant la brosse).
- Plongez les tiges dans le propane liquide et y maintenir pendant environ 5 secondes, puis transfert à l'instrument de gel-substitution automatique (AFS) en utilisant une chambre de transport petite qui est rempli avec de l'azote liquide ( 'LN 2 refroidi récipient de transfert de cryo').
- Après avoir placé l'échantillon congelé et instruments (forceps et scalpel) dans l'AFS, refroidir les instruments dans la chambre pour soiminutes sieurs avant de toucher le tissu, ou les refroidir en plaçant les pointes des instruments pendant quelques secondes dans la petite chambre de transport (rempli d'azote liquide ( 'LN 2 refroidi récipient de transfert de cryo')).
- Une fois dans l'AFS, retirer l'échantillon et la bande du stub à l'aide d'une amende scalpel. Aussi, gardez le contrôle de flux d'azote gazeux, TF (TF est décrit comme une «commande de régulateur pour LN 2 vaporisateur ') ouverte au cours de ces procédures.
- Avant de placer le tissu congelé dans les supports plats-enrobage (avant la mise en place de la SPA), découper un cercle mince à partir d'une feuille de plastique transparent et placez-le dans le bas de la porte de manière à recouvrir le fond de chaque puits. Ceci permet l'élimination relativement plus facile des blocs d'échantillons polymérisés lorsque vous avez terminé.
NOTE: Auparavant, nous avons utilisé une méthode alternative pour les détenteurs d'incorporation plats, et en utilisant des capsules doubles Reichert + gélatine (voir Petralia et Wenthold, 1999) <sup> 20. - Utilisez la séquence suivante automatique dans l'AFS (en utilisant la terminologie de l'instrument): T1 = -90 ° C pendant 32 h, S1 = augmenter la température de 4 ° C / h (11,3 h), T2 = -45 ° C pendant 50 h, S2 = augmenter la température de 5 ° C / h (9 h), T3 = 0 ° C pendant 40 heures (total = 142.3 h). Il peut prendre de deux à quatre heures pour placer les échantillons dans l'AFS (à -90 ° C) avant de commencer la séquence chronométrée.
- Immerger les coupes congelées à 1,5% d'acétate d'uranyle dans le méthanol à -90 ° C pendant> 32 h dans l'AFS. Placez deux morceaux de tissus (généralement) dans chacune des sept puits dans le support en aluminium plate-enrobage (trois insèrent dans les AFS).
- Placez le tissu + bande dans l'acétate d'uranyle / méthanol dans les puits et enlever la bande plus tard, juste avant de commencer l'intégration moyen (comme Lowicryl HM20) infiltration, si elle est trop difficile à enlever le tissu de la bande.
- Puis augmenter progressivement la température à -45 ° C (+ 4 ° C par heure; dans la séquence automatique).
- Laver les échantillons trois fois dans le méthanol préalablement refroidi, en utilisant une pipette à pointe fine en plastique pour enlever l'ancienne solution de chaque détenteur plate-enrobage, puis en utilisant une autre pipette en plastique standard pour ajouter le méthanol frais préalablement refroidi.
- Puis, en utilisant la même méthode, infiltrer les échantillons au fur et à des résines de température enrobage faibles telles que l'incorporation moyen (HM20 / méthanol à 1: 1 et 2: 1, chacun pendant 2 heures, suivi par de la résine pure pendant 2 heures, puis modifier les résines et de garder O / N).
- Modifier à nouveau la résine, le lendemain, en ajustant le niveau de la résine pour atteindre juste le bord supérieur du puits.
- Polymériser les échantillons (-45 ° C à 0 ° C en séquence automatique, + 5 ° C par heure) avec une lumière UV pendant 40 heures.
- Ensuite, retirer les échantillons provenant de l'AFS. Typiquement, les blocs échantillons montrent encore un peu de couleur rose en couleur. Placer les échantillons proches de la lumière fluorescente dans la hotte pour émanation chimique, à la température ambiante O / N ou plus jusqu'à ce qu'ils apporeille tout à fait clair.
3. Postembedding EM immunomarquage Immunocytochimie
NOTE: Postembedding immunocytochimie est effectuée comme décrit 23,24,25.
- Coupez 1 um sections avec ultramicrotome, sections de tache avec 1% toluidine-bleu, et de les examiner pour la section orientation; orienter le bloc de tissu pour réaliser le plan transversal optimal de la coupe.
- Couper 70 coupes ultrafines nm d'épaisseur avec ultramicrotome et les recueillir sur Formvar carbone revêtues de nickel grilles à sous.
- Grilles lavage une fois dans de l'eau distillée 2 O, suivie par une solution saline tamponnée au Tris (TBS trois fois, du tampon Tris 0,05 M, NaCl 0,7%, pH 7,6) lavage.
- Incuber grilles dans 20 gouttes ul de 5% de BSA dans du TBS pendant 30 minutes, puis à 20 gouttes ul d'un mélange contenant de chèvre anti-CTB (1: 3000) et un anticorps dirigé contre une sous-unité de récepteurs NMDA (anti-lapin GluN2A 01:50 , GluN2B 1:30), ou un anticorps anti-lapin GluA2 / 3 (1:30)dans du TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) avec 2% de BSA et 0,02 M NaN 3 O / N à température ambiante.
- Laver les grilles sur trois gouttes séparées (20 pi) du TBS (pH 7,6) pour 10, 10 et 20 min, suivi par du TBS (pH 8,2) pendant 5 min.
- Incuber grilles pendant 2 heures sur des gouttes (20 pi) d'un mélange contenant âne IgG anti-lapin (1:20) couplé à 10 nm particules d'or et d'âne anti-IgG de chèvre (1:20) couplés à des particules d'or de 18 nm dans TBST (pH 8,2) avec 2% de BSA et 0,02 M de NaN3.
- Lavez les grilles dans des gouttes de 20 pi de TBS (pH 7,6) pour 5, 5 et 10 min, puis dans l'eau ultra-pure, puis les sécher.
- Grilles Counterstain avec 5% d'acétate d'uranyle et 0,3% de plomb citrate de H 2 O distillée pour 8 et 5 min dans des conditions sombres, respectivement.
- Pour les expériences triple marquage, incuber grilles O / N à température ambiante avec 20 gouttes ul d'un mélange d'anticorps anti-chèvre de CTB (1: 3000), anti-souris PSD-95 (1: 100) et anti-lapin GluN2A (1 : 50). Puis incuber grilles pendant 2 heures sur 20 ul gouttes d'un mélange d'IgG couplé à 18, 10, 5 et des particules d'or de la nm dans du TBST (pH 8,2) avec 2% de BSA et 0,02 M de NaN3. Gardez les mêmes procédures que le double marquage pour le lavage et contre-coloration entre et après les anticorps incubation.
- Les témoins ont été effectuées dans lesquelles les anticorps secondaires ont été appliqués seuls.
- Voir les grilles sur un EM et numériser des images. Traiter les chiffres définitifs dans Adobe Photoshop 6.0 uniquement pour la luminosité et le contraste si nécessaire 24.
4. Quantification
- Sélectionnez manuellement les zones de la couche plexiforme interne (IPL) sans trous ou des fissures à 8,000X grossissement, puis photomontage au hasard sur toute la profondeur de l'IPL à 25,000X grossissement.
- Identifier les dendrites RGC au cône dyades bipolaires quand ils a) contenir le signal CTB rétrograde transporté (grandes particules d'or), b) présentent bien définie membranes, Fentes, et des densités postsynaptiques, c) contiennent au moins deux petite partie de l'oricles au sein du PSD, ou plus d'une petite particule d'or le long de la membrane plasmique extrasynaptique.
- Recueillir 45 - 55 dendrites RGC, sur la base de critères ci-dessus, pour l'analyse quantitative.
- Mesurer les longueurs de la PSD et la membrane plasmique extrasynaptique RGC de dendrites individuelles avec le logiciel NIH ImageJ. Nombre de particules d'or de 10 nm à l'intérieur de la membrane associée à la membrane comme, par rapport à une épaisseur moyenne de 7-9 nm pour la 26 membrane plasmique.
- Calculer la densité des particules en nombre de particules d'or par micromètre linéaire (or / um). Mesurer la distance entre le centre de chaque particule d'or et au milieu de la PSD (pour la localisation synaptique) ou le bord de la PSD (pour la localisation extrasynaptique).
- Effectuer une analyse statistique par le logiciel. Utilisez bilatéral tests t pour comparer les moyennes. Conclure importance lorsque P <0,05. Sauf indication contraire, les valeurs de rapport sous forme de moyenne ± SEM 18.
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Representative Results
Les résultats présentés ici montrent remarquablement différents modèles de localisation de subsynaptic Glua 3.2 et NMDARs dendrites sur RGC dans la rétine de rat, comme décrit précédemment 24,25. 77% de particules de 2/3 Glua immunomarquage dans RGC profils dendritiques étaient situés au sein de la PSD (figure 1A), similaire à la plupart des synapses centrales. Cependant, NMDARs étaient situées soit synaptique ou extrasynaptically. 83% de particules de GluN2A immunomarquage ont été localisée dans le PSD (Figure 1C, 2A, 2B), préférentiellement au niveau des synapses de réduction, et les particules d'or ont été plus concentré au centre de la PSD (figure 2C). En revanche, la grande majorité de l'étiquetage des particules de GluN2B (96%) étaient situés en dehors du PSD (figure 1B, 2A, 2B), répartis essentiellement le long de la membrane plasmique extrasynaptique, avec la densité maximale de particule de 180 nm à partir du bord de la PSD (figure 2B). En particulier, GluN2B montré une préférence pour SUR synapses. Dans un sous-ensemble d'expériences, l'étiquetage simultanée de GluN2A, PSD-95 et la CTB ont indiqué que GluN2A et PSD-95 ont été colocalisés dans le PSD de dendrites OFF RGC (figure 1D), où NR2A était dans la membrane dendritique tandis PSD-95 était au-dessous la membrane, ce qui suggère qu'ils sont ancrés au PSD. Une différence significative de la densité d'or entre la membrane et les membranes mitochondriales périsynaptiques a été observée, ce qui suggère un marquage spécifique de l'ancienne (figure 2D).
Figure 1. immunomarquage étiquetage Affichage Synaptic et périsynaptiques localisation des récepteurs du glutamate à RGC Dendrites Labellisé par CTB. (A): un double marquage de immunologique de GluA2 / 3 (10 nm d'or) et CTB (18 nm d'or). rubans présynaptiques indiqué par des flèches. petit golparticules d sont regroupés (flèche) dans les processus PSD de RGC. (B) double étiquetage immunologique de GluN2B (10 nm d'or) et CTB (18 nm d'or); petites particules d'or (flèche) se trouvent sur la membrane plasmique extrasynaptique. (C) double étiquetage immunologique de GluN2A (10 nm d'or) et CTB (18 nm d'or). Semblable à GluA2 / 3, les petites particules sont regroupées au sein de la PSD. (D) Triple étiquetage immunologique de GluN2A (5 nm d'or), PSD-95 (10 nm d'or) et CTB (18 nm d'or). particules GluN2A d'or (petites flèches) et PSD-95 particules d'or (grandes flèches) sont co-localisés dans le PSD sur individuels dendrites RGC CTB-positifs. En médaillon: plus fort grossissement du PSD. Barre d'échelle: 0,1 um (A = C = D, B). Ce sont de nouveaux micrographies à données publiées dans Zhang et Diamant 24,25. S'il vous plaît cliquez ici pour rivaliserwa version agrandie de cette figure.
Figure 2. Quantitative Comparaison des NMDAR Localisation dans RGC dendrites. (A) Un histogramme montrant la distribution tangentielle immunologique pour GluN2A (n = 53 profils) et GluN2B (n = 56 profils) à l'intérieur et à l'extérieur du PSD. La région périsynaptiques a été divisé en 60 bacs nm. (B) Un histogramme montrant la densité de l'étiquetage des particules immunomarquage pour GluN2A (n = 53 profils) et GluN2B (n = 56 profils). Périsynaptiques la région est divisée en casiers 180 nm à partir du bord de la PSD. (C) un histogramme montrant la distribution tangentielle du nombre total de particules de immunomarquage pour GluN2A (n = 44 profils) et GluN2B (n = 3 profils) à tous les profils d'étiquetage au PSD. (D) Comparaison de la densité des particules deimmunomarquage à particules pour GluN2B (n = 53 et 33 profils) et GluN2A (n = 9 et 30) dans les membranes et périsynaptiques membrane mitochondriale, respectivement, dans les procédés RGC CTB-positifs. Ces histogrammes sont modifiés à partir d'histogrammes publiés dans Zhang et Diamant 24,25. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons décrit quatre techniques pour la réussite de l'intégration post-immuno EM quantitative: 1) à court et à faible fixation, 2) de gel-substitution, 3) post-intégration immunomarquage, et 4) la quantification.
EM immunologique permet la détection de protéines spécifiques dans des coupes de tissus ultraminces. Des anticorps marqués avec des particules d'or peuvent être directement visualisées en utilisant EM. Bien que puissante dans la détection de la localisation subsynaptic d'un récepteur membranaire, EM immunologique peut être techniquement difficile et nécessite une optimisation rigoureuse des méthodes de fixation et de traitement des tissus.
Pour un équilibre optimal entre l'intégrité de la membrane et l'antigénicité, nous avons testé différentes méthodes et moments fixation. Par exemple, un protocole utilisé avec succès pour les récepteurs NMDA postembedding EM au niveau des synapses centrales 19,20 n'a pas détecté l'immunoréactivité récepteurs NMDA dans la rétine. Cette étude a utilisé une fixation douce et courtes durées d'incubation àéviter de réduire de récepteur NMDA antigénicité après forte, la fixation prolongée 16.
Le procédé de congélation-substitution a été mis au point pour la localisation ultrastructurale des récepteurs du glutamate dans le 27 début des années 1990, et consiste à faible infiltration de température et la polymérisation dans une résine hydrophobe non polaire, HM20 28, nécessaire pour l'étiquetage optimale de postembedding immunologique. Le procédé de congélation-substitution spécifique utilisée ici a été développée pour les récepteurs du glutamate étiquetage dans la cochlée 29 et optimisée pour les récepteurs du glutamate au niveau des synapses centrales 18,19,20,30, et il a en outre été modifié au cours des dernières années. La faible infiltration de température et la polymérisation de la résine permet de préserver l'antigénicité des molécules thermolabiles et minimise l'extraction des lipides et des réactions chimiques indésirables entre la résine et le tissu 19,31. En combinaison avec les procédés de fixation décrits ci-dessus, cette méthode de congélation-substitution provides bonne antigénicité et la préservation structurale raisonnable.
La technique d'immuno postembedding utilisée ici présente plusieurs avantages par rapport au procédé preembedding à l'immunoperoxydase. Bien que le procédé preembedding l'immunoperoxydase a une sensibilité plus élevée 15,16,17,19,20,21, la diffusion du produit de réaction est inévitable, ce qui entraîne marquage non spécifique 26,32. En outre, la réaction enzymatique de la peroxydase est non linéaire 21, ce qui rend difficile d'évaluer quantitativement la localisation précise de récepteurs subsynaptic 18,21. Procédé de postembedding immunologique utilise un marqueur non diffusible et effectue la réaction immunologique à la surface du tissu enrobé dans une résine, ce qui réduit les artéfacts diffusibles et permet une meilleure résolution spatiale 18,33,34. Les particules d'or peuvent être comptabilisés directement, par ailleurs, ce qui permet d'estimer le nombre, la densité et la variabilité de ces récepteurs à la rétine ruban synabsides. En outre, postembedding immunologique permet la localisation des multiples récepteurs à examiner simultanément au niveau EM. Ce protocole a été utilisé avec succès pour identifier la localisation d'autres protéines membranaires (par ex., Les récepteurs de GABA et de potassium [BK] canaux calciques activés) dans la tige de la rétine 35 synapses bipolaires.
Plusieurs facteurs sont cruciaux pour le succès de ce protocole. Tout d'abord, rapide et en douceur fixation est la première étape importante pour la conservation de l'antigénicité et structure fine. Deuxièmement, le «pH-shift" protocole pour la fixation est bénéfique pour une détection optimale des épitopes antigéniques et une bonne conservation ultrastructurale 36. Troisièmement, geler substitution préserve l'antigénicité des récepteurs, tout en conservant la structure fine raisonnable. Quatrièmement, lors de la coloration immunologique, un tampon TBST (avec du Triton X-100) est utilisé avec un anticorps incubation, tout en tampon TBS (sans Triton X-100) est utilisépour le lavage entre et après l'incubation des anticorps; cela peut minimiser les altérations de la structure fine. Cinquièmement, lors de l'échange de solutions, les sections sont maintenus humides pour réduire les artefacts causés par le séchage des tissus.
Alors que le protocole d'immuno postembedding décrite ici fournit un procédé amélioré pour l'identification des récepteurs membranaires à la synapse ruban de la rétine, il est un peu moins sensible que les méthodes immunohistochimiques preembedding; mais celui-ci ne sont pas une bonne option, car ils souffrent de la spécificité relativement plus faible et se prêtent moins à la quantification comme indiqué ci-dessus. Notre protocole compromet également la structure fine dans une certaine mesure, par rapport à un tissu plus fortement fixe pas préparé pour immunomarquage. Heureusement, les innovations futures surmonter ces limitations.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les programmes intra-muros de l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NINDS) et l'Institut national sur la surdité et d'autres troubles de la communication (NIDCD), des National Institutes of Health (NIH). Nous remercions l'installation NINDS EM et l'avancée noyau NIDCD d'imagerie (Code # ZIC DC 000081-03) pour l'assistance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
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