Introduction
Glutamat er den viktigste eksitatoriske neurotransmitter i netthinnen 1. Gangliecelle (RGCs), som fikk glutamatergic synaptic innspill fra bipolare celler 2, er utgangsnerveceller i netthinnen som sender visuell informasjon til hjernen. Fysiologiske studier viste at synaptic eksitasjon av RGCs formidles postsynaptisk av NMDA reseptorer (NMDARs) og AMPA reseptorer (AMPARs) 3,4,5. Selv eksitatoriske postsynaptiske strømmer (EPSCs) i RGCs formidles av AMPARs og NMDARs 3,5,6,7,8, spontane miniatyr EPSCs (mEPSCs) på RGCs utviser bare en AMPARs-mediert komponent 4,5,9. Men å redusere glutamatopptak avslørte en NMDAR komponent i spontane EPSCs 5, noe som tyder på at NMDARs på RGC dendritter kan befinne seg utenfor eksitatoriske synapser. Membran-forbundet guanylate kinaser (MAGUKs) som PSD-95 som klynge nevrotransmitterreseptorer, inkludert glutamat reseptorer og ion-kanalens ved synaptiske områder, også stille tydelige subsynaptic uttrykk mønstre 10,11,12,13,14.
Over de siste tiårene, konfokal immunhistokjemi og pre-embedding elektronmikroskop (EM) immunhistokjemi har blitt ansatt for å studere membran reseptor uttrykk. Selv konfokal farging avslører brede mønstre av reseptor uttrykk, gjør sin lavere oppløsning det umulig å bruke for å skille subcellulære sted. Pre-embedding EM studier i pattedyr netthinnen indikerer at NMDAR subenheter er til stede i postsynaptiske elementer ved kjegle bipolar celle bånd synapser 15,16,17. Dette er i tydelig kontrast til fysiologisk bevis. Imidlertid diffusjon av reaksjonsproduktet er et velkjent gjenstand i den forhånds innstøping immunoperoxidase metode. Derfor betyr denne tilnærmingen vanligvis ikke gi statistisk sikre data og kan ekskludere skillet mellom lokalisering til synaptiske membran versus extrasynaptic membran 18,19,20,21. PåDerimot fysiologiske og anatomiske data er i overensstemmelse med en synaptisk lokalisering av AMPARs på RGCs 3,5,7,9,22. Således blir glutamatreseptorer og MAGUKs på retinal bånd synapse lokalisert ikke bare til den postsynaptiske, men også til de perisynaptic eller extrasynaptic membranlommer. Imidlertid er en høy oppløsning kvantitativ analyse av disse membran proteiner i en retinal bånd synapse fortsatt nødvendig.
Her har vi utviklet en postembedding EM immunogold teknikk for å undersøke subsynaptic lokalisering av NMDAR underenheter, Ampar subenheter og PSD-95 etterfulgt av å estimere antall, tetthet og variasjon av disse proteinene i synapsene ut mot rotte RGCs merkes med koleratoksin subenhet B (CTB) retrograd Tracing metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Stell og håndtering av dyrene var i samsvar med NIH Animal Care og bruk Committee retningslinjer. Postnatal dag (P) 15-21 Sprague-Dawley rotter injisert med 1-1,2% CTB bilateralt gjennom den overlegne colliculus, ble opprettholdt på en 12: 12-timers lys: mørke syklus.
1. Retinal Tissue Fixation
- Monter følgende materialer og verktøy: En dissekere mikroskop, 2 pinsett med veldig fine tips, saks, cellulose filter papir, plast pipette og et objektglass.
- Bedøve rotte i et lukket kammer med 2,0 ml halotan (en inhalant bedøvelse). Bestem tilstrekkelig anesthetization av disse metodene: mangel på uttak av bakre pote etter tå klype, eller mangel på blunkerefleksen. Deretter halshogge umiddelbart med en giljotin. Fjern øynene med et par av iris saks og plasser i en glassskål inneholdende 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB) ved pH 7,4.
- Bruke dissekere mikroskop, fjerne kornetea ved å kutte av fronten av øyeeplet. Ta ut linsen og glasslegemet fra den indre overflate retinal med pinsett.
- Skrelle sclera med de to tang til netthinnen er isolert fra eyecup.
- Skjær hinnen umiddelbart inn i 100 - 200 mikrometer tykke strimler med en barberhøvel, og med forbehold om pH-skift fiksering.
- Fiks retina strimlene i 4% paraformaldehyd i 0,1 M PB ved pH 6,0 til 20 - 30 For minutter og deretter i 4% paraformaldehyd pluss 0,01% glutaraldehyd ved pH 10,5 i 10 - 20 min ved RT.
- Etter flere vaskinger i PB med 0,15 mM CaCl2 (pH 7,4 ved 4 ° C), cryoprotect de retinale strimler med glycerol (60 min hver på 10%, 20%, 30%, O / N 30%) i 0,1 M PB før fryse substitusjon.
2. Freeze-substitusjon
MERK: Dette frysesubstitusjonsmetoden er endret fra et tidligere publiserte protokoll 19,20. Dessuten er det avgjørende at instrumentene er veldig kaldt (bruk hansker); otherwise, kan vevet tines delvis ved berøring med instrumentene. Alle disse trinnene er utført i AFS kammeret og instrumentene er aldri tillates å bevege seg over kanten av kammeret. Tilsvarende er nødvendig kjøling av alle kjemikalier som brukes i AFS.
- Stup-fryse netthinnens strimler i flytende propan ved -184 ° C i en EM kryokonservering instrument (CPC). Ved hjelp av en fin pensel, plasserer prøvene på små biter av dobbel-stick tape festet til metall stubber som går på slutten av stuper stenger (veke av ekstra buffer bruker pensel).
- Styrter stengene i det flytende propan og holder der i omtrent 5 sekunder, og deretter overføre til den automatiske fryse-substitusjon instrument (AFS) ved hjelp av et lite transportkammer som er fylt med flytende nitrogen ( 'LN to avkjølte cryo Overføringsbeholderen').
- Etter å ha plassert den frosne prøven og instrumenter (pinsett og skalpell) inn i AFS, kjøle instrumentene i kammeret for seVeral minutter før du tar på vev, eller kjøle dem ved å plassere tuppen av instrumentene i noen sekunder inn i den lille transport kammer (fylt med flytende nitrogen ( 'LN 2 avkjølt cryo overføring beholder')).
- En gang i AFS, fjern prøven og tape fra stubben med en fin skalpell. Også holde nitrogengassen flytkontroll, TF (TF er beskrevet som en regulator for styring LN 2 fordamperen ') åpen under disse prosedyrene.
- Før plassere frosne vevet inn de flate-embedding holdere (dvs., før du setter opp AFS), kuttet en tynn sirkel fra en klar plast ark og legg den inn i bunnen av holderen, slik som å linje bunnen av hver brønn. Dette gir relativt enklere fjerning av polymeriserte prøve blokkene når du er ferdig.
MERK: Tidligere brukte vi en alternativ metode til de flate embedding holdere, og syssels doble Reichert + gelatinkapsler (se Petralia og Wenthold, 1999) <sup> 20. - Bruk følgende automatiske sekvens i AFS (ved hjelp av instrument terminologi): T1 = -90 ° C i 32 timer, S1 = øke temperaturen med 4 ° C / time (11,3 timer), T2 = -45 ° C i 50 timer, S2 = øke temperaturen med 5 ° C / time (9 timer), T3 = 0 ° C i 40 timer (total = 142,3 timer). Det kan ta 2 - 4 timer for å plassere prøvene i AFS (ved -90 ° C) før start av tidsbestemt sekvens.
- Dypp de frosne delene i 1,5% uranyl acetat i metanol ved -90 ° C i> 32 timer i AFS. Plasser to stykker av vev (vanligvis) i hver av de sju brønnene i flat-embedding aluminium holderen (tre passer inn i AFS).
- Plasser vevet + kassett i uranylacetat / metanol i brønnene og fjerne tapen senere, like før begynnelsen innstøpningsmediet (for eksempel Lowicryl HM20) infiltrering, hvis det er for vanskelig å fjerne vev fra båndet.
- Deretter øke temperaturen trinnvis til -45 ° C (+ 4 ° C per time; i den automatiske sekvens).
- Vask prøvene tre ganger i forkjølt metanol, ved hjelp av en tynn plast pipette for å fjerne den gamle løsningen fra hver flat-embedding holder, og deretter bruke en annen standard plast pipette for å legge den forkjølte frisk metanol.
- Deretter bruker den samme metoden, infiltrere prøvene progressivt med lave temperaturer embedding harpikser som innstøpningsmediet (HM20 / metanol ved 1: 1 og 2: 1, hver for 2 timer, etterfulgt av ren harpiks for 2 timer og deretter endre harpiks og hold O / N).
- Endre harpiks på nytt neste dag, justere nivået av harpiksen for å nå bare til den øvre kanten av brønnene.
- Polymerisere prøvene (-45 ° C til 0 ° C i automatisk sekvens; + 5 ° C per time) med UV-lys i 40 timer.
- Ta deretter prøvene fra AFS. Vanligvis prøvefeltene viser fortsatt noen små lyserøde vesenene i fargen. Plasser prøvene nær fluorescerende lys i avtrekksskap, på RT O / N eller lenger før de appøret helt klart.
3. Postembedding EM immungull Immunocytochemistry
MERK: Postembedding immunocytochemistry utføres som beskrevet 23,24,25.
- Klipp 1 mikrometer seksjoner med ultramicrotome, beis seksjoner med 1% toluidin-blått, og undersøke dem for seksjon orientering; orientere vevsblokk for å oppnå den optimale tverrplan for seksjonering.
- Klipp 70 nm tykke supertynne seksjoner med ultramicrotome og samle dem på Formvar-karbon-belagte nikkel spille nett.
- Vask rutenett en gang i destillert H2O, fulgt av en Tris-bufret saltvann tre ganger (TBS, 0,05 M Tris-buffer, 0,7% NaCl, pH 7,6) vask.
- Inkuber gittere i 20 pl dråper av 5% BSA i TBS i 30 minutter, og deretter i 20 ul dråper av en blanding inneholdende geit anti-CTB (1: 3000) og et antistoff til en NMDAR-subenhet (anti-kanin GluN2A 01:50 , GluN2B 01:30), eller et anti-kanin GluA2 / 3 (01:30)i TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) med 2% BSA og 0,02 M NaN3 O / N ved RT.
- Vask gittere på tre separate dråper (20 ul) i TBS (pH 7,6) for 10, 10 og 20 min, etterfulgt av TBS (pH 8,2) i 5 minutter.
- Inkuber gittere i 2 timer med dråper (20 ul) av en blanding inneholdende esel-anti-kanin IgG (1:20) som er koplet til 10 nm gullpartikler og esel anti-geite-IgG (1:20) som er koplet til 18 nm gull-partikler i TBST (pH 8,2) med 2% BSA og 0,02 M NaN 3.
- Vask gittere i 20 pl dråper av TBS (pH 7,6) i 5, 5 og 10 min, deretter i ultrarent vann, og deretter tørke dem.
- Counterstain rutenett med 5% uranylacetat og 0,3% bly citrate i destillert H 2 O for 8 og 5 min under mørke forhold, henholdsvis.
- For trippel-merkingseksperimenter, inkuber gittere O / N ved RT med 20 pl dråper av en blanding av anti-geit CTB (1: 3000), anti-mus PSD-95 (1: 100), og anti-kanin GluN2A (1 : 50). Deretter inkuberes nett for 2 timer på 20 ul dråper av en blanding av IgG'er koplet til 18, 10, og 5 nm gullpartikler i TBST (pH 8,2) med 2% BSA og 0,02 M NaN3. Hold de samme prosedyrene som dobbel merking for vasking og kontra mellom og etter antistoff inkubasjon.
- Kontroller ble utført i hvilken de sekundære antistoffer ble anvendt alene.
- Vis rutenett på en EM og digitalbilder. Behandle endelige tall i Adobe Photoshop 6.0 for lysstyrke og kontrast hvis det er nødvendig 24.
4. Kvantifisering
- Manuelt utvalgte områder av indre plexiform lag (IPL) uten hull eller sprekker i 8,000X forstørrelse, så tilfeldig fotomontasje full dybde av IPL på 25,000X forstørrelse.
- Identifisere RGC dendritter ved kjegle bipolare dyader når de a) inneholder den retrograd transporteres CTB signal (større gullpartikler), b) oppviser veldefinert membraner, leppe- ganespalte og postsynaptisk tettheter, c) inneholder minst to små gull delericles innenfor PSD, eller mer enn en liten gull partikkel langs extrasynaptic plasmamembranen.
- Samle 45 - 55 RGC dendritter, basert på ovennevnte kriterier, for kvantitativ analyse.
- Måle lengdene av PSD og extrasynaptic plasmamembranen av individuelle RGC dendritter med NIH ImageJ programvare. Telle gullpartikler innenfor 10 nm av membranen som membran-assosiert, basert på en gjennomsnittlig tykkelse på 7 - 9 nm til plasmamembranen 26.
- Beregn partikkeltetthet som antall gullpartiklene per lineær mikrometer (gull / um). Mål avstanden mellom midten av hver partikkel gull og midten av PSD (for synaptisk sted) eller kanten av PSD (for extrasynaptic sted).
- Utføre statistisk analyse av programvare. Bruk to-tailed t-tester for å sammenligne midler. Avslutt betydning når P <0,05. Dersom ikke annet er angitt, rapport verdier som gjennomsnitt ± SEM 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene som presenteres her viser påfallende forskjellige subsynaptic lokaliseringsmønstre GluA 2/3 og NMDARs på RGC dendritter i rotte netthinnen, som beskrevet tidligere 24,25. 77% av GluA 2/3 immungullpartikler i RGC dendrittiske profiler ble plassert inne i PSD (figur 1A), i likhet med de fleste sentrale synapser. Men NMDARs ble plassert enten postsynaptisk eller extrasynaptically. 83% av GluN2A immungullpartikler ble lokalisert i PSD (figur 1C, 2A, 2B), fortrinnsvis ved OFF synapser, og gullpartiklene var mer konsentrert på midten av PSD (figur 2C). I motsetning til dette, ble det store flertall av partikler som merking for GluN2B (96%) som befinner seg utenfor den PSD (figur 1B, 2A, 2B), fordelt hovedsakelig langs extrasynaptic plasmamembranen, med topp partikkel tetthet ved 180 nm fra kanten av PSD (figur 2B). Spesielt GluN2B viste en preferanse for PÅ synapser. I en undergruppe av eksperimenter, samtidig merking av GluN2A, PSD-95 og CTB indikerte at GluN2A og PSD-95 ble colocalized i PSD av OFF RGC dendritter (figur 1D), hvor NR2A var i dendrittiske membranen mens PSD-95 var under membranen, noe som tyder på at de er forankret i PSD. Det ble observert en signifikant forskjell i densitet mellom gull perisynaptic membran og mitokondrielle membraner, noe som tyder på en spesiell merking i den førstnevnte (figur 2D).
Figur 1. immungullmerkings Viser Synaptic og Perisynaptic lokalisering av glutamatreseptorer på RGC dendritter Merket av CTB. (A): dobbelt immunogold merking av GluA2 / 3 (10 nm gull) og CTB (18 nm gull). Presynaptiske bånd indikert av pilspisser. liten gold partikler er gruppert (pil) i PSD av RGC prosesser. (B) dobbelt immunogold merking av GluN2B (10 nm gull) og CTB (18 nm gull); små gullpartikler (pil) er på den extrasynaptic plasmamembranen. (C) dobbel immunogold merking av GluN2A (10 nm gull) og CTB (18 nm gull). I likhet med GluA2 / 3, er små partikler gruppert i PSD. (D) Triple immunogold merking av GluN2A (5 nm gull), PSD-95 (10 nm gull) og CTB (18 nm gull). GluN2A gullpartikler (små piler) og PSD-95 gull partikler (store piler) er samlokalisert i PSD på individuelle CTB-positive RGC dendritter. Innfelt: høyere forstørrelse av PSD. Skala: 0,1 mikrometer (A = C = D, B). Dette er nye mikrografer basert på data publisert i Zhang og Diamond 24,25. Klikk her for å viewa større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kvantitativ Sammenligning av NMDAR Lokalisering i RGC dendritter. (A) Et histogram som viser den tangentielle fordelingen av en immun for GluN2A (n = 53 profiler) og GluN2B (n = 56 profiler) innenfor og utenfor PSD. Den perisynaptic regionen ble delt inn i 60 nm binger. (B) Et histogram som viser merking tetthet av immungullpartikler for GluN2A (n = 53 profiler) og GluN2B (n = 56 profiler). Den perisynaptic regionen ble delt inn i 180 nm binger fra kanten av PSD. (C) Et histogram som viser den tangentiale fordeling av det totale antall partikler som en immun for GluN2A (n = 44 profiler) og GluN2B (n = 3 profiler) ved alle profiler med merking i PSD. (D) Sammenligning av partikkeltetthet aven immun partikler for GluN2B (n = 53 og 33 profiler) og GluN2A (n = 9 og 30) i de perisynaptic membraner og mitokondriemembranen, henholdsvis i CTB-positive RGC prosesser. Disse histogrammer er endret fra histogrammer publisert i Zhang og Diamond 24,25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet fire teknikker for vellykket kvantitativ post-embedding immunogold EM: 1) kort og svak fiksering, 2) fryse substitusjon, 3) post-embedding immunogold flekker, og 4) kvantifisering.
EM en immun tillater påvisning av spesifikke proteiner i ultratynne vevssnitt. Antistoffer merket med gull-partikler kan direkte visualisert ved anvendelse EM. Mens kraftig påvise subsynaptic lokalisering av en membran reseptor, kan EM immunogold være teknisk utfordrende, og krever strengere optimalisering av vev fiksering og bearbeidingsmetoder.
Å stryke en optimal balanse mellom membran integritet og antigenisitet, testet vi ulike fiksering samt ganger. For eksempel, en vellykket protokoll som brukes for postembedding EM NMDAR på sentrale synapser 19,20 ikke klarte å påvise NMDAR immunreaktivitet i netthinnen. Denne studien benyttet skånsom fiksering og kort inkubasjonstid tilunngå å redusere av NMDA reseptor antigenisitet etter sterk, langvarig fiksering 16.
Frysesubstitusjonsmetoden ble først utviklet for ultrastructural lokalisering av glutamatreseptorer i begynnelsen av 1990-tallet 27, og innebærer lav temperatur infiltrasjon og polymerisasjon i en upolare, hydrofobe harpiks, HM20 28, som er nødvendig for optimal postembedding immunogold merking. Den spesifikke frysesubstitusjonsmetode som brukes her er utviklet for merking av glutamatreseptorer i sneglehuset 29 og optimalisert for glutamatreseptorer i det sentrale synapser 18,19,20,30, og det har blitt modifisert ytterligere i de senere år. Den lave temperatur infiltrasjon og polymerisering av harpiksen bidrar til å bevare antigenisiteten til varmelabile molekyler og reduserer lipid ekstraksjon og uheldige kjemiske reaksjoner mellom harpiks og vev 19,31. Kombinert med festefremgangsmåtene beskrevet ovenfor, dette fryse-substitusjonsmetoden provides god antigenisitet og rimelig strukturelle bevaring.
Den postembedding en immun Teknikken som brukes her har flere fordeler sammenlignet med den preembedding immunperoksydase metoden. Selv om preembedding immunperoksydase metoden har høyere følsomhet 15,16,17,19,20,21, diffusjon av reaksjonsproduktet er uunngåelig, noe som resulterer i ikke-spesifikke merking 26,32. Videre er peroksydase enzymreaksjonen ikke lineær 21, noe som gjør det vanskelig å vurdere kvantitativt nøyaktig subsynaptic lokalisering av reseptorene 18,21. Den postembedding en immunFremgangsMåten anvender et ikke-diffunderbart markør og utfører immunoreaksjon på overflaten av harpiks innleiret vev, noe som reduserer diffusible gjenstander og tillater høyere romlig oppløsning 18,33,34. Gullpartikler kan være direkte telles, dessuten gjør det mulig å beregne antall, tetthet og variasjon av disse reseptorene ved retinal bånd synapsidene. I tillegg postembedding en immun muliggjør lokalisering av flere reseptorer som skal undersøkes samtidig på EM-nivå. Denne protokollen har blitt ansatt for å identifisere lokalisering av andre membran proteiner (f.eks., GABA reseptorer og kalsiumaktiverte kalium [BK] kanaler) i retinal stavbipolar synapser 35.
Flere faktorer er avgjørende for å lykkes med denne protokollen. Først, rask og skånsom fiksering er den første viktig skritt for bevaring av antigenisitet og fin struktur. For det andre, "pH-shift" protokoll for fiksering er gunstig for optimal deteksjon av de antigene epitoper og god ultrastructural bevaring 36. For det tredje, fryse-substitusjon beholder antigenisiteten til reseptorene, og samtidig opprettholde rimelig fin struktur. For det fjerde, i løpet av en immunfarging, TBST-buffer (med Triton X-100) brukes sammen med antistoff inkubasjon, mens TBS-buffer (uten Triton X-100) blir bruktfor vasking mellom og etter inkubasjon av antistoffer; dette kan minimere endringer i fin struktur. Femte, under utveksling av løsninger, er deler holdes våt å redusere artefakter forårsaket av vev tørking.
Mens postembedding en immun protokoll som er beskrevet her tilveiebringer en forbedret fremgangsmåte for å identifisere membranreseptorer på retinal båndet synapse, er det ikke fullt så følsom som preembedding immunhistokjemiske metoder; men sistnevnte er ikke et godt alternativ fordi de lider av forholdsvis lavere spesifisitet og er mindre mottagelig for kvantifisering som angitt ovenfor. Vår protokoll kompromisser også fin struktur til en viss grad, i forhold til sterkere fiksert vev ikke forberedt for immunolabeling. Forhåpentligvis vil fremtidige innovasjoner vinne disse begrensningene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av egenutført programmer av National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (NINDS) og National Institute on døvhet og Other Communication Disorders (NIDCD), av National Institutes of Health (NIH). Vi takker ninds EM anlegget og NIDCD avansert bildebehandling kjerne (kode # ZIC DC 000081-03) for å få hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutaraldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultramicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4,000 |
References
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
- Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
- Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
- Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
- Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
- Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
- Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
- Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
- Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
- Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
- Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
- Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
- Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
- Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. Ariano, M. A. , Wiley. New York. 46-74 (1998).
- Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
- Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
- Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
- Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
- Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
- Peters, A., Palay, S., Webster, H. The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , Oxford University Press. New York. (1991).
- Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
- Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
- Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
- Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
- Merighi, A. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. Polak, J. M., Priestley, J. V. , Oxford University. New York. 51-87 (1992).
- Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
- Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
- Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
- Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
- Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).
