Abstract
NMR 기반 조사의 주요 제한은 낮은 감도이다. 이 때문에 대사 변환의 실시간 NMR 측정을 방지, 긴 획득 시간에 대한 메시지를 표시합니다. 용해 DNP 통해 과분극 감도의 일부 전자 간 핵 스핀 분극 전송 따른 대형 밖으로의 평형 자화 핵 덕분 발행 우회. 얻어진 고 NMR 신호는 실시간으로 화학 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 과분극 NMR의 단점과 관련된 완화 시간 상수의 주문에 유리한 경우에는 핵 스핀 종 완화 시간 상수, T (1) 또는 주문에 통상 신호 수집에 대한 가능한 제한 시간대에 존재 결합 된 핵의 단일 상태, T LLS. 내인성 분자 대사 비율의 세포 흡수는 종양 발생 및 약물 반응에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 뉴merous 이전 과분극 NMR 연구는 생체 내에서 효소 활성을 모니터링하기위한 대사 기질로서 피루브산의 관련성을 보여 주었다. 이러한 작업은 특히, 분극 NMR에 의해 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 존재하에 피루브산 투 락트산 전환율을, 효소 반응의 연구에 필요한 실험 장치 및 방법의 상세한 설명을 제공한다.
Introduction
동적 핵 편광 (DNP), 1,2- 즉, 핵 스핀 분극, '최대'와 '아래'스핀 인구 (P = 사이의 불균형을 향상시키기 위해 설계된 기술 [N ↑를 - N ↓] / [N ↑ + N ↓), 먼저 1950 년대에 도입되었다. 이러한 13 C 핵 스핀은 일반적으로 1 K 정도의 온도에서 생물학적 응용 프로그램에 대한 돌파구가 와서 3.357의 자기장 T. 3,4에 유리한 조건에서 P = 10 -1까지 편광 될 수있다 배. 저온에서 얻어진 높은 핵 편광 상태를 유지하면서 가열 된 물을 냉동 편광 샘플을 용해시키는 것으로 구성 용해 DNP 개발 2000 년대 초반 5 액상 NMR 신호 향상 10 3 -10 4에 비해 공유지RT NMR 조건 열적 편광. 용해 DNP 따라서 1 초 이하의 시간 해상도와 NMR에 의해 모니터링 역학 있도록 실시간 시츄 비 침습적으로 측정 생화학 반응 속도하는 방법을 제공 6 -. (10) 또한 매우 낮은 농도에서 분석 물을 검출하는 것이 가능하게되었다 (11).
비 침습적 분자 영상 방식 중 과분극 NMR 동시에 기판과 실시간으로 그 대사 산물을 측정 할 수있는 유일한 방법이다. 용해 DNP는 신진 대사의 현장 모니터링과 관련된 임상 MRI (12)과 가장 유망한 응용 프로그램에 시험관 NMR에 이르기까지 다양한 과학 분야에서 열정과 받았습니다. 13, 14 용해 DNP의 주요 제한은, 그에 시간 이후 다섯 번 세로 완화 시간 상수 T (1)의 순서는 극성 향상된화는 손실됩니다. 비교적 긴 T 1을 나타내는 핵 스핀 담지 분자를 사용하는 것이 필요하다. 편광 향상의 시간 간격을 연장하기 위해, 수명이 긴 상태 (LLS)로 알려진 핵 스핀 상태를 느리게 편안하게 사용할 수있다 (15) -. 17 LLS가 너무, 인트라 페어 쌍극자 - 쌍극자 상호 작용 둔감 T LLS 특이한 완화 시간 상수. T (1)보다 훨씬 긴 수십분의 자화 수명이 18 일 수 있고, 1 시간까지 따라서 수득 될 수 19, 20 및 LLS가 자기 공명 분광법 모두 제안되어있다 (MRS) 및 MRI. (21)
신중 과분극 NMR에 의해 효소 반응 속도 연구를 위해 최적화 될 필요가 주요 포인트는 (ⅰ) 고체 편광을 최대화하고 (ⅱ)에서 분극 용액 전송 중에 분극 손실을 최소화NMR 분광계에 편광판. 이 문서에서는 효소 반응을 연구하기 위해 주문 제작 용해 DNP 장치 및 주입 시스템의 적응을 설명합니다. 특성 설정의 성능은 잘 알려져 있고 널리 사용되고 과분극 기판 [1-13 C] 피루브산으로 설명 될 것이다. 초, 몇 분 동안 모니터링 반응을 허용하고,에서의 중심적인 역할이 선택하는 주된 이유는, 첫째, 자연스럽게 긴 13 C 종 완화 시간이다 (높은 자기장 및 293 K 이상의 온도에서 T 1> 50 초) 용해 DNP NMR 및 정의 개발 분사 시스템, 락트산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 촉매 피루브산의 산화를 이용하여 암 대사. (13, 14)은 비 표지 락트산 9,22의 초기 풀 또는 첨가없이 비 표지 락트산 존재를 모니터링 할 수있다 , 다음과 같이. [1- (13) C] 락 테이트 신호가 VI에서 측정 된 것으로 밝혀졌다과분극 [1- (13) C] 피루브산의 주입 다음 (세포 포함) VO 인해 피루브산과 젖산 사이보다는 젖산 생산 빠르고 라벨 교환에 주로. (6)
우리는 본원에서 LDH를 함유하는 NMR 튜브하지만 초기없이 락트산 주입 과분극 [1-13 C] 프로피온산의 [1-13 C] 락트산 실시간 생산을 제시한다.
시스템 설명
DNP 편광판 및 NMR 분광계 : 용해 DNP 설정에서 두 개의 주요 부품 (그림 1)가 있습니다. DNP 편광자의 주요 요소는 펌핑 헬륨 욕에서 약 1 K에 샘플을 냉각으로 저온 유지 장치이다. 저온 유지 장치는 3.35 T의 초전도 자석 삽입 및 자석 (도 1)의 등각의 편광 샘플을 갖도록 보장하는 형상을 갖는다. 저온 유지 장치 내에서 샘플 (A) (B)의 편광을 측정하기 위해, NMR 코일 (B)에 둘러싸여uildup, overmoded 마이크로파 공동 (c)에 포함 하였다. 전체 샘플을 펌핑 헬륨 조 (d) 낮은 온도로 유지하고, 도파로를 마이크로파 조사한다. 전체 시스템은 주문 제작 소프트웨어 (그림 2D)에 의해 관리됩니다.
하드웨어 및 DNP를 수행하는 데 필요한 장비 및 극저온 후속 용해 여전히 기술적 도전이다. 새로운 DNP의 저온 유지 장치 23, 24 개발 및 극저온 성능을 확인하기 위해 테스트 한 후 작동시 빠른 냉각, 헬륨 대기 시간 및 전반적인 최소한의 헬륨 소비에 최적화되었다.
저온 유지 장치는 두 개의 부분으로 구성되어 있습니다. 저온 유지 장치의 첫 번째 부분은 꼬리 또는 표본 공간 (b) 및 외측 진공 챔버 (OVC)는 높은 진공 하우징하에 유지 (A)는 대략 상단에서 분리 될 수있는 절연 듀어 (도 2A)는 방사선의 화면 (c). 그라 이오 스탯의 두 번째 부분의 주요 인르트 (그림 2B)는, 모든 흐름 규정이 관리되는 절연 듀어로 배치했다. 이송 라인 ()을 통해 외부 기억 듀어 오는 액체 헬륨 (b) 세퍼레이터 응축 첫번째 단계에, 중간 챔버는 저온 유지 감기 상부 유지하고 증발 헬륨을 제거하는 동시에 사용 전송 중. 분리 압력은 저온 유지 장치의 윗부분을 감싸 모세관 (c)를 통해 펌프에 의해 저하되고 이 모세관 차가운 헬륨 흐름 절연 듀어 (OVC)의 배플 (d) 상기 방사선 화면을 냉각하는데 사용된다. 샘플은 샘플의 공간에 배치되고 편광된다. 표본 공간은 주 저온 유지 인서트의 꼬리 감싸 다른 모세관 (E)을 통해 분리기에 연결된다. 이 모세관 수동 외부로부터 조작 니들 밸브를 개폐 할 수있다.
DNP 홍보 중에 사용 저온을 달성하기 위해,ocess, 액체 헬륨 저온 유지 샘플 공간에서 수집해야하고 그 압력 밀리바 범위로 낮췄다. 저온 유지 장치 작동에 필요한 작업은 펌프, 모니터링 및 전자 및 전기 정비사 장치 (그림 2C)와 다른 지점에서 운영하는 세 가지 세트로 다소 복잡한 펌핑 시스템을 통해 수행됩니다. 저온 유지 OVC는 제 배기계에 의해 고진공으로 펌핑 될 필요가있다. 이 시스템은 로터리 펌프 (a)에 의해 백업 터보 분자 펌프로 구성된다. 액체 헬륨 저온 유지 분리기 저온 유지 전송선 유입구를 통해 상기 저장 듀어 (b)에서 전송된다. 분리는 두 번째 펌핑 세트에 연결된 콘센트가 있습니다. 이 세트는 35m 3 / hr이고 멤브레인 펌프 (c)로 구성된다. 이 줄은 듀어로부터 분리 냉각 동안 전송하는 동안 삶은 헬륨 가스를 제거하는 허용한다. 세퍼레이터 회수 액체 헬륨은 캡을 통해 표본 공간에 전달 될 수있다illary 튜브 상술. 65m 3 / 시간 로터리 펌프 (d)에 의해 백업 펌프 범위 250m 3 / HR 뿌리 이루어지는 제 펌핑 시스템 밀리바하는 표본 공간에이어서 하위 샘플 공간 압력 분리기로부터 액체 헬륨을 전송할 서, 나비 형 밸브 (E)를 통해 저온 유지 장치에 접속된다.
모든 진공 시스템 동작을 제어 및 전공 주문품 장치 (F)에 의해 조절된다. 이 장치는 저온 유지 분리기 (g) 및 표본 공간 (H) 출구, 제 / 제 펌핑 시스템 (c, d), 압축 된 헬륨 병 (I)와 외부 사이의 진공 라인 연결을 제어한다. (F)와 외부 사이의 통신은 일방향 밸브 (j)를 통과한다. 전기 - 공압 장치 (F)뿐만 아니라 모든 시스템 파라미터 및 용해 하드웨어는 일반적인 PC와 맞춤형 전자 장치 USB 인터페이스에 의해 관리 및 운영된다. 전자를 통해 최종적으로 모든 시스템장치가 관련 작업이 소프트웨어 버튼을 사용하여 인터페이스를 통해 시작되는 맞춤형 독립 소프트웨어 (그림 2D)에 의해 관리됩니다.
샘플을 관리하는 일련의 인서트가 사용되는 고체 상태 (도 3a)의 NMR 신호 축적을 측정한다. 편광의 저온 유지 장치를 준비하려면, 저온 유지 장치에 기본 샘플 인서트 ()를 배치합니다. 메인 샘플 인서트 overmoded 금도금 마이크로파 공동 내에 배치 NMR 코일 (B)가 제공된다. 예비 동결 용액을 함유 기판은 적절한 샘플 용기에 액체 질소 온도 (용액 편광)을 편광 및 유리 섬유 샘플 홀더 (c)의 하부 단부에 배치된다. 자석 등각 점에 도달하는 주요 샘플 삽입에 샘플 홀더를 밀어 넣습니다. 샘플 홀더에 금 도금 도파관 (d)를 삽입합니다. 도파관은 외부 마이크로 웨이브 소스에서 생성 된 전자가 최소한의 손실 t 함께 여행 할 수 있습니다샘플을 오.
저온 유지 관리를위한 맞춤형 소프트웨어, 다양한 동작들이 재사용 같이 (저온 유지 온도는, 액체 헬륨 온도에 가깝게 낮아진다) 저온 유지 장치가 소정의 수준으로 액체 헬륨으로 충전 (충전 대응 인터페이스 버튼을 클릭시, 자동 처리 ) (액체 헬륨 욕 최저 온도를 달성하기 위해 펌핑) T ≈ 1 K로 가압 냉각 부가 공정 (저온 유지 장치는 10-30 mbar의 위험없이 저온 유지 개구를 허용 = P에서 실내 압력 이상 약간 가압 항공 저온 유지 장치의 오염) 용해 (DNP 샘플을 용해 및 측정 부위, 즉 NMR 분광기)로 얻어진 용액 과분극을 자동 전송하는 절차.
편광은 편광 필드 B 0 (94 GHz에서 전자 레인지와 샘플을 조사 수행 T DNP는 편광 축적 시간이다. T DNP 지정된 필드의 온도에서 고체 상태에서 대상 핵의 종 완화 시간와 동일한 오더의 크기 3 T DNP 후에 편광 여겨진다. 모든 실험에서 시료를 5 개 이상 T DNP에 대한 편광했다.
분극 시간의 끝에서, 샘플은 효소 활성의 측정에 사용하기 위해 RT 용액에 용해되어야한다. 용해 과정 용해 인서트 (도 3b)의 보일러 과열 D 2 O 5 ml의 DNP 향상된 시료 도달을 용해 압축 헬륨 가스 (P = 6-8 바)에 의해 가압된다. 얻어진 용액 과분극 용해 삽입 출구를 통해 압축 된 헬륨 가스가 용해 삽입 밀려 (도 3C-B 23 밀리 초 (300)은 약 3 초이다.
용해 공정은 용해 인서트 (도 3b)을 이용하여 수행된다. 용해 인서트 전자 공압 어셈블리로 구성되어있다 (a) 샘플 누설 밀접한 결합을 가능 공압 어셈블리 보일러 시료 용기 로커 (c) 사이의 연결 튜브를 포함하는 탄소 섬유 스틱 (b) 컨테이너, 다시 콘센트에 연결할 수 있습니다. 전공 어셈블리 (그림 3C)를 생성하고 샘플 용기에 탄소 섬유 스틱을 통해 과열 D 2 O를 구동 한 후 저온 유지 장치에서 분극 된 솔루션을 추출하는 데 사용됩니다. 전공 조립체 공동 간의 연결을 제어하는 에어 밸브 (A)로 구성되어있다mpressed 헬륨 (P = 6-8 bar)의 라인 (b), 탄소 섬유 스틱 내지 D 2 O 밸브 (D)를 통해 분사되는 보일러 (c)와 출구 (E) (F). 시스템은 압력 G, 온도계 및 보일러 (c)에서 가열 저항 와이어, 트리거 (H)와 연결 박스 (ⅰ) 전자 관리 장치 시스템을 인터페이스하는 데 사용하여 완성된다.
DNP의 저온 유지 장치 및 NMR 분광계는 전송 라인, 즉 용해가 트리거 과분극 용액 가압 헬륨에 의해 가압 된 내부 2mm 내경 (P = 6-8 바)의 PTFE 튜브에 의해 연결된다.
용출 순서는 다음과 같은 작업으로 구성된다 : 첫 번째 300 밀리 초에서 과열 D 2 O는 분극 냉동 용액을 용융 및 용해하기 위해 샘플 용기에 가압된다. 그 후, 과분극 솔루션은 대가의 평균에 의해 저온 유지 장치에서 추출이 가해 (P = 6-8 bar)의 주입 단계에 기재된 절차 중 하나를 사용하여 수행되는 측정 부위에 헬륨 가스 2mm 내경 PTFE 튜브를 통해 가압 (도 3C-E) 6.2.1 또는 6.2 단계 .2.
용해 DNP NMR 설치의 2 성분은 NMR 분광계이다. 본 명세서에 설명 된 설정에서 NMR 분광계 필드 0 B = 11.7 테슬라에서 동작한다. 5mm의 NMR 프로브 용해 후의 분극 신호를 측정하는데 사용된다. NMR 분광계는 고체 및 액체 상태 모두 NMR 측정에 사용 NMR 콘솔을 통해 작동하고, 회사가 제공하는 소프트웨어 XWinNMR된다. 일반적인 측정이 낮은 플립 각도 하드 펄스로 구성되어 신호 인수 다음에 (중 liquidstate 또는 취소 교정 고체 측정을 위해, 보정).
고체 상태 열 편광 신호 및 DNP 파생시의 측정gnal 축적은 NMR 분광계에 결합 된 DNP 편광판 (그림 3AB)의 사이트에서 주문 제작 (13) C 코일을 사용하여 수행됩니다. 이 특정 상황에서 NMR 분광계는 신호 잠금을 수행하지 않습니다. 고체 상태의 측정이 수행 될 때, 편광이 크게 교란을 피하기 위해, 인수 사이의 시간 지연은 약 0.5 이상 T DNP보다 충분히 있어야한다.
고체 향상은 다음과 같이 정의된다 
어디에 
분극 신호 (단계 3.3에서 얻어진 것)되고 
(단계 3.2 펌핑 액체 헬륨 온도에서 열 평형에서 얻어진 것), 고체 상태 신호 (도 4a)이다. 이 매개 변수 d를과분극 솔루션의 전송 중에 피할 수없는 손실 이전 NMR 실험에 사용할 수있는 최대 편광을 efines. 측정은 미 보정 낮은 플립 각 펄스를 사용하여 단순한 펄스 - 획득 시퀀스로 수행된다. 펄스 교정은 일반적으로 solidstate 측정 건너 뜁니다.
유사한 절차는 액체 상태의 분극 신호 향상을 결정하는데 사용될 수있다. 이 경우, 사출 전에 분광계 관에 넣고 시료 (단계 6.2) D 2 O 500 μL 구성된다 용해 및 주입 한 후, 모니터링 할 두 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. 우선, NMR 분광기 사이트 과분극 향상된 것으로 
(그림 4B) 
신호는 하이퍼 주입 이후 (단계 7.1에서 수득 한) 편광 용액 
열 편파 신호 (단계 7.2에서 수득)이다. 두번째는 기판 (단계 7.1에서 얻어진 지수 피팅에 의해 얻어진 신호) 각 대사 산물과 관련된 종 완화 시간 T (1) (도 4B, 삽입)된다. 이러한 두 파라미터에 충분한 신호 대 잡음비 (SNR) 및 대사 변형의 측정에 사용할 수있는 시간 윈도우를 획득하기 위해 필요한 최소한의 기질 농도를 정의한다. 고체 편광의 비율 
및 liquidstate 편광 
과분극 솔루션 전송 중에 인해 휴식에 편광 손실의 추정치를 제공합니다. 값ation12 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "너비 ="80 "/> 휴식 손실의 부재에서 관찰되어야한다.
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Protocol
주 : 모든 데이터 분석은 상용 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다.
1. 편광 솔루션을 준비
- 1.12 M (13) C 표지 피루브산 나트륨 2 mL를 준비 (NA + [CH 3 COO -CO- 13] - 기질) 용액 라디칼 TEMPOL 33 mM의 도핑 (4- 히드 록시 2,2,6,6- 테트라 -1- 옥실, 편광 에이전트) 4 2 : 1 D 2 O / D 13 C 관측 6 에탄올. 주의 : 취급주의로 인해 D (6) 에탄올의 가연성 자연에주의해야합니다.
- 라디칼 농도가 달성 편광면에서 최적인지 확인합니다.
- (30 MM 또는 35 mm로, 예를 들어) 약간 점 1.1에서 용액의 급진적 인 농도를 변경합니다.
- 반복적으로, 고체 개선을 결정한다 (스텝 3), 최대 향상 리드 라디칼 농도를 찾아.
2. Polarizat이온
- 재사용 대기 절차를 통해 DNP의 저온 유지 온도를 낮 춥니 다. 그라 이오 스탯 소프트웨어 인터페이스 (그림 2D)의 '쿨 다운'버튼을 클릭합니다.
- 충전 절차를 통해 DNP의 저온 유지 장치에 액체 헬륨을 수집합니다. 그라 이오 스탯 소프트웨어 인터페이스 (그림 2D)의 '필링'버튼을 클릭합니다.
- DNP 편광판와 함께 제공되는 샘플 용기의 단계 1.1에서 최적화 된 편광 용액 300 μl를 놓습니다. 부드럽게 액체 질소 욕에 침지하여 내부 샘플 시료 용기를 고정.
- 액체 질소 욕조에서 샘플 용기를 추출 거꾸로 회전시킴으로써 냉동 절차 (단계 230) 후에 시료 용기에 존재할 수있는 액체 질소를 제거한다.
참고 :이 단계는 시료의 완전한 용해를 얻기 위해 매우 중요합니다 (5 단계 참조). - 저온 유지 장치에 샘플을 삽입합니다.
참고 :이 세인트EP는, 다음의 하위 단계로 구성 (즉, 이하에서 10-20 초) 융점에서 샘플을 방지하기 위해 신속하게 수행되어야한다.- 샘플 홀더에 시료 용기를 넣습니다. 주 저온 유지 장치 삽입의 샘플 홀더를 삽입합니다. 샘플 홀더에 전자 레인지 도파로를 삽입합니다.
- 1 K 냉각 절차를 시작하여 저온 유지 온도를 낮 춥니 다. 그라 이오 스탯 소프트웨어 인터페이스 (그림 2D)의 '1K 냉각'버튼을 클릭합니다.
- 에 전자 레인지를 켜고 샘플을 조사. 그라 이오 스탯 소프트웨어 인터페이스 (그림 2D)의 'MW-ON'버튼을 클릭합니다.
3. 고체 NMR 측정
- 90 ° 커넥터를 시계 반대 방향으로 회전하고 당겨 분광계 코일에서 NMR 콘솔 검출 채널의 동축 케이블을 분리합니다. 저온 유지하는 동축 커넥터 검출 채널의 동축 케이블을 연결NMR 코일. 방향 핀에 주목, 저온 유지 장치의 NMR 코일의 암형 커넥터 NMR 콘솔 케이블의 수 커넥터를 삽입; 단단히 밀어 90 ° 커넥터를 시계 방향으로 돌립니다.
- T = 5 분 간격으로 반복되는 비 - 보정 낮은 플립 각 펄스로 간단한 펄스 획득 시퀀스를 사용하여 저온 유지 사이트에서 고체 상태 NMR 열 신호를 측정한다. 측정을 설정 한 후, 소프트웨어 'ZG'의 명령 줄에 작성하고 '입력'키보드 키를 누르십시오. 분광계 운영 및 측정 설정에 대한 자세한 내용은 NMR 분광계 사용 설명서를 참조하십시오.
- DNP 강화 NMR 신호를 측정한다. 제 2 항에 기재된 DNP 프로세스를 개시하는 단계 이후에 3.2 반복 동작.
- 90 ° 커넥터를 시계 반대 방향으로 회전하고 당겨 그라 이오 스탯의 NMR 코일에서 NMR 콘솔 검출 채널 동축 케이블을 분리합니다. DETE의 동축 케이블을 연결합니다분광계 코일의 동축 커넥터 ction 채널. 방향 핀에 주목 분광계 코일의 암형 커넥터 NMR 콘솔 케이블의 수 커넥터를 삽입; 단단히 밀어 90 ° 커넥터를 시계 방향으로 돌립니다.
4. 주 자기장 ( 'Shimming')의 균질성을 최적화
- 분광계에 이전 실험 (즉, 단계 6.2 이후)에서 생산 된 혼합물의 500 μl를 포함하는 튜브를 놓습니다.
- 최대 검색 shimming 구배 코일의 전류를 변화시킴으로써 NMR 분광계 shimming 수행 중수소 신호 '잠금'. NMR 콘솔에서 해당 버튼을 누름으로써 관련 shimming 코일을 선택합니다.
- 로크 신호를 증가 회전 방향을 결정하기 위해 NMR 콘솔 노브를. 신호가 최대에 도달 할 때까지 계속 회전. 다른 shimming 코일을 선택하고 극대화 해제를 반복모든 shimming 코일에 대한 로컬 최대 때까지 발견된다. 자세한 내용은 NMR 분광계 사용 설명서를 참조하십시오. 마지막에, 로크에 사용 시료를 제거한다.
5. 해산
- 용해 삽입 보일러에서 D 2 O 5 ㎖를 삽입합니다. 가압 및 T ≈ 180-200 ° C에 도달 할 때까지 저항 와이어를 이용하여 D 2 O 가열한다. 그라 이오 스탯 소프트웨어 인터페이스 (그림 2D)의 '히터를 준비합니다'버튼을 클릭합니다.
- 샘플 편광 절차의 종료 후 (예를 들면, 3 T 후 DNP), 실내 압력 이상 약간 저온 유지 장치를 가압. 그라 이오 스탯 소프트웨어 인터페이스 (그림 2D)의 'SS 작업'버튼을 클릭합니다. 용해 삽입에서 마이크로 웨이브 가이드를 제거합니다.
- 샘플 홀더에 아래로 용해 삽입 (그림 3B)를 밀어 넣습니다 (그림 3A-C). 용해 인서트 샘플 홀더의 하단에 도달해야하고 저온 유지에 D 2 O 누출을 피하기 위해 샘플 컨테이너 밀성 연결을 단단히 가압되어야한다.
- 용출 순서 공압 밸브 조작의 소정의 타이밍 시퀀스를 시작할 하드웨어 트리거 (도 3C-H)를 누른다.
6. 사출
- 500 μL의 샘플이 포함 용해 장소 5mm의 NMR 튜브, (예를 들어, D 2 O에 대한 전
11.74 T NMR 분광계의 등각에서 9 단계의 효소 활성 측정을위한 8 단계에서 7 단계 또는 LDH 용액)에서 측정 () 4 단계를 참조하십시오. - 다만 용해 (5 단계) 후, 단계 6.1 NMR 분광계에 배치 된 샘플을 분극 용액 500 μL를 혼합한다.
- 수동 주입 : 과분극를 수집NMR 분광계 자석에 가깝게 배치 유리 비이커에 2.5 m 길이 전달 튜브의 끝에 액. 수동으로 사용자 정의 만든 모세관 시스템을 통해 NMR 샘플 튜브 과분극 용액 500 μl를 주입.
- 자동 주입 : 용해 과정 전에 전송에 사용되는 헬륨 가스의 과분극 용액을 분리 주문품 자동 주입 장치에 전달 튜브를 연결한다. 장치는 자동 샘플 튜브에 과분극 용액 500 μl를 제공한다.
7. 액상 NMR 측정
- 용해 후, 기판 (A)의 자화의 진행과 제품 (B)에 따라 1.5 초만큼 이격 된 10 °의 플립 각 펄스 획득 시퀀스 일련 분광계 샘플로부터 NMR 분극 된 신호를 측정한다. 측정을 설정 한 후, 소프트웨어 'ZG'의 명령 라인 작성 및 #을 누르39 ''키보드 키를 입력합니다. 분광계 운영 및 측정 설정에 대한 자세한 내용은 NMR 분광계 사용 설명서를 참조하십시오.
- 자화 (3) T = T 일 ≈ 3 분 간격으로 90 °의 플립 각 펄스 시퀀스를 획득하는 일련의 (T = 10 T 1, 즉 후) NMR 열 신호를 측정 완전 이완되면. 측정을 설정 한 후, 소프트웨어 'ZG'의 명령 줄에 작성하고 '입력'키보드 키를 누르십시오. 분광계 운영 및 측정 설정에 대한 자세한 내용은 NMR 분광계 사용 설명서를 참조하십시오.
(피루브산 - 투 - 락 테이트 변환에 대한 구체적인) 효소 함유 샘플 8. 준비
- 다음 레시피 반응 완충액을 제조 50 mM 중의 0.1 M 인산 완충액 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH), 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 0.1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 감소 pH는7.0.
- 토끼 근육 LDH 용액 20 μg의 / ㎖ 소 혈청 알부민, BSA와 반응 완충액에 갓 제조 한 U / ㎖를 준비한다.
- 478 ㎕의 반응 버퍼를 (8.1 단계) 혼합 20 μl를 D 2 O는 분광계 필드 안정화 ( '잠금') 2 μL의 LDH 용액 (7.2 단계)을 허용합니다.
- 5mm의 NMR 튜브에 8.3 단계에서 제조 된 500 μL 솔루션 볼륨을 놓고 500 MHz의 NMR 분광계에 튜브를 배치합니다.
9. 완료 효소 반응 속도 측정 절차
- 편광 샘플 (1 단계)를 준비하고 (2 단계) 편광.
- 분광계 (4 단계)에 shimming 수행하고 효소 샘플 (8 단계)를 준비합니다.
- 용해 (5 단계)과 주사 (6 단계)를 수행합니다.
- 1.5 초 (7 단계)로 이격 된 10 °의 플립 각 펄스 인수와 분극 샘플로부터 일련의 신호를 측정한다. 이 단계는 분극 측정 허용신호 감쇠 및 대사 물질의 신호 증강.
10. 피팅
- 단계 9.4에서 취득한 각 스펙트럼을 각각 (A) 및 제품 (B)을 기판을 통합 대응 피크를 식별 (피크 면적을 확인). 피크 적분은 (식 2 참조 M (A, B) (t)) 자화 시간 코스 신호를 제공합니다.
- 방정식의 해법을 사용하여 (2), F = (R + K의 EFF의 값을 결정 ) 단계 10.1에 내장 기판 신호의 간단한 지수 피팅에서.
- 값 F = (R의 A + K EFF의 사용 ) 단계 10.2 결정 식을 적분하여 얻어지는 함수를 곱 신호 B의 M (t)의 k 값에서 적합 EFF 및 R의 B를 결정 (2). (대표 결과 섹션을 Enzymat를 참조하십시오반응 모델링, 피팅 및 RF 보정에 대한 자세한 내용은 IC에서의 활동과 신진 대사 측정).
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Representative Results
용해 DNP를 사용하여 NMR 신호 이득
DNP 효과는 시료의 마이크로파 조사 하에서 통상적 안정한 라디칼 분자, NMR 비활성 핵에 부대 전자의 스핀 분극 높은 전송로로 구성된다. 가장 자주 사용되는 활성 산소는 TAM (OXO63) 및 TEMPOL이다. 4 편광 절차 TEMPOL를 사용하여가 '교차 편광'에 의해 최적화 될 수있다. (25)
고체 상태에서 최대 핵 편광을 얻기 위해 안정한 라디칼의 농도를 최적화하는 것은이 기술의 성공에 중요하다. TEMPOL 최적 농도는이 연구의 실험 조건에서 33 밀리미터이었다. 선택된 기질이 편광 실시간의 효소 전환을 수행하기에 충분하다.
polari의 자기장ZER 파리 데카르트 설치 B 0 T = 3.35이며,이 시스템의 구성 요소는 (도 1 - 2) 상술 하였다. 저온 유지 장치 설계는 최종 샘플 위치 자석 등각과 일치하도록 보장한다. 편광자의 자계 증가시켰다 장소에서 저온 유지 장치와 만 초전도 심 코일을 사용 shimmed. 1 × 0.5 × 0.5 cm, 물 샘플의 최종 양성자 선폭은 23 KHz에서였다. 우리는 평가 
과 
[1 (13) C] 피루브산합니다. 그렇게하기 위해서는, 13 C DNP 강화 신호를 결정하는 제 필요 용해 (도 4a) 앞에 편광판 사이트에서 고체 상태이다. 용해 후, 우리는 [1- 측정(13) C] 피루 베이트 과분극 신호 및 분광계 사이트의 붕괴. 액상 신호 NMR 분광계 샘플로서 D 2 O 500 μL를 사용하여 용출 시험에서 측정 하였다. 이것은 우리 고체 DNP 강조 (도 4b, 인셋) 액상 NMR 편광 레벨 (도 4b) 및 전송 중에 손실 편광을 결정할 수 있었다. 신호들 사이의 비는 3.3로 측정 단계와 3.2 고체 향상 정의 단계 . 단계 7.1에서 측정 된 제 1 신호 및 단계 7.2로부터의 신호 사이의 비율은 액상 분극 향상을 정의 .
3 단계의 데이터,이야도 4a 및도 4A (삽입)에 ummarized, 기술 [1- (13) C] 피루브산까지 13 C를 극화 할 수 있습니다 보여 13 C 양극화에 대응 ± 5 = 22, = 1.5 ± 0.3 %.
이 분극 레벨은 공통 MRS 조건 (예를 들어, 11.74 T 300 K)에서 1000 개 이상의 탄소 회 열 편광이다. 도 4b 및도 4b (삽입)에 정리 단계 7의 데이터는, [1- (13) C] 피루브산 액상 13 C의 과분극을 결정 허용 = 1 ± 0.2 %. 피루브산위한 고체 상태에서 얻어 향상했다더 향상된 상이한 라디칼을 사용하여 입증되었다 있지만, 실험의 목적에 충분. 5 코스 데이터는 단계 7.1에 맞게 시간을 완화 시간 상수의 측정을 제공한다. 혼합물 피루브산 세로 완화 시간을 500 μL의 DNP 향상된 용액 500 μL의 D 2 O로 구성 T 1이었다 = 75 ± 5 초 후 RF 보정 (식 (3) 참조).
효소 활성 및 대사 측정
13 C 표지 기판 (A)의 용해 DNP NMR 검출 생성물의 형성 (B)에 실시간으로 전환 효소 동력학에 따라 관찰하기 위해 사용될 수있다 :
즉시 과분극 기판 (A)의 주사 후,제품 (B)의 신호는 null입니다. 이어서, 효소 전환 (1) (B)을 생성하기 시작한다. 13 C 핵의 자화가 다른 화학적 이동 및 분자의 화학적 변화에 의해 영향을받지 않는다. 그럼에도 불구하고, 새로운 환경 곱 신호 타임 코스 질적 세 단계로 분리 될 수 B.에서 13 C에 대해 서로 다른 길이 이완 율을 초래할 수있다 : 처음에, B로는 B 신호의 증가를 생성 바뀌는 효소 전환; 일정 시간 후, 실험 조건에 의존 의한 이완 자화 손실이 증가하고 B의 신호의 균형에 도달하면 최대; 마지막으로, 더 긴 시간에, B의 신호 길이 완화에 의한 감쇠. 효소 포화 가설 변환 다시 방치하고 계정 자기 이완을 고려 효소 변환시 두 분자 종 (A 및 B)의 자화는 COU 의해 설명 될 수 있습니다PLED 미분 방정식 시스템 : 22
M (A, B) (t)은 분자 종 및 B의 자화는 여기서 각각 k 개의 EFF 신호의 효소 반응에 의해 전송 및 R의 유효 변환 속도 상수이고 (A, B)의 명백한 종 완화 속도 상수는 각각의 분자 종 및 B에서 관찰 핵 R 순수 종 자화 이완 및 RF 펄스의 효과 모두 (A, B) 계정. :
T (1), (A, B)의 세로 이완이고시간은 각각 분자 종 A와 B의 로컬 분자 환경에서 핵의 정수입니다. θ와 τ는 각각 RF 플립 각도 및 2 개의 신호 인수 사이의 지연이다.
이 연구에서, 기판 및 제품 B가 하였다 1-13 C] 프로피온산 및 [1-13 C] 락트산 각각과 목표 동위 위치에 상관 (조건 LDH에 의한 락트산 생산 [1-13 C]를 측정하지했다 비 표지) 락트산은 실험의 시작시 용액 내 존재 하였다. 측정은 T = 21 ° C에서 간단한 pulseacquire 순서로 기록 된 13 C 스펙트럼의 연속으로 구성되어 있습니다. 보정 10 °의 플립 각 펄스는 순차적 기진 (단계 9)를 사용 하였다. 두 개의 연속적인 펄스 사이의 지연은 τ = 1.5 초였다. NMR 취득 순서 과분극 오디오 솔루션 전에 수십 초 시작된이온 주입입니다. 주입 후 샘플 관 피루브산 기질 농도는 25-35 mm였다. 10 단계 10-3 U / ㎖의 농도에서 LDH 피루브산 변환 속도 락트산 측정 하였다. 젖산과 피루브산에서 기록 된 신호는 = 0.9 ± 0.1 × 10 -3 초 -1 (그림 5) 잘 (2) (그림 5의 점선) 식 모델에 맞게 및 케이 EFF를 얻을. 이 값은 비 [락] / [PYR 시각 0 초에서 (도 5, 인셋)에 의해 결정된 초기 반응 속도로 동의한다.
실험 장치 1. 회로도를 그림. 편광판 (왼쪽)에 배치 된 저온 유지 장치 (D) 내부에 마이크로파 공동 (c)로 구성 3.35 T 초전도 자석 와이드 보어. t을 둘러싼 맞춤 제작 NMR 코일의 (b)그 (a)의 반응계에서 핵 스핀 분극을 모니터링하기 위해 사용되는 샘플링. 샘플을 마이크로파 주파수 ν MW = 94 GHz에서 조사하면서 헬륨 욕 온도는 1.12 ± 0.03 K로 유지된다. NMR 측정은 편광 중 고체 샘플에 대해 수행 될 수 있도록 시스템을 허용한다. 편광 샘플 뜨거운 물에 용해 이전에 인접한 NMR 분광계 (오른쪽) 내부에 배치 샘플 튜브에 전송 라인을 통해 압축 헬륨 가스로 푸시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2의 저온 및 진공 시스템 개략도. (A) 저온 유지 절연 듀어; (B)의 외침 주 삽입 ostat; (C) 진공 시스템을 연결; (D) 2 단계 및 프로토콜 섹션의 5 단계에 설명 된 특정 작업을 수행하는 데 사용되는 버튼 관리 소프트웨어 인터페이스의 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 샘플 처리 및 용해. (A) 시료 처리 인서트; (B) 용해 삽입하는 단계; (C) 용해 삽입의 전공 연결의 세부 사항입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 고체 편광 축적 및 과분극 신호 붕괴. 해체 DNP 신호. (A) DNP 편광 중 1.12 M 나트륨 [1-13 C] 프로피온산 용액의 고체 NMR 편광 빌드 업 신호 (십자가, 지수 함수 S (t)가 장착은 / T의 X EXP (-t를 = 나) + 시정 T의 B = 270 초)과 휴식 (원, S (t)의 B는) · 특급 (T / T의 B) + B, T ss는 1 = 840 초 =; (A, 인셋) 고체 상태 DNPenhanced 열적으로 편광 된 (스케일 업 10 배)의 자화 신호 간의 비교 (ε의 SS = 고체 분극 P SS = 1.5 ± 0.3 %에 상응하는 22 ± 5); (B) 용해 및 avera 이후에 기록 된 최초의 스펙트럼의 비교열 편광 (13) C에서 얻은 검정 고시 스펙트럼 (100 배를 축소) 1,024 과도를 사용하여 실온에서 회전 (ε = 1,000 ± 200). 용해 공정은 40 %의 추정 된 신호 손실이 3.3 초 및 자동 분사 약 2 초 걸렸다. 실험 매뉴얼 주입하여 샘플을 전송 수행을 위해 의한 이상 분사 지연 추가적인 손실은 30 %로 추정되었다; (B, 삽입) LDH의 부재 (T 1 = 75 ± 5 초)에 용해 후 피루브산의 과분극 신호 감쇠. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
때문에 enzyma에 [1- (13) C] 락 테이트 신호 그림 5. LDH 활성 및 암세포의 신진 대사 결과. 빌드 업10-3 U / LDH의 농도 TIC 변환 인해 13 C 자화 세로 이완 신호 감쇠 하였다 ML. 적색 선은 이완 효소 전환 효과를 포함하는 식 (2)에서 설명한 모델과 착용감을 나타낸다. [1- (13) C] 락 테이트 및 시간 t = 0 (레드 라인)에서 반응 속도의 추정에 [1 -13 C] 피루브산 농도의 (삽입) 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
용해 DNP NMR 실험의 핵심 포인트는 실험에 필요한 최저 생성물의 농도뿐만 아니라, 수행 및 (ii) 수명 수 신호 인수의 수를 결정 (I) 기판 달성 편광 레벨 자화, 편광 검출 위치 사이의 기판의 변형 속도 전송의 지속 기간과 비교. 본원에 기재된 용출 DNP 설정의 분사 시스템은 거의 같은 3-4 초 샘플 전송을 허용한다. 전송이 S. 보웬과 C. Hilty에 의해 제안 된 방법에서와 같이 빠른 아니었지만, 피루 베이트 26 편광 손실로 인해 낮은 필드에 적당한 길이 휴식에 한정되었다. [1-13 C] 프로피온산 긴 카복실산 핵 T 1, 10-3 U / ml의 낮은 농도에서 LDH 통한 광속을 측정 할 수 있습니다.
그만큼 높은 신호 대 잡음비는 DNP가 하나 더 낮은 [1-13 C] 프로피온산의 농도 및 효소 낮은 전환율에 민감 할 수 있다는 것을 시사 용해하여 얻은. 달성 분극 레벨은 상당한 신호 - 대 - 잡음 비에 200 개 이상의 실험은 낮은 플립 각도 α = 10 °를 사용하여 액체 상태 NMR 분광기에서 취득하도록 제공한다. 이것은 최적화를위한 모두 반복 시간과 플립 각도의 측면에서 방을 떠난다. 어떤 분자가 어떤 편광 에이전트 (TEMPO, OXO63) (4) 다른 사람과 잘 편광 고체 상태의 편광의 축적 아직 완전히 이해되지 않는 이유하지 않습니다. 실험 실험은 분극 공정의 성공 여부를 결정하기위한 유일한 방법이다. 편광 레벨을 향상시키기 위해, 하나는 다른 라디칼 종 4 '교차 편파'에 의존하는 다른 기술의 애플리케이션의 사용을 탐구 할 수있다. (25)
ontent "> 라디칼 기질 농도뿐만 아니라 DNP 시료에 용매 조성물의 추가적인 최적화는 편광을 개선하려고 시도 할 수있다.이 기술은 분자에 한정되는 핵 또는 용해 될 수 후 편광을 유지할 수 핵 기 식별. 편극 어느 높은 자기장 또는 LLS의 형태는 둘 또는 그 이상의 결합 된 핵에 비편 재화 모노 핵 고유 상태 사이의 불균형으로지지 할 수있다. 첫 번째 옵션의 경우, 프로브 핵 높은 다른 핵으로부터 떨어진이어야 이러한 양성자 같은 회전 자기 비. 그러한 위치 자연스럽게 발견되지 않으면 deuterons 의해 활성 핵 부근에서 양성자 분자 또는 여분의 절연 부위에서 NMR 활성 핵의 농축은 자기 쌍극자 힘을 낮추기 위해 필요한 . LLS, 수 supp하는 최적의 방법을 발견하기 위해 아웃 27,28 행할 수 핵의 그룹 내에서의 자기 커플 링의 이론 해석을 구오트 편광. 29 아미노산 및 관심 대사 사이클에 관여하는 다른 분자에 적용 할 수있는 등의이 전략은 소분자 성공적 입증되었다. 더 실험 중에 자성을 유지하려면 LLS의 여기로 용해 DNP의 조합은 다른 효소 반응에 대한 측정 시간 간격을 연장 약속. 20여기에 설명 된 DNP-NMR 실험 암세포 피루브산 대사의 측정에 적합하다. 용출 DNP 향상 NMR에 의한 효소 활성의 실시간 측정 DNP 향상된 MRI함으로써 암 진단의 현재 노력을 도울 수 6 이미에서 사용 병원. 12 DNP 강화 NMR의 분자 특이도는 분자 표적 및 변환의 제품 구별을위한 선택의 방법합니다. 대사가 30 변환에 대한 향후 개선은 다른 분자 추적자의 평가에 초점을 맞출 것이다
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Disclosures
저자들은 금전적 이익을 경쟁하는 것을 선언하지
Acknowledgments
저자는 유용한 토론 박사 F. Kateb 박사 G. BERTHO뿐만 아니라, 장비의 선택과 어셈블리의 도움 박사 JJ 반 데르 KLINK 감사합니다. AC는 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (PPOOP2_157547을 부여)에 의해 지원되었다. 우리는 파리 소르본 시테 (NMR @ 컴, DIM 웹 로그 분석, 빌 드 파리, 파운데이션 부문 드 라 공들인 MEDICALE (FRM ING20130526708) 및 Parteneriat 휴 버트 Curien 브랑 쿠지 32662QK에서 자금 조달을 인정합니다. 우리 팀은 Equipex 프로그램 파리 - 엉 - 공명의 일부입니다 및 CACSICE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNP polarizer | Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) | /// | Cryostat and electronic equipment for sample polarization |
| Vacuum system components | Edwards vacuum (France) | Various | - turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components |
| DNP 3.35T Magnet | Bruker (France) | ||
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker (France) | ||
| Origin 8.0 | OriginLab (US) | Data analysis software | |
| Chemicals | |||
| SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C | Sigma Aldrich (France) | 490709 | |
| ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D | Sigma Aldrich (France) | 186414 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO 97% | Sigma Aldrich (France) | 176141 | |
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich (France) | 151882 | |
| reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) | Sigma Aldrich (France) | ||
| ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich (France) | ||
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich (France) | ||
| phosphate buffer, pH = 7.0 | Sigma Aldrich (France) | ||
| LDH enzyme in | Sigma Aldrich (France) | L-2500 | |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma Aldrich (France) |
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