Opløsning Dynamic Nuclear Polarisering Instrumentation for Real-time enzymatisk reaktion Rate Målinger ved NMR

Abstract

Den væsentligste begrænsning af NMR-baserede undersøgelser er lav følsomhed. Dette beder for lange erhvervelsestider, hvilket forhindrer realtid NMR målinger af metaboliske transformationer. Hyperpolarisering via opløsning DNP omgår en del af følsomheden udsteder takket være det store out-of-balance nuklear magnetisering som følge af spin polarisering overførsel elektron-til-kerne. Den høje NMR signal, der opnås, kan anvendes til at overvåge kemiske reaktioner i realtid. Ulempen af hyperpolariseret NMR bosat i den begrænsede tid vindue til rådighed for signal erhvervelse, som normalt er på rækkefølgen af den nukleare spin-langsgående relaksationstidskonstant, T _1, eller, i gunstige tilfælde, om rækkefølgen af relaksationstidskonstant forbundet med singlet-tilstand af koblede kerner, T _LLS. Cellulær optagelse af endogene molekyler og stofskifte kan give væsentlige oplysninger om tumor udvikling og lægemiddelrespons. Numerous tidligere hyperpolariserede NMR-undersøgelser har vist relevansen af pyruvat som en metabolisk substrat til overvågning enzymatisk aktivitet in vivo. Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af forsøgsopstillingen og metoder kræves for studiet af enzymatiske reaktioner, især omregningskursen pyruvat-til-laktat i tilstedeværelse af laktat dehydrogenase (LDH), ved hyperpolariseret NMR.

Introduction

Dynamisk nukleare polarisering (DNP), ^1,2 en teknik designet til at forbedre den nukleare spin-polarisering, dvs. ubalancen mellem "op" og "ned" spin-populationer (P = [N _↑ - N _↓] / [N _↑ + N _↓]), blev først indført i 1950'erne. Nuclear spins såsom ^13C kan polariseret op til P = 10 ^-1 i gunstige betingelser, typisk ved en temperatur på i størrelsesordenen 1 K og i et magnetfelt på 3,357 T. ^3,4 Et gennembrud for biologiske anvendelser kom i tidligt 2000'erne med udviklingen af opløsning DNP, der består i at opløse frosne polariserede prøver i overhedet vand samtidig bevare den høje kernepolarisation niveau opnået ved lav temperatur. ⁵ væsken-NMR-signalet forstærkes med en faktor 10 ³ -10 ⁴ sammenlignet med fællestermisk polariseret RT NMR betingelser. Opløsning DNP tilvejebringer derfor en måde til ikke-invasivt måler biokemiske reaktionshastigheder in situ i realtime, så overvågning dynamik ved NMR med en tidsmæssig opløsning på 1 sek eller mindre ^{6 -. 10} blev det også muligt at detektere analytter i meget lave koncentrationer ^11.

Blandt de ikke-invasive molekylære afbildningsmodaliteter, hyperpolariserede NMR er den eneste teknik, der giver samtidig måling af et substrat og dets metabolitter i realtid. Opløsning DNP blev modtaget med begejstring i forskellige videnskabelige områder lige fra in vitro-NMR til klinisk MRI ^{12 og} de ​​mest lovende programmer er relateret til in situ overvågning af stofskiftet. ^13,14 Den væsentligste begrænsning af opløsning DNP er, at efter en tid på størrelsesordenen fem gange den langsgående relaksationstidskonstant T _1, den forbedrede polæreization er tabt. Det er derfor nødvendigt at anvende molekyler bærer kernespin udviser forholdsvis lang T _1. For at forlænge tidsrum af polarisering ekstraudstyr, langsomt-afslappende nukleare spin-tilstande, der er kendt som langlivede tilstande (LLS), kan der anvendes ^{15 -. 17} LLS er ufølsomme over for den intra-pair dipol-dipol interaktion, så deres karakteristisk relaksationstidskonstant, T _LLS, kan være meget længere end _T1. ^{18 A} magnetisering levetid ti minutter og op til 1 time kunne derfor opnås, ^19,20 og er blevet foreslået LLS for både magnetisk resonans spektroskopi (MRS) og MR. ²¹

De vigtigste punkter, der skal være omhyggeligt optimeret til at studere enzymatiske reaktionshastigheder ved hyperpolariseret NMR er: (i) maksimere solid state polarisering og (ii) minimere polarisering tab under overførslen af ​​den hyperpolariserede opløsningen frapolarisator til NMR spektrometer. Denne artikel beskriver en tilpasning af et skræddersyet opløsning DNP apparater og indsprøjtningssystem til at studere enzymatiske reaktioner. De karakteristika og ydeevne opsætningen vil blive demonstreret med den velkendte og udbredte hyperpolariseret substrat [1- ¹³ C] pyruvat. De vigtigste årsager til dette valg er, første, dens naturligt lange ^13C langsgående afslapning tid (T _1> 50 sek ved høje magnetfelter og temperaturer over 293 K), der tillader overvågning reaktioner under flere minutter, og for det andet, sin centrale rolle i cancer metabolisme. ^13,14 Anvendelse opløsning DNP NMR og en brugerdefineret udviklede indsprøjtningssystem, oxidationen af pyruvat katalyseret af lactatdehydrogenase (LDH) kan overvåges i nærvær af en første pool af umærket lactat ^9,22 eller uden umærket lactat tilsat som vist her. Det har vist sig, at [1- ¹³ C] laktat signal målt i vivo (herunder celler) efter injektion af hyperpolariseret [1- ^13C] pyruvat skyldes hovedsagelig en hurtig etiket udveksling mellem pyruvat og lactat frem til lactat produktion. ⁶

Heri præsentere realtid produktion af [1- ^13C] lactat fra hyperpolariseret [1- ^13C] pyruvat indsprøjtes i en NMR-rør indeholdende LDH men oprindeligt ingen lactat.

Systembeskrivelse
Der er to primære dele i en opløsning DNP setup (figur 1): DNP polarisator og NMR spektrometer. Det vigtigste element i DNP polarisator er en kryostat til afkøling af prøven til omkring 1 K i en pumpet helium bad. Kryostaten er indsat i et 3,35 T superledende magnet og har en geometri, der garanterer at have den polariserende prøve ved isocentret af magneten (figur 1). Inde i kryostat, prøven (a) er omgivet af en NMR-spole (b), for at måle polarisationen Buildup, indeholdt i en oversvingningstilstande mikrobølgehulrum (c). Hele prøven holdes ved lav temperatur i et pumpet helium bad (d) og bestrålet med mikrobølger gennem bølgelederen. Hele systemet styres af skræddersyet software (figur 2D).

Hardwaren og kuldeudstyr nødvendig for at udføre DNP og den efterfølgende opløsning er stadig en teknologisk udfordring. En ny DNP kryostaten ^23,24 blev udviklet og testet for at bestemme dens kryogene forestillinger og derefter optimeret til hurtig nedkøling, helium hold-tid og den samlede minimale helium forbrug under drift.

Kryostaten består af to dele. Den første del af kryostaten er isoleringen dewar (figur 2A), som groft kan adskilles i øverste del (a) halen, eller prøve rum (b), og den ydre vakuumkammer (OVC) holdt under højvakuum og huser stråling skærme (c). Den anden del af kryostaten er det vigtigste isert (figur 2B), placeres i isoleringen dewar, hvor alle flow regler administreres. Den flydende helium kommer fra eksternt dewar-karret gennem overførsel linje (a), er i det første trin kondenseres i separatoren (b), et mellemliggende kammer bruges både til at holde den øverste del af kryostaten kolde og fjerne helium inddampet under overførslen. Separatoren tryk sænkes ved at pumpe gennem et kapillarrør (c) viklet rundt om øverste del af kryostaten; strømmen af ​​kold helium i denne kapillær anvendes til at køle ned baflerne (d) og strålingen skærme i isoleringen dewar (OVC). Prøven anbringes og polariseret i udfaldsrummet. Prøven rum er forbundet til separatoren gennem en anden kapillær (e), viklet omkring halen af ​​den primære kryostat insert. Denne kapillær kan åbnes eller lukkes via en nåleventil manuelt betjent udefra.

For at opnå den lave temperatur, der anvendes under DNP process, behov flydende helium, der skal indsamles i kryostat udfaldsrummet og dens tryk sænkes til den mbar rækkevidde. Operationerne er nødvendige for kryostat operation udføres gennem en temmelig kompleks pumpesystem med tre sæt pumper, overvåges og drives i forskellige punkter med elektroniske og elektro-mekaniker instrumenter (Figur 2C). Kryostaten OVC skal pumpes til højvakuum ved den første pumpesystemet. Dette system er sammensat af en turbo-molekylær pumpe bakkes op af en roterende pumpe (a). Den flydende helium overføres fra lageret dewar (b) gennem kryostaten overføringsledning indløb til kryostat separator. Separatoren har et udløb forbundet med den anden pumpe sæt. Dette sæt består af en 35 m ³ / time membranpumpe (c). Denne linje giver fjerne helium gas kogt under overførslen fra Dewar og under separator køling. Den flydende helium opsamlet i separatoren kan derefter overføres til prøven rum gennem hættenIllary rør beskrevet ovenfor. For at overføre flydende helium fra separatoren til prøven plads og efterfølgende lavere udfaldsrum pres for at mbar rækkevidde, en tredje pumpesystem, der består af en 250 m ³ / t Roots pumpe bakkes op af en 65 m ³ / t roterende pumpe (d) er forbundet til kryostaten gennem en manuel butterflyventil (e).

Alle vakuum system operationer styres og reguleres af en elektropneumatisk skræddersyet enhed (f). Denne enhed styrer vakuum ledningsforbindelser mellem kryostaten separator (g) og prøve rum (h) forretninger, de anden / tredje pumpesystemer (c, d), en komprimeret helium flaske (i) og ydersiden. Kommunikation mellem (f) og ydersiden passerer gennem en envejsventil (j). Den elektro-pneumatiske enhed (f), samt alle systemparametre og opløsningen hardware styres og drives af en skræddersyet elektronisk enhed interface USB med en fælles pc. Endelig hele systemet, via den elektroniskeenhed, administreres af skræddersyet standalone software (figur 2D), hvor relevante operationer lanceres via en grænseflade ved hjælp af software-knapper.

For at styre prøven og måle NMR signal ophobning i fast tilstand anvendes en række indsatser (figur 3A). For at forberede kryostaten for polarisering, placere hovedstikprøven indsatsen (a), i kryostaten. Hovedstikprøven indsatsen er forsynet med en NMR-spole (b) anbragt inde i en oversvingningstilstande guldbelagt mikrobølgehulrum. Pre-freeze underlaget opløsning skal polariseret (polariserende opløsning) ved flydende nitrogen temperatur i et passende udvalg beholder og placere den i slutningen bunden af ​​holderen glasfiber prøve (c). Skub holderen prøven i den vigtigste prøve indsatsen for at nå magneten isocentret. Sæt guldbelagte bølgeleder (d) i prøveholderen. Den bølgeleder giver mikrobølgeovnen genereret fra en ekstern mikrobølge kilde til at rejse med minimal tab to prøven.

Den skræddersyede software til kryostat styring håndterer automatisk ved klikke på den tilsvarende grænseflade knappen, forskellige operationer som nedkøling (kryostaten temperaturen sænkes tæt på flydende helium temperatur), udfyldning (kryostaten er fyldt med flydende helium til en forudbestemt niveau ), et yderligere trin med afkøling til T ≈ 1 K (den flydende helium bad pumpes for at opnå den lavest mulige temperatur), tryksætning (kryostaten sættes under tryk lidt over atmosfæretryk ved P = 10-30 mbar for at tillade kryostat åbning uden risici for kontaminering af kryostaten med fly) og opløsning (automatisk procedure til opløsning af DNP prøven og overføre den resulterende hyperpolariserede løsning på målestedet, dvs. NMR spektrometer).

Polariseringen udføres bestråling af prøven med mikrobølger ved 94 GHz (i en polariserende felt B ₀ T _DNP, hvor T _DNP er polariseringen oprustning tid. T _DNP er af samme størrelsesorden som den langsgående relaksationstid af målet kerner i fast tilstand på det givne felt og temperatur. I alle vores eksperimenter blev prøven polariseret mere end 5 T _DNP.

Ved afslutningen af ​​polarisationen tid, prøven skal opløses i en RT opløsning for at blive anvendt til måling af enzymatisk aktivitet. Under opløsningsprocessen, er 5 ml overhedet _D2O fra kedlen for opløsningen insertet (figur 3B) skubbet af komprimeret heliumgas (P = 6-8 bar) for at nå den DNP-forstærket prøve og opløse den. Den resulterende hyperpolariserede opløsning skubbes ud opløsningen indsatsen ved den komprimerede heliumgas, gennem opløsning insert udløb den (figur 3C-b 23 nødvendige tid til prøven overførsel fra DNP polarisator til NMR spektrometer site handler om 3 sek.

Opløsningsprocessen udføres under anvendelse af en opløsning insert (figur 3B). Opløsningen indsatsen er sammensat af et elektronisk-pneumatisk konstruktion (a), en kulfiber stick (b) indeholder forbindelsesrør mellem kedlen i den pneumatiske montage og prøvebeholderen locker (c), som tillader læk-tæt kobling med prøven beholder, og tilbage ud til udløbet. Den elektro-pneumatisk montage (figur 3C) anvendes til at fremstille og drive overhedet _D2O gennem kulfiber stick til prøvebeholderen og derefter at ekstrahere den hyperpolariserede løsning fra kryostaten. Den elektro-pneumatisk montage er sammensat af pneumatiske ventiler (a), der kontrollerer forbindelserne mellem compressed helium (P = 6-8 bar) linje (b), kedlen (c) når _D2O indsprøjtes gennem ventilen (d), og udløbet (e) gennem kulfiber stick (f). Systemet fuldendes af et tryk G, et termometer og en opvarmning resistiv wire i kedlen (c), en udløser (h) og en tilslutningsboks (i) anvendes til at interface systemet med den elektroniske styring enheden.

DNP kryostaten og NMR-spektrometer er forbundet med en overføringsledning, dvs en PTFE-røret på 2 mm indre diameter, inden i hvilket den hyperpolariserede opløsning skubbes af tryksat helium (P = 6-8 bar), når opløsningen er udløst.

Opløsningen sekvens består af følgende operationer: i de første 300 msek, overhedet _D2O skubbes til prøven beholder for at smelte og opløse den hyperpolariserede frosne opløsning. Bagefter hyperpolariserede opløsning ekstraheret fra kryostaten ved gennemsnit af pressurized (P = 6-8 bar) helium gas og skubbet gennem 2 mm indvendig diameter PTFE rør (figur 3C-e) til målestedet, hvor injektionen udføres med en af de procedurer, der er beskrevet i trin 6.2.1 eller Trin 6.2 0,2.

Den anden komponent i opløsningen DNP NMR opsætning er NMR-spektrometer. I opsætningen heri beskrevne NMR-spektrometer arbejder ved et felt B ₀ = 11,7 Tesla. En 5 mm NMR probe anvendes til at måle den hyperpolariserede signal efter opløsningen. NMR-spektrometer betjenes via NMR-konsollen, der anvendes til både solid-state og væske-state NMR-målinger, og firmaet-medfølgende software XWinNMR. En typisk måling består af en lav flipvinkel hårdt puls (enten kalibreret, for liquidstate eller un-kalibreret, for solid-state målinger) efterfulgt af opkøb signal.

Målinger af den faste tilstand termiske polarisationssignal og DNP-afledt signal opbygning udføres ved hjælp af skræddersyet ^13C spole på stedet af DNP polarisator (figur 3AB) koblet til NMR spektrometer. I denne særlige situation er NMR-spektrometer ikke udføre signal låsning. Når solid-state målinger foretages, for at undgå væsentlige forstyrrelser til polarisering, bør tidsforsinkelsen mellem anskaffelser være lang nok, groft længere end 0,5 T _DNP.

Den solid state ekstraudstyr er defineret som hvor er den hyperpolariserede signal (opnået i trin 3.3) og er fast tilstand signal (opnået ved termisk ligevægt ved pumpet flydende helium temperatur i trin 3.2) (figur 4A). Denne parameter defines den maksimale polarisation rådighed for NMR eksperimenter, før uundgåelige tab i overførslen af ​​den hyperpolariserede opløsning. Målingen udføres med en simpel puls-erhverve sekvens under anvendelse af et ikke-kalibreret lav flipvinkel puls. Pulse kalibrering er almindeligt springes til solidstate målinger.

En analog fremgangsmåde kan anvendes til at bestemme den hyperpolariserede forstærkning af signalet væske-tilstand. I dette tilfælde placeres prøven i spektrometret røret før injektionen (trin 6.2) bestående af 500 pi D _{2 O.} Efter opløsning og injektion, er der to vigtige parametre til at overvåge. Den første er den hyperpolariseret forbedring på NMR-spektrometer site, (Figur 4B), hvor er det signal lige efter injektionen af ​​hyper polariseret opløsning (opnået i trin 7.1) og er den termiske polarisationssignal (opnået i trin 7.2). Den anden er den langsgående relaksationstid, T _{1 (figur} 4B, indsat), der er forbundet med substratet, og hver metabolisk produkt (opnået ved eksponentiel montering signaler opnået i trin 7.1). Disse to parametre definerer den minimale substratkoncentration nødvendig for at opnå en tilstrækkelig signal-til-støj-forhold (SNR) og den tilgængelige tidsvindue til måling af de metaboliske transformationer. Forholdet mellem solid state polarisering og liquidstate polarisering giver et skøn over de tab polarisering skyldes afslapning under den hyperpolariserede løsning overførsel. En værdiation12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "skal overholdes /> i fravær af tab afslapning.

Protocol

BEMÆRK: Alle data analyse blev udført ved hjælp af kommerciel software.

1. Forbered den polariserende Solution

1. Forbered 2 ml af en 1,12 M ¹³ C-mærket natriumpyruvat (Na ⁺ _[CH3-CO- ¹³ COO] ^-, substrat) opløsning doteret med 33 mM TEMPOL radikal (4-hydroxy-2,2,6,6- tetramethylpiperidin-1-oxyl, polariserende middel) ⁴ i 2: 1 d ₂ O / d ₆ ethanol ⁱ 13 C observationer. ADVARSEL: Håndtering forholdsregler skal træffes på grund af den brændbare natur d ₆ ethanol.
2. Kontroller, at den radikale koncentration er optimal i forhold til opnået polarisering.
   1. Ændre sig lidt den radikale koncentration af opløsningen ved punkt 1.1 (fx til 30 mM eller 35 mM).
   2. Bestem iterativt solid state enhancement (se trin 3) og finde den radikale koncentration, der fører til den maksimale forhøjelse.

2. Polarization

1. Sænk DNP kryostat temperatur gennem cooldown procedure. Klik på "Cooldown" knappen på kryostat software interface (figur 2D).
2. Saml flydende helium i DNP kryostaten gennem proceduren påfyldning. Klik på knappen "Fyld" på kryostat software interface (figur 2D).
3. Placer 300 pi den optimerede polariserende opløsning fra trin 1.1 i stikprøven beholder forsynet med DNP polarisator. Frys prøvebeholderen med prøven inde ved forsigtigt at nedsænke det i et flydende nitrogen-bad.
4. Fjerne det flydende nitrogen, der kan være til stede i prøvebeholderen efter indgrebet frysning (trin 2.3) ved at ekstrahere prøvebeholderen fra den flydende nitrogen-bad og dreje det på hovedet.
   BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at opnå en grundig opløsning af prøven (se trin 5).
5. Sæt prøven i kryostaten.
   BEMÆRK: Denne Step, sammensat af følgende undertrin, skal udføres hurtigt (dvs. på mindre end 10-20 sek) for at forhindre prøven i at smelte.
   1. Sæt prøvebeholderen i prøveholderen. Sæt holderen prøven i de vigtigste kryostat indsatsen. Indsæt mikrobølger waveguide i prøveholderen.
6. Sænk kryostat temperatur ved at starte 1 K køling procedure. Klik på knappen "1K Køling 'på kryostat software interface (figur 2D).
7. Drej mikrobølgekilden på og bestråle prøven. Klik på knappen 'MW-ON' på kryostat software interface (figur 2D).

3. Solid-state NMR Målinger

1. Tag koaksialkabel af NMR-konsol afsløring kanal fra spektrometer spole ved at dreje stikket mod uret med 90 ° og trække det. Sæt koaksialkabel af påvisning kanal til den koaksiale stik kryostatenNMR-spole. Sæt hanstik af NMR-konsol kabel i hunstik af kryostat NMR-spolen, at være opmærksom på orientering pin; skubbe fast og drej stikket med uret 90 °.
2. Mål NMR termisk signal i fast tilstand ved kryostat websted med en simpel puls-erhverve sekvens med un-kalibreret lave flip-angle pulser gentages med et interval på T = 5 min. Efter opsætning af målingen, skrive i kommandolinjen af ​​softwaren "zg« og tryk på 'Enter' tastatur nøgle. Se NMR-spektrometer betjeningsvejledning for yderligere oplysninger om spektrometer betjening og opsætning måling.
3. Mål DNP-forstærket NMR signal. Gentag operationer af trin 3.2 efter initiering af DNP processen som beskrevet i afsnit 2.
4. Afbryd NMR konsol afsløring kanal koaksialkabel fra kryostat NMR-spolen ved at dreje stikket mod uret med 90 ° og trække det. Sæt koaksialkabel af DETEIndsatsen kanal til den koaksiale stik på spektrometer spole. Sæt hanstik af NMR-konsol kabel i hunstik af spektrometer spole, at være opmærksom på orientering pin; skubbe fast og drej stikket med uret 90 °.

4. Optimer Homogenitet af Main Magnet Field (afstandsplader ')

1. Placer i spektrometeret et rør indeholdende 500 pi blanding fremstillet i tidligere forsøg (dvs. efter trin 6.2).
2. Udfør NMR-spektrometer afstandsstykker ved at variere strømmen i afstandsstykker gradientspoler der søger efter det maksimale "låse" -signalet deuterium. Vælg den relevante afstandsstykker spole ved at trykke på den tilsvarende knap på NMR-konsollen.
   1. Drej knappen på NMR-konsollen til at bestemme rotationsretningen der øger låsesignalet. Fortsæt med at rotere, indtil signalet når et maksimum. Vælg et andet afstandsstykker spole og gentag maksimering uninto et lokalt maksimum for alle lagdannelse spoler er fundet. Se NMR-spektrometer betjeningsvejledning for yderligere oplysninger. I slutningen, fjerne prøven bruges til låsning.

5. Opløsning

1. Sæt 5 ml _D2O i opløsningen insert kedlen. Presse og opvarme _D2O ved hjælp af den resistive wiren, indtil T ≈ 180-200 ° C er nået. Klik på "Forbered Heater" knappen på kryostat software interface (figur 2D).
2. Efter afslutning af prøven polarisering procedure (f.eks efter 3 T _DNP), tryk kryostaten lidt over atmosfæretryk. Klik på knappen "SS Operations på kryostat software interface (figur 2D). Fjern mikrobølge guide efter opløsningen indsatsen.
3. Skub opløsning indsatsen (figur 3B) ned i prøveholderen (Figur 3A-c). Opløsningen Indsatsen har at nå bunden af holderen prøven og skal skubbes fast for at sikre en lækagetæt forbindelse med prøvebeholderen for at undgå _D2O lækker i kryostaten.
4. Tryk på hardware aftrækkeren (figur 3C-h) for at begynde opløsningen sekvens, en forudbestemt timet sekvens af pneumatiske ventiler operationer.

6. Injektion

1. Før opløsning sted en 5 mm NMR rør, som indeholder 500 pi prøve (fx _D2O for måling i trin 7 eller LDH opløsning fra trin 8 for enzymatisk aktivitet målinger i trin 9), i isocentret af 11,74 T NMR-spektrometer (se trin 4).
2. Lige efter opløsningen (trin 5), blandes 500 pi hyperpolariseret opløsning med prøven anbringes i NMR-spektrometer i trin 6.1.
   1. Manuel Injektion: indsamle hyperpolariseretopløsning ved slutningen af ​​en 2,5 m lang overførsel røret i et glasbæger placeret tæt ved NMR spektrometer magnet. Manuelt injicere 500 pi hyperpolariseret opløsning i NMR prøveglas gennem et skræddersyet kapillarsystem.
   2. Automatisk injektion: før opløsningsprocessen, tilslutte overføringsrøret til en automatiseret skræddersyet injektionsanordning, der adskiller den hyperpolariserede opløsningen fra helium gas, der anvendes til overførsel. Afgiver enheden automatisk 500 pi hyperpolariseret opløsning ind i prøverøret.

7. Væske-state NMR Måling

1. Efter opløsning, måle NMR hyperpolariserede signal fra prøven i spektrometer ved en serie på 10 ° flipvinkel puls-erhverve sekvenser fordelt med 1,5 sek til at følge progressionen af ​​magnetisering af substratet (A), og produktet (B). Efter opsætning af målingen, skrive i kommandolinjen af ​​softwaren "zg« og tryk på & #39; Enter 'tastatur nøgle. Se NMR-spektrometer betjeningsvejledning for yderligere oplysninger om spektrometer betjening og opsætning måling.
2. Når magnetiseringen er fuldt afslappet (dvs. efter T = 10 T _1), måle NMR termisk signal ved en serie af 90 ° flipvinkel puls-erhverve sekvenser adskilt med T = 3 T ₁ ≈ 3 min. Efter opsætning af målingen, skrive i kommandolinjen af ​​softwaren "zg« og tryk på 'Enter' tastatur nøgle. Se NMR-spektrometer betjeningsvejledning for yderligere oplysninger om spektrometer betjening og opsætning måling.

8. Fremstilling af enzymholdige prøver (Specifik for Pyruvat-til-lactat Transformation)

1. Forbered reaktionsblandingen buffer med følgende opskrift: 50 mM reduceret nikotinamidadenindinucleotid (NADH), 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,1 mM dithiothreitol (DTT) i 0,1 M phosphatbuffer, pH =7.0.
2. Der fremstilles en kanin muskel LDH opløsning 1 U / ml fremstillet frisk i reaktionsbuffer med 20 ug / ml bovint serumalbumin, BSA.
3. Bland 478 pi reaktionsbuffer (trin 8.1), at 20 pi _D2O muliggøre stabilisering spektrometer felt ( 'låsning') og 2 pi LDH opløsning (trin 7.2).
4. Placer 500 pi opløsning volumen fremstillet i trin 8.3 i en 5 mm NMR-rør og placere røret i 500 MHz NMR spektrometer.

9. Komplet Enzymatisk reaktionshastighed Measurement Procedure

1. Forbered polariserende prøve (trin 1) og polarisere det (trin 2).
2. Udfør lagdannelse på spektrometer (trin 4) og forberede den enzymatiske prøve (trin 8).
3. Udfør opløsningen (trin 5) og injektion (Trin 6).
4. Måle en række signaler fra den hyperpolariserede prøve med 10 ° flip erhvervelser vinkel impulser adskilt med 1,5 sek (trin 7). Dette trin tillader måling af hyperpolariseredesignal henfald og signalet opbygning af metabolitter.

10. Montering

1. For hvert spektrum opnået i trin 9.4, identificere toppene til substrat (A) og produkt (B) henholdsvis og integrere dem (hvilket område af toppene). Toppene integraler giver magnetiseringen tidsforløbet signaler (M _{(A, B)} (t), se ligning 2).
2. Med løsningen af ligning (2), bestemmer værdien af F = _(RA + k _eff ) Fra en simpel eksponentiel tilpasning af substratet signal integreret i trin 10.1.
3. Brug af værdien F = _(RA + k _eff ) Bestemt i trin 10.2, bestemme k _{eff og} RB fra et anfald af produktet signal M _B (t) med funktionen opnås ved at integrere ligning (2). Se repræsentant sektion resultater (Enzymatic aktivitet og metaboliske målinger) for detaljer om reaktionen modellering, montering og rf korrektion.

Representative Results

NMR-signal gevinster ved hjælp af opløsning DNP
DNP virkning består i overførsel af den høje polarisering af uparrede elektron spin, typisk fra stabile radikaler molekyler, til NMR-aktive kerner, under mikrobølgebestråling af prøven. De oftest anvendte frie radikaler er TAM (OXO63) og TEMPOL. ⁴ procedurer polarisering hjælp TEMPOL kan optimeres ved 'cross-polarisering «. ²⁵

Optimering af koncentrationen af ​​den stabile radikal for at opnå den maksimale kernepolarisation i fast form er afgørende for succes af teknikken. Den optimale TEMPOL koncentrationen blev fundet at være 33 mM i de eksperimentelle betingelser af denne undersøgelse. Denne polarisering af det valgte substrat er tilstrækkelig til at følge dens enzymatiske omdannelse i realtid.

Magnetfeltet af Polarizer installeret i Paris Descartes er B ₀ = 3,35 T og komponenterne i dette system blev ovenfor beskrevet (figur 1 - 3). Den kryostat design garanterer, at den endelige prøve position falder sammen med magneten isocentret. Magnetfeltet af polarisatoren var ramped og shimmed hjælp af superledende mellemlægsplader spoler kun, med kryostaten på plads. Den sidste proton line-bredden af ​​en vandprøve 1 x 0,5 x 0,5 cm var 23 KHz. Vi vurderede og for [1 ^13C] pyruvat. For at gøre dette, er det nødvendigt først at bestemme ^13C DNP-forstærket signal i fast tilstand ved polarisator websted, før opløsningen (figur 4A). Efter opløsning målte vi [1-13C] pyruvat hyperpolariseret signal og dets henfald på spektrometer site. Flydende tilstand signal blev målt på en test opløsning anvendelse af 500 pi _D2O som prøve i NMR-spektrometer. Dette tillod os at bestemme solid state DNP enhancement (figur 4B, indsat), væske-NMR polarisering niveau (figur 4B) og tabene polarisering under overførslen. Forholdet mellem signaler målt i trin 3.3 og Trin 3.2 definerer solid-state ekstraudstyr, . Forholdet mellem det første signal målt i trin 7.1 og signalet fra trin 7.2 definerer væske-state hyperpolariserede ekstraudstyr, .

Data fra trin 3, summarized i figur 4A og figur 4A (indsat), viser, at teknikken muliggør at polarisere ^13C i [1- ^13C] pyruvat op til = 22 ± 5, hvilket svarer til ^en 13 C polarisering = 1,5 ± 0,3%.

Denne polarisering niveau er mere end tusind gange carbon termiske polarisering i offentlige MRS forhold (f.eks, 11,74 T og 300 K). Data fra trin 7, som er opsummeret i figur 4B og figur 4B (indsat), muliggør bestemmelse af væske-state ^13C hyperpolarisering af [1- ^13C] pyruvat, = 1 ± 0,2%. Opnået i fast tilstand for pyruvat enhancement vartilstrækkelig til formålet med forsøget, selvom højere forbedringer er blevet påvist ved hjælp af forskellige grupper. ⁵ Tidsforløbet data passer fra trin 7.1 giver et mål for den relaksationstidskonstant. Pyruvat langsgående relaksationstid i blanding sammensat af 500 pi DNP forbedret opløsning og 500 pi _D2O, var T ₁ = 75 ± 5 sek efter rf korrektion (se ligning (3)).

Enzymatisk aktivitet og metaboliske målinger
Opløsning DNP NMR påvisning af ^13C-mærket substrat (A) kan anvendes til at følge i realtid enzymatisk omdannelse dynamik og observere dannelsen af produkt (B):

Umiddelbart efter injektionen af ​​hyperpolariseret substrat (A),signalet produkt (B) er nul. Derefter den enzymatiske omdannelse (1) begynder at producere (B). Magnetiseringen ^af de 13 C-kerner er ikke påvirket af de forskellige kemiske skift og kemisk ændring af molekylerne. Alligevel kan det nye miljø føre til forskellige langsgående relaksationstider for ^13C i B. Produktet signal tidsforløb kan kvalitativt adskilt i tre trin: i begyndelsen, den enzymatiske omdannelse omdanne A til B frembringer en stigning i B signal; efter en vis tid, afhængig af de eksperimentelle betingelser, magnetiseringen tab på grund af afslapning, afbalancere denne stigning og signalet over B når en maksimal; Endelig ved længere tider, signalet over B henfalder skyldes langsgående afslapning. I hypotesen enzym mætning, forsømme tilbage omdannelse og under hensyntagen til magnetisk afslapning, kan magnetiseringen af ​​de to molekylære species (A og B) under den enzymatiske omdannelse beskrives ved en couPLED differentialligning systemet: ²²

hvor M _{(A, B)} (t) er magnetizations af molekylspecies A og B henholdsvis k _eff er den effektive omdannelse hastighedskonstanten for signaloverførsel ved den enzymatiske reaktion og R _{(A, B) er de} tilsyneladende langsgående afslapning hastighedskonstanterne af observerede kerner i den molekylære arter A og B henholdsvis R _{(A, B)} udgør både det rene longitudinale magnetisering afslapning og effekten af rf pulsering.:

hvor T _{1, (A, B) er den} langsgående afslapningtidskonstant af kernen i det lokale molekylære miljø af molekylære arter A og B, hhv. θ og τ er rf-flip vinkel og forsinkelsen mellem to signal erhvervelser, henholdsvis.

I denne undersøgelse substrat A og produkt B blev [1- ^13C] pyruvat og [1- ^13C] lactat, henholdsvis, og målet var at måle [1- ^13C] lactat produktion af LDH under betingelser, hvor ingen (isotopisk umærket) lactat var til stede i opløsningen ved begyndelsen af ​​eksperimentet. Målingen består i en serie af ^13C-spektre optaget med en simpel pulseacquire sekvens ved T = 21 ° C. En kalibreret 10 ° flipvinkel puls blev anvendt til de sekventielle excitationer (trin 9). Forsinkelsen mellem to på hinanden pulser var τ = 1,5 sek. NMR erhvervelse sekvens blev startet et par snese sekunder før hyperpolariseret solution injektion. Koncentrationen af ​​pyruvat substrat i prøverøret efter injektionen var 25-35 mM. I trin 10 lactatet til pyruvat konvertering hastighed ved en LDH koncentration på 10 ^-3 U / ml blev målt. Det optagede signal fra lactat og pyruvat passer godt modellen i ligning (2) (stiplet linje i figur 5) og gav k _eff = 0,9 ± 0,1 x 10 ^{-3 sek-1} (figur 5). Denne værdi er enig i den indledende reaktionshastighed bestemmes af forholdet [Lac] / [Pyr] til tid 0 sek (figur 5, indsat).

Figur 1. Skematisk af eksperimentelle enheder. Polarisatoren (venstre) består af en mikrobølgeovn hulrum (c) placeret inde i en kryostat (d) anbringes i en stor indvendig diameter 3,35 T superledende magnet. En specialfremstillet NMR spole (b) der omgiver than prøve (a) anvendes til overvågning af kernespin polarisering in situ. Helium badtemperatur holdes på 1,12 ± 0,03 K medens prøven bestråles ved mikrobølgefrekvens ν _mw = 94 GHz. Systemet tillader NMR måling foretages på solid state-prøven under polarisering. Den polariserede prøve opløses i overhedet vand og skubbede med komprimeret helium gas gennem overførsel linje ind i prøverøret tidligere placeret inde i en tilstødende NMR-spektrometer (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Kryostat og vakuumsystem skemaer. (A) kryostat isolering dewar; (B) cry ÖSTAT vigtigste indsats; (C) vakuum tilslutninger; (D) skærmbillede af management software-interface med knapper, der bruges til at udføre specifikke operationer, der er beskrevet i trin 2 og trin 5 i protokollen sektionen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Eksempel på håndtering og opløsning. (A) prøvehåndtering skær; (B) opløsning indsats; (C) detalje af elektro-pneumatiske tilslutninger af opløsning insert. Klik her for at se en større version af dette tal.

">
Figur 4. Solid-state polarisering oprustning og hyperpolariseret signal forfald. Opløsning DNP signaler. (A) faststof NMR polarisering opbygning signal af en 1,12 M natrium [1- ^13C] pyruvat opløsning under en DNP polarisation (kors, forsynet med en eksponentiel funktion S (t) = A x exp (-t / T _b) + b af tidskonstant T _{b =} 270 sek) og afslapning (cirkler, S (t) = A · exp (t / T _b) + b, T ^ss ₁ = 840 sek); (A, indsat) sammenligning mellem DNPenhanced og termisk polariseret (skaleret op 10 gange) magnetiseringsmålinger signaler i den faste tilstand (ε _ss = 22 ± 5, hvilket svarer til en solid-state polarisering P _SS = 1,5 ± 0,3%); (B) sammenligning mellem den første spektrum registreres efter opløsning og AveraGED spektrum (opskaleret 100 gange) opnået fra det termisk polariseret ^13C spinder ved stuetemperatur under anvendelse af 1.024 transienter (ε = 1,000 ± 200). Opløsningen processen tog 3,3 sek og den automatiske injektion omkring 2 sek med en anslået tab på 40% signal. Til eksperimenterne udført overførsel af prøven ved manuel injektion blev yderligere tab som følge af længere injektion forsinkelse estimeret til 30%; (B, indsat) hyperpolariseret signal henfald af pyruvat efter opløsning i fravær af LDH (T ₁ = 75 ± 5 sek). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. LDH-aktivitet og kræft cellemetabolisme resultater. Opbygning af [1- ^13C] lactat signal på grund af enzymatic omdannelse ved en LDH koncentration på 10 ^-3 U / ml efterfulgt af signal henfald grund langsgående relaksation af ^13C magnetisering. Den røde linje viser den passer med den beskrevet i ligning (2) model omfatter virkningerne af afslapning og enzymatiske omdannelse. (Indsat) forholdet mellem [1- ¹³ C] laktat og [1 ^-13 C] pyruvat koncentration med en ekstrapolering af reaktionen hastighed til tiden t = 0 (rød linje). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De kritiske punkter i opløsningen DNP NMR eksperiment er: (i) størrelsen af ​​polarisation opnået for substratet, der bestemmer den laveste produktkoncentration nødvendig for eksperimenter samt antallet af signalpunkter erhvervelser, der kan udføres, og (ii) levetider af magnetisering, sammenlignet med varigheden af ​​overførslen mellem polarisering og afsløring steder og til hastigheden af ​​substrat transformation. Indsprøjtningssystemet af opløsningen DNP opsætning beskrevet heri muliggør prøve overførsel i så lidt som 3-4 sek. Selvom overdragelsen ikke var så hurtig som i den af S. Bowen og C. Hilty metode blev ²⁶ tab polarisering til pyruvat begrænset på grund af den moderate langsgående afslapning i den lave område. [1- ^13C] pyruvat, med sin lange carboxylsyre nuklear T _1, tillader måling af fluxen gennem LDH ved koncentrationer så lave som 10 ^-3 U / ml.

Det høj signal-til-støj-forhold opnås ved anvendelse af opløsning DNP tyder på, at man kunne være følsomme over for endnu lavere [1- ¹³ C] pyruvat koncentrationer, og lavere enzymatiske omregningskurser. Den opnåede polarisering niveau giver mere end 200 eksperimenter med et signifikant signal-til-støj-forhold, der skal erhverves i væske-NMR spektrometer med en lav flip vinkel a = 10 °. Dette giver plads til optimering både i form af gentagelse tider og flip vinkler. For opbygning af polarisering i solid-state nogle molekyler polarisere godt med nogle polariserende midler (TEMPO, ^OXO63) 4 og andre gør ikke, af grunde, der endnu ikke er fuldt forstået. Eksperimentelle forsøg er den eneste måde at afgøre, om polarisering trin er vellykket. For at forbedre polarisering niveau, kan man udforske brugen af forskellige radikale arter ⁴ og anvendelse af forskellige teknikker afhængige af 'cross-polarisering «. ²⁵

Indholdsproduktion "> Yderligere optimering af radikale og substratkoncentrationer såvel som opløsningsmidlet sammensætning i DNP prøven kan forsøgt at forbedre polarisering. Teknikken er begrænset til molekyler, hvori en kerne eller en gruppe af kerner stand til at opretholde polarisering efter opløsning kan være identificeret. Polarisering kan fastholdes enten som en ubalance mellem mono-nukleare egentilstande i høje magnetfelter eller i form af LLS delokaliseret på to eller flere koblede kerner. for den første mulighed, sonden kerne skal være fjernt fra andre kerner med høj gyromagnetiske forhold, såsom protoner. Hvis en sådan stilling ikke findes naturligt, berigelse med NMR-aktive kerner på isolerede steder i molekylet eller udskiftning af protoner i nærheden af ​​aktive kerner af deuteroner, at sænke den magnetiske dipol styrke, er det nødvendigt . til opnåelse LLS, en teoretisk analyse af de magnetiske koblinger inden for grupper af kerner kan udføres ^27,28 for at finde optimale midler til Support polarisering. Denne strategi har været en succes i små molekyler såsom aminosyrer ²⁹ og kan anvendes til andre molekyler, der er involveret i metaboliske cyklusser af interesse. For bedre at bevare magnetisering under eksperimentet, kombinationen af opløsning DNP med excitation af LLS lover at forlænge målingen tidsrum for andre enzymatiske reaktioner. ²⁰

Den her beskrevne DNP-NMR eksperiment er tilpasset til måling af pyruvat metabolisme i cancerceller. ⁶ i realtid måling af enzymatisk aktivitet ved opløsning DNP forbedret NMR kan hjælpe nuværende indsats i kræftdiagnose af DNP-forstærket MRI, der allerede anvendes i klinik. ^12. Den molekylære specificitet DNP-forstærket NMR gør det en metode til at skelne mellem molekylære mål og produkter af deres transformationer. Fremtidige forbedringer vil fokusere på vurderingen af andre molekylære sporstoffer for metaboliske omdannelser ³⁰

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNP polarizer	Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)	///	Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components	Edwards vacuum (France)	Various	- turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components
DNP 3.35T Magnet	Bruker (France)
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker (France)
Origin 8.0	OriginLab (US)		Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C	Sigma Aldrich (France)	490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D	Sigma Aldrich (France)	186414
4-Hydroxy-TEMPO 97%	Sigma Aldrich (France)	176141
Deuterium oxide	Sigma Aldrich (France)	151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)	Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0	Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in	Sigma Aldrich (France)	L-2500
bovine serum albumin, BSA	Sigma Aldrich (France)