Ontbinding Dynamic Nuclear Polarisatie Instrumentatie voor Real-time enzymatische reactie snelheidsmetingen door NMR

Abstract

De belangrijkste beperking van NMR-based onderzoek is een lage gevoeligheid. Dit vraagt ​​om lange overname tijden, waardoor het voorkomen van real-time NMR metingen van metabole omzettingen. Hyperpolarisatie via ontbinding DNP omzeilt deel van de gevoeligheid geeft dankzij de grote out-of-evenwicht kernmagnetisatie gevolg van de elektron-to-kern rotatie polarisatieoverdracht. De hoge NMR verkregen signaal kan worden gebruikt om chemische reacties in real time. Het nadeel van hypergepolariseerde NMR woont in de beperkte tijd venster beschikbaar voor signaal acquisitie, die meestal in de orde van de kernspin longitudinale relaxatietijdconstante, T _1, of, in gunstige gevallen, aan de orde van de relaxatietijdconstante in verband met de singlet-toestand van gekoppelde kernen, T _LLS. Cellulaire opname van endogene moleculen en stofwisseling kan essentiële informatie over de ontwikkeling van tumoren en drugs antwoord te geven. Numerous vorige hypergepolariseerde NMR studies hebben de relevantie van pyruvaat aangetoond dat een metabole substraat voor het bewaken van enzymatische activiteit in vivo. Dit werk geeft een gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling en die vereist zijn voor het bestuderen van enzymatische reacties, met name de pyruvaat tot lactaat succespercentage in aanwezigheid van lactaat dehydrogenase (LDH) door hypergepolariseerde NMR.

Introduction

Dynamic nucleaire polarisatie (DNP), ^1,2 een techniek ontwikkeld om de kernspin polarisatie, dat wil zeggen, het gebrek aan evenwicht tussen de 'up' en 'down' spin populaties (P = verbeteren [N _↑ - N _↓] / [N _↑ + N _↓]), werd het eerst geïntroduceerd in 1950. Kernspins zoals ^13C kan worden gepolariseerd P = ^-1 10 in gunstige omstandigheden, kenmerkend bij een temperatuur in de orde van 1 K en in een magnetisch veld van ^3,4 3,357 T. Een doorbraak voor biologische toepassingen kwam in de vroege 2000 met de ontwikkeling van ontbinding DNP bestaande in ontdooide gepolariseerde monsters oververhit water met behoud van de hoge nucleaire polarisatieniveau verkregen bij lage temperaturen. ⁵ de vloeistof-NMR signaal wordt versterkt met een factor 10 ³ -10 ⁴ ten opzichte gemeenschappelijkthermisch-gepolariseerde RT NMR omstandigheden. Ontbinding DNP verschaft derhalve een manier om niet-invasief meten biochemische reactiesnelheden in situ in realtime, waardoor controle dynamiek van NMR met een tijdsresolutie van 1 seconde of minder ^{6 -. 10} het mogelijk werd ook virustypen in zeer lage concentraties ^11.

Onder de niet-invasieve moleculaire beeldvorming modaliteiten, hypergepolariseerde NMR is de enige techniek die tegelijkertijd een substraat en metabolieten daarvan in realtime waardoor metingen. Ontbinding DNP werd enthousiast ontvangen in verschillende wetenschappelijke gebieden, variërend van in vitro NMR klinische MRI ¹² en de meest veelbelovende toepassingen hebben betrekking op de in situ bewaking van de stofwisseling. ^13,14 De belangrijkste beperking van ontbinding DNP is dat na verloop van tijd op de volgorde van vijfmaal de longitudinale relaxatietijd _T1 constant, de verbeterde polaireordening is verloren. Het is daarom noodzakelijk om moleculen te dragen nucleaire spins vertonen relatief lange T ₁ te gebruiken. De tijdspanne van de polarisatie verbetering breiden, langzaam ontspannen kernspin toestanden, bekend als langlevende toestanden (LLS), kan worden gebruikt ^{15 -. 17} LLS ongevoelig zijn voor de intra-pair dipool-dipool wisselwerking, zodat hun karakteristieke relaxatietijdconstante t _LLS, kan veel langer dan _T1. ¹⁸ een magnetisatie levensduur van tientallen minuten tot 1 uur kan daarom worden verkregen, ^19,20 en LLS zijn zowel resonantiespectroscopie voorgesteld (MRS) en MRI. ²¹

De belangrijkste punten die zorgvuldig moeten worden geoptimaliseerd voor het bestuderen van enzymatische reactiesnelheden door hypergepolariseerde NMR zijn: (i) het maximaliseren van de solid-state polarisatie en (ii) het minimaliseren van de polarisatie verlies tijdens het overbrengen van het gehyperpolariseerde oplossing vanpolarisator aan de NMR spectrometer. Dit artikel beschrijft de aanpassing van een op maat gemaakte oplossing DNP apparatuur en injectie systeem om enzymatische reacties te bestuderen. De eigenschappen en prestaties van de installatie zal worden gedemonstreerd met de bekende en algemeen gebruikte gehyperpolariseerde substraat [1- ¹³ C] pyruvaat. De belangrijkste redenen voor deze keuze zijn, ten eerste, het is natuurlijk lang ^13C longitudinale relaxatietijd (T _1> 50 sec bij hoge magnetische velden en temperaturen boven 293 K), die toezicht reacties mogelijk maakt gedurende een aantal minuten, en ten tweede zijn centrale rol in kanker metabolisme. ^13,14 behulp oplossen DNP NMR en een speciaal ontwikkelde injectiesysteem, de oxidatie van pyruvaat gekatalyseerd door lactaatdehydrogenase (LDH) kan worden gecontroleerd aanwezigheid van een eerste verzameling ongemerkt lactaat ^9,22 of zonder ongelabelde lactaat toegevoegd , zoals hier getoond. Aangetoond is dat de [1- ¹³ C] lactaat gemeten signaal in vivo (met inbegrip van in de cellen) na de injectie van gehyperpolariseerde [1- ¹³ C] pyruvaat is voornamelijk te wijten aan een snelle label uitwisseling tussen pyruvaat en lactaat in plaats van lactaat productie. ⁶

We presenteren hier de realtimeproductie van [1- ¹³ C] lactaat van gehyperpolariseerde [1- ¹³ C] pyruvaat geïnjecteerd in een NMR-buis met LDH maar aanvankelijk geen lactaat.

Systeembeschrijving
Er zijn twee belangrijke onderdelen in een ontbinding DNP setup (figuur 1): de DNP polarisator en de NMR-spectrometer. Het belangrijkste element van de DNP polarisator een cryostaat koeling van het monster tot ongeveer 1 K in een bad gepompt helium. De cryostaat wordt in een 3,35 T supergeleidende magneet en een geometrie heeft die garandeert de gepolariseerde monster bij het ​​isocentrum van de magneet (figuur 1) hebben. Binnen de cryostaat, het monster (a) wordt omringd door een NMR-spoel (b) om de polarisatie te meten buildup, in een overmoded microgolfruimte (c). Het gehele monster wordt bewaard bij lage temperatuur in een bad gepompt helium (d) en bestraald met microgolven door de golfgeleider. Het hele systeem wordt beheerd door op maat gemaakte software (Figuur 2D).

De hardware en cryogene apparatuur die nodig is om DNP te voeren en de daaropvolgende ontbinding zijn nog steeds een technologische uitdaging. Een nieuwe DNP cryostaat ^23,24 werd ontwikkeld en getest om de cryogene prestaties te bepalen en vervolgens geoptimaliseerd voor snelle cool-down, helium hold-tijd en de totale minimale helium verbruik tijdens het gebruik.

De cryostaat bestaat uit twee delen. Het eerste deel van de cryostaat is de isolatie Dewar (figuur 2A) die ongeveer in bovenste deel kan worden gescheiden (a) de staart of uitkomstenruimte (b) en de buitenste vacuümkamer (OVC) gehouden onder hoog vacuüm en huisvesting de stralingsschermen (c). Het tweede deel van de cryostaat is de belangrijkste insert (figuur 2B), geplaatst in de isolerende Dewar, waarbij alle processchema voorschriften worden beheerd. De vloeibare helium uit de externe opslag Dewar door de transportleiding (a), in de eerste trap gecondenseerd in de afscheider (b), een tussenkamer die zowel aan de bovenkant van de cryostaat koud en de helium afgedampt verwijderen tijdens de overdracht. De separator druk wordt verlaagd door pompen door een capillair (c) rond het bovenste deel van de cryostaat; de stroom van koude helium in de capillair wordt gebruikt afkoelen van de schotten (d) en de stralingsschermen in de isolatie Dewar (OVC). Het monster wordt geplaatst en gepolariseerd in de steekproef ruimte. De uitkomstenruimte is verbonden met de separator via een andere capillair (e), rond de staart van de belangrijkste cryostaat insert. Dit capillair kan worden geopend of gesloten door een naaldklep handbediende buiten.

Om de lage temperatuur gebruikt tijdens de DNP pr bereikenocess, vloeibaar helium moet worden verzameld in de cryostaat steekproef ruimte en de druk verlaagd tot het mbar bereik. De handelingen die nodig zijn voor cryostaat operatie worden uitgevoerd door middel van een vrij complex pompsysteem met drie sets van pompen, bewaakt en beheerd in verschillende plaatsen met elektronische en elektro-mechanische instrumenten (figuur 2C). De cryostaat OVC dient door het eerste pompsysteem naar hoog vacuüm te pompen. Dit systeem bestaat uit een turbomoleculaire pomp ondersteund door een rotatiepomp (a). De vloeibare helium wordt vanuit de opslag Dewar (b) door de cryostaat transportleiding inlaat naar de cryostaat separator. De separator heeft een uitlaat verbonden met de tweede pompende set. Deze set bestaat uit een 35 m ³ / h membraanpomp (c). Deze lijn maakt het verwijderen van het heliumgas gekookt tijdens de overdracht van de Dewar en tijdens separator koeling. De vloeibare helium verzameld in de afscheider kunnen dan worden overgebracht naar de monsterruimte door de dopIllary buizen hierboven beschreven. Vloeibare helium brengen van de scheider naar de monsterruimte vervolgens lagere uitkomstenruimte druk bereik, een derde pompsysteem bestaande uit een 250 m ³ / uur Roots mbar pomp ondersteund door een 65 m ³ / uur centrifugaalpomp (d) is verbonden met de cryostaat via een handmatige vlinderklep (e).

Alle vacuümsysteem activiteit wordt gecontroleerd en gereguleerd door een elektro-hulpmiddel naar maat (f). Dit apparaat regelt vacuüm lijn verbindingen tussen de cryostaat separator (g) en sample ruimte (h) verkooppunten, de tweede / pompsystemen derde (c, d), een gecomprimeerde helium fles (i) en de buitenwereld. Communicatie tussen (f) als buiten gaat door een eenrichtingsklep (j). De elektro-pneumatische inrichting (f) en alle systeemparameters en de ontbinding hardware worden gecontroleerd en beheerd door een op maat gemaakte elektronische inrichting aangesloten USB met een gemeenschappelijke pc. Uiteindelijk alle systeem via het elektronischeapparaat, wordt beheerd door op maat gemaakte standalone software (Figuur 2D) in voorkomend geval activiteiten worden gelanceerd door middel van een interface met behulp van software knoppen.

Om het monster te beheren en meet NMR signaal opbouw in vaste toestand een aantal inserts (Figuur 3A). Om de cryostaat voor polarisatie te bereiden, plaatst u de belangrijkste monster inzetstuk (a), in de cryostaat. De hoofdmonster inzetstuk is voorzien van een NMR-spoel (b) geplaatst binnen een overmoded verguld microgolfruimte. Pre-vries het substraat bevattende oplossing gepolariseerd (polariserende oplossing) bij de temperatuur van vloeibare stikstof in een geschikte monsterhouder en plaats het op het bodemeinde van de glasvezel monsterhouder (c). Schuif de monsterhouder in de belangrijkste monster insert aan de magneet isocentrum bereiken. Steek de vergulde golfgeleider (d) in het monster houder. De golfgeleider kan de microgolf gegenereerd vanuit een externe microgolfbron reizen met minimale verliezen to het monster.

De op maat gemaakte software voor cryostaat beheer verwerkt automatisch op op de overeenkomende interface-toets verschillende bewerkingen zoals cooldown (de cryostaat temperatuur dicht verlaagd tot vloeibaar helium temperatuur), het vullen (de cryostaat is gevuld met vloeibaar helium tot een vooraf bepaald niveau ), een extra stap van het afkoelen tot T ≈ 1 K (het vloeibare helium bad wordt gepompt de laagst mogelijke temperatuur te bereiken), druk brengen (de cryostaat enigszins druk boven kamertemperatuur druk P = 10-30 mbar cryostaat opening zonder risico toestaan besmetting van de cryostaat per vliegtuig) en oplossing (automatische procedure om de DNP monster op te lossen en breng de verkregen oplossing van het hypergepolariseerde meetplaats, dwz de NMR spectrometer).

De polarisatie wordt uitgevoerd bestralen van het monster met microgolven op 94 GHz (in een polariserend veld B ₀ DNP T, waarbij T _DNP is de polarisatie opbouw tijd. T _DNP is van dezelfde orde van grootte als de longitudinale relaxatietijd van het doel kernen in vaste toestand bij het ​​gegeven gebied en temperatuur. In alle experimenten werd het monster gepolariseerd langer dan 5 T _DNP.

Aan het einde van de polarisatie tijd, het monster moet worden opgelost in een RT oplossing om te worden gebruikt voor het meten van enzymatische activiteit. Tijdens het oplossingsproces worden 5 ml oververhitte D ₂ O uit de ketel van de ontbinding insert (Figuur 3B) gedrukt door samengeperst helium gas (P = 6-8 bar) om de DNP-versterkte staal te bereiken en los het. De resulterende hypergepolariseerde oplossing wordt naar buiten geduwd de ontbinding insert door de samengeperst gas helium, door de ontbinding insert het stopcontact (zie 3C-b 23 De tijd die nodig is voor de steekproef transfer van de DNP polarisator om de NMR-spectrometer site gaat over 3 sec.

Het oplossingsproces wordt uitgevoerd met een oplossing insert (Figuur 3B). Het oplossen inzetstuk bestaat uit een elektronisch-pneumatische eenheid (a), een koolstofvezel stok (b) met verbindingsslangen tussen de boiler in de pneumatische montage en de monsterhouder kast (c), die lekdichte koppeling maakt met het monster container, en terug naar de uitlaat. De elektropneumatische samenstel (figuur 3C) wordt gebruikt voor de productie en rijden oververhitte D ₂ O tot de koolstofvezel vasthouden aan de monsterhouder en vervolgens het gehyperpolariseerde oplossing uit de cryostaat extraheren. De elektro-pneumatische assemblage bestaat uit pneumatische kleppen (a) dat de verbindingen tussen de co controlempressed helium (P = 6-8 bar) lijn (b), het toestel (c) wanneer de D ₂ O wordt geïnjecteerd door de klep (d) en de uitlaat (e) door de koolstofvezel stok (f). Het systeem wordt gecompleteerd door een druk G, een thermometer en een verwarmingsmantel weerstandsdraad in de ketel (c), een trekker (h) en een aansluitdoos (i) gebruikt om het systeem te communiceren met het elektronisch beheer inrichting.

De DNP cryostaat en de NMR-spectrometer verbonden met een transportleiding, dwz een PTFE-buis van 2 mm binnendiameter waarbinnen het gehyperpolariseerde oplossing wordt geduwd door druk gebrachte helium (P = 6-8 bar) bij ontbinding wordt geactiveerd.

Het oplossen sequentie bestaat uit de volgende stappen: in de eerste 300 msec, oververhitte D ₂ O wordt geduwd om de monsterhouder om te smelten en los het hypergepolariseerde bevroren oplossing. Daarna wordt het hypergepolariseerde oplossing geëxtraheerd uit de cryostaat zich op grond van pressurized (P = 6-8 bar) heliumgas en geduwd door de 2 mm binnendiameter PTFE-buis (figuur 3C-e) om de meting plaats waar de injectie wordt uitgevoerd met een van de in stap beschreven procedures 6.2.1 of Step 6.2 0,2.

De tweede component van de ontbinding DNP NMR opstelling is de NMR spectrometer. In de hierin beschreven opstelling, de NMR-spectrometer werkt op een veld B ₀ = 11,7 Tesla. Een 5 mm NMR probe wordt gebruikt om het gehyperpolariseerde signaal na ontbinding meten. De NMR-spectrometer wordt bediend door middel van de NMR-console, gebruikt voor zowel solid-state en vloeibare toestand NMR-metingen, en de firma meegeleverde software XWinNMR. Een typische meting bestaat uit een lage kantelhoek vaste puls (hetzij gekalibreerd voor liquidstate of niet gekalibreerde voor solid-state metingen) gevolgd door signaal acquisities.

Metingen van de solid state thermische polarisatie signaal en DNP-afgeleide signaal opbouw worden uitgevoerd met de op maat gemaakte ¹³ C spoel op de plaats van de DNP polarisator (figuur 3ab) gekoppeld aan de NMR spectrometer. In deze specifieke situatie de NMR-spectrometer niet signaal vergrendeling uit te voeren. Wanneer solid-state metingen worden uitgevoerd, aanzienlijke verstoringen op de polarisatie te voorkomen, moet de tijd tussen verwervingen lang genoeg is globaal meer dan 0,5 T _DNP.

Het vaste verbetering wordt gedefinieerd als waar wordt het hypergepolariseerde signaal (verkregen in stap 3,3) en is de solid state signaal (verkregen bij thermisch evenwicht bij gepompt vloeibaar helium temperatuur in stap 3.2) (Figuur 4A). Deze parameter defines de maximale polarisatie vindt NMR experimenten vóór onvermijdelijke verliezen tijdens het overbrengen van het gehyperpolariseerde oplossing. De meting wordt uitgevoerd met een eenvoudige puls-verwerven sequentie met behulp van een niet-gekalibreerde lage flip hoek pols. Puls kalibratie wordt vaak overgeslagen solidstate metingen.

Een analoge procedure kan worden gebruikt om het gehyperpolariseerde signaalversterking in de vloeibare toestand te bepalen. In dit geval wordt het monster geplaatst in de spectrometer buis voor de injectie (stap 6,2), bestaande uit 500 gl D ₂ O. Na oplossing en injectie, zijn er twee belangrijke parameters te controleren. De eerste is de versterking van de hypergepolariseerde NMR spectrometer site, (Figuur 4B), waarbij het signaal direct na de injectie van de hyper gepolariseerde oplossing (verkregen in stap 7,1) en is de thermische polarisatiesignaal (verkregen in stap 7,2). De tweede is de longitudinale relaxatietijd _T1 (Figuur 4B, bijvoegsel), verbonden met het substraat en elke stofwisselingsproduct (verkregen door exponentiële fitting signalen verkregen in stap 7,1). Deze twee parameters bepalen de minimum substraatconcentratie gezorgd voor een voldoende signaal-ruisverhouding (SNR) en de beschikbare tijdvenster voor de meting van de metabole omzettingen te verkrijgen. De verhouding tussen de solid-state polarisatie en liquidstate polarisatie geeft een schatting van de polarisatie verliezen door ontspanning tijdens het gehyperpolariseerde oplossing overdracht. Een waardeation12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "/> moeten worden waargenomen in afwezigheid van ontspanning verliezen.

Protocol

Opmerking: Alle data-analyse werd uitgevoerd met commerciële software.

1. Bereid de polariserende Solution

1. Bereid 2 ml van een 1,12 M ^13-gelabeld natriumpyruvaat (Na ⁺ _[CH3-CO- ¹³ COO] ^-, substraat) oplossing gedoteerd met 33 mM TEMPOL radicaal (4-hydroxy-2,2,6,6- tetramethylpiperidine-1-oxyl, polariserende agent) ⁴ in 2: 1 d ₂ O / d ₆ ethanol voor ¹³ waarnemingen C. LET OP: Voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen als gevolg van de brandbare aard van d ₆ ethanol.
2. Controleer of de radicale concentratie optimaal is in termen van behaalde polarisatie.
   1. Veranderen enigszins de radicale concentratie van de oplossing in punt 1.1 (bijvoorbeeld tot 30 mM of 35 mM).
   2. Bepaal iteratief de solid-state enhancement (zie stap 3) en vind de radicale concentratie die leidt tot de maximale verhoging.

2. Polarization

1. Verlaag de DNP cryostaat temperatuur door de cooldown procedure. Klik op de 'Cooldown' knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D).
2. Verzamel vloeibaar helium in de DNP cryostaat door middel van het vullen. Klik op de 'Filling' knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D).
3. Plaats 300 pl van de geoptimaliseerde polariserende oplossing van stap 1.1 in de monsterhouder voorzien van de DNP polarisator. Bevries de monsterhouder met het monster binnen door zachtjes dompelen in een vloeibaar stikstof bad.
4. Elimineer de vloeibare stikstof die in de monsterhouder na invriezen (stap 2,3) door extraheren van de monsterhouder uit de vloeibare stikstof bad en draaien ondersteboven zijn.
   OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om een ​​gedegen oplossing van het monster te verkrijgen (zie stap 5).
5. Plaats het monster in de cryostaat.
   LET OP: Deze Step, samengesteld uit de volgende deelstap, snel moeten worden uitgevoerd (dat wil zeggen, in minder dan 10-20 seconden) om het monster smelten voorkomen.
   1. Plaats het monster container in de monsterhouder. Schuif de monsterhouder in de belangrijkste cryostaat insert. Steek de microgolven golfgeleider in de monsterhouder.
6. Verlaag de cryostaat temperatuur door het starten van de 1 K koeling procedure. Klik op de '1K Cooling' knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D).
7. Schakel de magnetron bron in en bestralen van het monster. Klik op de 'MW-ON knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D).

3. Solid-state NMR metingen

1. Koppel de coaxkabel van de NMR-console detectie kanaal uit de spectrometer spoel door het draaien van de connector tegen de klok in 90 ° en te trekken. Steek de coaxiale kabel van de detectie-kanaal naar de coaxiale connector van de cryostaatNMR-spoel. Steek de mannelijke connector van de NMR console kabel in de vrouwelijke connector van de cryostaat NMR-spoel, met aandacht voor de oriëntatie pin; Duw stevig vast en draai de connector met de klok mee 90 °.
2. Meet de thermische NMR signaal in de vaste toestand bij de cryostaat plaatse met een simpele puls-sequentie verwerven met niet gekalibreerde lage flip-hoek pulsen herhaald met een interval van T = 5 min. Na het opzetten van de meting, schrijven in de opdrachtregel van de software 'zg' en druk op 'Enter' toets op het toetsenbord. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie over spectrometer werking en meetopstelling.
3. Meet de DNP-versterkte NMR signaal. Herhaal de handelingen van stap 3.2 na de inleiding van de DNP-proces zoals beschreven in paragraaf 2.
4. Koppel de NMR console detectie kanaal coaxiale kabel van de cryostaat NMR-spoel door het draaien van de connector tegen de klok in 90 ° en te trekken. Steek de coaxiale kabel van de detection kanaal naar de coaxiale connector van de spectrometer spoel. Steek de mannelijke connector van de NMR console kabel in de vrouwelijke connector van de spectrometer spoel, met aandacht voor de oriëntatie pin; Duw stevig vast en draai de connector met de klok mee 90 °.

4. Optimaliseer de homogeniteit van het Main Magnet Field ( 'vulplaten')

1. Plaats in de spectrometer een buis met 500 ui van het mengsel verkregen in eerdere experimenten (dwz na stap 6,2).
2. Voer NMR spectrometer vulplaten door het variëren van de stroom in de shimming gradientspoelen zoek de maximale "lock-signaal van deuterium. Selecteer de gewenste shimming spoel door op de bijbehorende knop op de NMR-console.
   1. Draai de knop op de NMR console de rotatierichting dat het slot signaal toeneemt bepalen. Blijven draaien totdat het signaal een maximum bereikt. Selecteer een andere vulplaten spoel en herhaal de maximalisatie until een lokaal maximum van alle shimming spoelen wordt gevonden. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie. Aan het einde, verwijder het monster wordt gebruikt voor vergrendeling.

5. Ontbinding

1. Plaats 5 ml van D _{2 O} in de ontbinding insert ketel. Druk en warmte het _D2O via de weerstandsdraad tot T ≈ 180-200 ° C wordt bereikt. Klik op het 'Prepare Heater' knop op de cryostaat software-interface (Figuur 2D).
2. Na voltooiing van het monster polarisatie procedure (bijvoorbeeld na 3 T _DNP) op druk cryostaat iets boven kamerdruk. Klik op de knop 'SS Operations' op de cryostaat software-interface (Figuur 2D). Verwijder de magnetron gids van de ontbinding insert.
3. Schuif de ontbinding insert (Figuur 3B) naar beneden in de monsterhouder (Figuur 3A-C). Het oplossen inzetstuk aan de bodem van de monsterhouder bereikt en moet volledig bij een lekdichte verbinding met de monsterhouder maken om _D2O lekken in de cryostaat voorkomen.
4. Op de hardware trekker (Figuur 3C-h) de ontbinding sequentie, een vooraf bepaalde getimede opeenvolging van pneumatische kleppen werkzaamheden aanvangen.

6. Injectie

1. Voordat ontbinding plaats van een 5 mm NMR-buis, met 500 pi monster (bijvoorbeeld, D ₂ O meting in stap 7 of LDH oplossing van stap 8 voor enzymatische activiteit gemeten in stap 9), in het isocentrum van de 11,74 T NMR spectrometer (zie stap 4).
2. Net na ontbinding (stap 5), meng 500 pi gehyperpolariseerd oplossing met het monster geplaatst in de NMR-spectrometer in stap 6,1.
   1. Handmatig Injection: het verzamelen van de hypergepolariseerdeoplossing aan het einde van een 2,5 m lange verbindingsleiding in een bekerglas geplaatst nabij de NMR-spectrometer magneet. Handmatig injecteren 500 pi gehyperpolariseerd oplossing in de NMR-monsterbuis door middel van een op maat gemaakte capillair systeem.
   2. Automatische injectie: vóór de ontbinding proces, sluit de verbindingsbuis een geautomatiseerde op maat gemaakte injectie apparaat dat het hypergepolariseerde oplossing uit de helium gas wordt gebruikt voor de overdracht van elkaar scheidt. Het apparaat geeft automatisch 500 ul van gehyperpolariseerd oplossing in de monsterbus.

7. Liquid-state NMR Measurement

1. Nadat het oplossen Meet de NMR gehyperpolariseerde signaal van het monster in de spectrometer door een reeks van 10 ° kantelhoek pulse-verwerven sequenties gescheiden door 1,5 sec om de progressie van magnetisatie van het substraat (A) en het product (B) volgen. Na het opzetten van de meting, schrijven in de opdrachtregel van de software 'zg' en druk op de & #39; Enter 'toets op het toetsenbord. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie over spectrometer werking en meetopstelling.
2. Zodra de magnetisatie volledig ontspannen (dat wil zeggen, na t = 10 T _1), meet de thermische NMR signaal door een reeks van 90 ° kantelhoek pulse-verwerven sequenties gescheiden door T = 3 ₁ T ≈ 3 min. Na het opzetten van de meting, schrijven in de opdrachtregel van de software 'zg' en druk op 'Enter' toets op het toetsenbord. Raadpleeg de NMR-spectrometer handleiding voor meer informatie over spectrometer werking en meetopstelling.

8. Bereiding van enzym bevattende monsters (specifiek voor pyruvaat tot lactaat Transformation)

1. Bereid de reactiebuffer met het volgende recept: 50 mM gereduceerd nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), 1 mM ethyleen--azijnzuur (EDTA), 0,1 mM dithiothreïtol (DTT) in 0,1 M fosfaatbuffer, pH =7.0.
2. Bereid een konijn spier LDH oplossing 1 U / ml vers bereid in reactiebuffer bij 20 ug / ml runderserumalbumine, BSA.
3. Meng 478 gl reactiebuffer (stap 8,1), 20 gl _D2O mogelijk te maken spectrometer veld stabilisatie ( 'vergrendeling') en 2 pl LDH-oplossing (stap 7,2).
4. Plaats de 500 ul volume van de oplossing bereid in Stap 8,3 in een 5 mm NMR-buis en plaatst de buis in de 500 MHz NMR spectrometer.

9. Compleet enzymatische reactie Rate Measurement Procedure

1. Bereid de polariserende monster (stap 1) en polariseren is (stap 2).
2. Voer vulplaten op de spectrometer (Stap 4) uiteenzetten en de enzymatische monster (stap 8).
3. Voer de ontbinding (stap 5) en de injectie (Stap 6).
4. Meten een reeks signalen van het gehyperpolariseerde monster met 10 ° kantelhoek acquisities pulsen gescheiden door 1,5 sec (stap 7). Deze stap maakt het meten van het hypergepolariseerdesignaal verval en het signaal opbouw van metabolieten.

10. Fitting

1. Iedere afgenomen in stap 9,4 spectrum identificeren van de pieken die overeenkomen met substraat (A) en product (B) respectievelijk en integreren (bepalen piekoppervlak). De pieken integralen geven de magnetisatie tijdsverloop signalen (M _{(A, B)} (t), zie vergelijking 2).
2. Met oplossing van vergelijking (2), bepaalt de waarde van F = _(RA + k _eff ) Vanaf een eenvoudige exponentiële fit van het substraat geïntegreerde signaal in stap 10,1.
3. Met behulp van de waarde F = (R _A + k _eff ) Bepaald in stap 10,2, bepalen k _eff en _RB een fit van het produktsignaal M _B (t) met de functie verkregen door integratie van vergelijking (2). Raadpleeg Representatieve resultaten sectie (Enzymatic activiteit en metabole metingen) voor details over de reactie modelleren, montage en rf correctie.

Representative Results

NMR signaal winsten met behulp van ontbinding DNP
De DNP effect aan de overdracht van de hoge polarisatie van ongepaard elektron spins, typisch van stabiele radicalen moleculen NMR-actieve kernen onder microgolfbestraling van het monster. De meest gebruikte vrije radicalen zijn TAM (OXO63) en TEMPOL. ⁴ Polarisatie procedures met behulp van TEMPOL kan worden geoptimaliseerd door 'cross-polarisatie'. ²⁵

Het optimaliseren van de concentratie van het stabiele radicaal om de maximale nucleaire polarisatie in de vaste toestand te verkrijgen is cruciaal voor het succes van de techniek. De optimale concentratie TEMPOL bleek 33 mM in de experimentele omstandigheden van deze studie. Deze polarisatie van het gekozen substraat voldoende is om de enzymatische omzetting in real time te volgen.

Het magnetisch veld van de Polarizer geïnstalleerd te Parijs Descartes B ₀ = 3,35 T en de onderdelen van deze inrichting zijn boven (figuren 1-3) beschreven. De cryostaat ontwerp garandeert dat het uiteindelijke monster positie samenvalt met de magneet isocentrum. Het magnetisch veld van de polarisator was hellende en opgevuld met de supergeleidende spoelen vulstuk alleen met de cryostaat plaats. De laatste proton line-breedte van een 1 x 0,5 x 0,5 cm water monster was 23 KHz. Wij hebben de waarderingsregels en voor [1 ¹³ C] pyruvaat. Om dit te doen, is het noodzakelijk om eerst de ¹³ C DNP-versterkte signaal te bepalen in de vaste toestand bij de plaats polarisator voor de ontbinding (Figuur 4A). Na de ontbinding, we meten de [1-13 C] pyruvaat hypergepolariseerde signaal en het verval van de spectrometer plaats. Vloeibare toestand signaal werd gemeten op een test ontbinding via 500 pl _D2O als monster in de NMR spectrometer. Dit liet ons toe om het vaste DNP enhancement (figuur 4B, bijvoegsel), vloeibare-NMR polarisatieniveau (figuur 4B) en tijdens het overbrengen de polarisatie verliezen bepalen. De verhouding tussen de signalen gemeten in stap 3,3 en 3,2 stap definieert het vaste versterking, . De verhouding tussen de eerste gemeten signaal in stap 7,1 en het signaal van stap 7,2 wordt de vloeibare toestand gehyperpolariseerd enhancement, .

Gegevens uit stap 3, summarized in Figuur 4A en Figuur 4A (inzet), blijkt dat de techniek het mogelijk maakt om ¹³ C polariseer [1- ¹³ C] pyruvaat tot = 22 ± 5, overeenkomend met een ¹³ C polarisatie = 1,5 ± 0,3%.

Dit polarisatieniveau is meer dan duizend maal de koolstof thermische polarisatie gemeen MRS omstandigheden (bijvoorbeeld 11,74 T en 300 K). Gegevens uit stap 7, samengevat in figuur 4B en figuur 4B (inzet), toestaan ​​bepaling van de vloeibare toestand ¹³ C hyperpolarisatie van [1- ¹³ C] pyruvaat, = 1 ± 0,2%. De versterking verkregen in de vaste toestand voor pyruvaat wastoereikend voor het experiment, hoewel hogere verbeteringen aangetoond met verschillende resten. ⁵ Het tijdsverloop gegevens aanpassen van stap 7,1 is een maat voor de relaxatietijdconstante. Het pyruvaat longitudinale ontspanning tijd in het mengsel van 500 ul DNP verbeterde oplossing en 500 ul D _{2 O,} was T ₁ = 75 ± 5 sec na rf correctie (zie vergelijking (3)).

Enzymatische activiteit en metabolische metingen
Ontbinding DNP NMR detectie van ¹³ C-gemerkt substraat (A) kan worden gebruikt om in real tijdsdynamiek enzymatische omzetting en observeer de vorming van product (B):

Direct na de injectie van gehyperpolariseerde substraat (A),het signaal van product (B) is nul. Vervolgens wordt de enzymatische omzetting (1) gaat (B) te produceren. De magnetisatie van de ^13C kernen wordt niet beïnvloed door de verschillende chemische verschuivingen en de chemische verandering van de moleculen. Niettemin kan de nieuwe omgeving tot verschillende longitudinale relaxatietijd bekijken van de ¹³ C in B. Het produktsignaal tijdsverloop kan kwalitatief in drie stappen worden gescheiden: in het begin, de enzymatische omzetting transformeren A naar B veroorzaakt een toename in B-signaal; na een bepaalde tijd, afhankelijk van de experimentele omstandigheden, de magnetisatie verliezen door ontspanning evenwicht deze toename en het signaal B bereikt een maximum; tenslotte bij langere tijden, het signaal B vervalt tengevolge van longitudinale relaxatie. In de hypothese enzym verzadiging verwaarlozen terug omzetting en rekening houdend met magnetische relaxatie, kan de magnetisatie van de twee moleculaire species (A en B) tijdens de enzymatische omzetting worden beschreven door eePLED differentiaalvergelijking systeem: ²²

waarbij M _{(A, B)} (t) magnetisaties van moleculaire species A en B, respectievelijk, k _eff de effectieve omzetting snelheidsconstante voor signaaloverdracht door de enzymatische reactie en R _{(A, B) zijn} de schijnbare longitudinale relaxatietijd snelheidsconstanten van kernen waargenomen in de moleculaire species A en B, respectievelijk R _{(A, B) vertegenwoordigen} zowel de zuivere longitudinale magnetisatie ontspanning en het effect van rf pulsen.:

waarbij T _{1 (A, B)} is de longitudinale relaxatietijdtijdconstante van de kern in de lokale omgeving van moleculaire moleculaire species A en B, respectievelijk. θ en τ de rf kantelhoek en de vertraging tussen twee signalen acquisities, respectievelijk.

In deze studie substraat A en product B waren [1- ¹³ C] pyruvaat en [1- ¹³ C] lactaat, respectievelijk, en het doel was om te meten [1- ¹³ C] lactaatproductie door LDH onder omstandigheden waarbij geen (isotoop ongemerkt) lactaat was in de oplossing aanwezig bij de aanvang van het experiment. De meting bestaat uit een reeks van ¹³ C spectra opgenomen met een eenvoudige pulseacquire sequentie bij T = 21 ° C. Een gekalibreerde 10 ° kantelhoek puls werd gebruikt voor opeenvolgende excitaties (stap 9). De vertraging tussen twee opeenvolgende pulsen was τ = 1,5 sec. De NMR overname sequentie werd gestart enkele tientallen seconden voordat het gehyperpolariseerde solutioneninjectie. Pyruvaat substraatconcentratie in de monsterbuis na de injectie was 25-35 mM. In stap 10 het lactaat tot pyruvaat omzettingssnelheid bij een LDH concentratie van 10 ^-3 U / ml gemeten. Het opgenomen signaal van lactaat en pyruvaat passen goed het model in vergelijking (2) (stippellijn in figuur 5) en op k _eff = 0,9 ± 0,1 x 10 ^-3 sec ^-1 (Figuur 5). Deze waarde is het eens met de initiële reactiesnelheid bepaald door de verhouding [Lac] / [Pyr] op tijdstip 0 sec (Figuur 5, inzet).

Figuur 1. Schema van de experimentele apparatuur. De polarisator (links) bestaat uit een microgolfruimte (c) zich in een cryostaat (d) die in een brede boring 3,35 T supergeleidende magneet. Een op maat gemaakte NMR spoel (b) omliggende tHij monster (a) wordt gebruikt voor het bewaken van de kernspin polarisatie in situ. De helium badtemperatuur wordt op 1,12 ± 0,03 K terwijl het monster wordt bestraald de microgolf frequentie ν _mw = 94 GHz. Het systeem maakt NMR-metingen op het vaste monster worden uitgevoerd tijdens de polarisatie. De gepolariseerde monster wordt opgelost in oververhitte water en duwde met samengeperst gas helium door de overdracht lijn in de monsterbus eerder geplaatst in een aangrenzend NMR-spectrometer (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. cryostaat en vacuümsysteem schema. (A) cryostaat isolatie Dewar; (B) cry ostat main insert; (C) vacuümsysteem aansluitingen; (D) screenshot van het beheer van software-interface met knoppen gebruikt om specifieke operaties in Stap 2 en Stap 5 van de sectie protocol beschreven uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Sample handling en ontbinding. (A) sample handling inzetstukken; (B) ontbinding insert; (C) detail van elektro-pneumatische aansluitingen van ontbinding insert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

">
Figuur 4. Solid-state polarisatie opbouw en hypergepolariseerde signaal verval. Ontbinding DNP signalen. (A) solid-state NMR polarisatietoestand opbouw signaal van een 1,12 M natrium [1- ¹³ C] pyruvaat oplossing tijdens DNP polarisatie (kruisjes, voorzien van een exponentiële functie S (t) = A x exp (-t / T _b) + B tijdconstante _Tb = 270 sec) en ontspanning (cirkels, S (t) = A exp · (t / _Tb) + B, T ^ss ₁ = 840 sec); (A, bijvoegsel) vergeleken DNPenhanced en thermisch-gepolariseerd (opgeschaald 10 keer) magnetisatie signalen in de vaste toestand (ε _ss = 22 ± 5, overeenkomend met een solid-state polarisatie P _SS = 1,5 ± 0,3%); (B) vergelijking tussen de eerste spectrum opgenomen na de ontbinding en de Averaged spectrum (opgeschaald 100 keer) verkregen uit het thermisch gepolariseerde ^13C draait bij KT met behulp van 1024 transiënten (ε = 1000 ± 200). Het oplossingsproces nam 3,3 sec en de automatische injectie ongeveer 2 seconden voor een signaalverlies van 40%. Voor de experimenten uitgevoerd overbrengen van het monster door handmatige injectie werden de extra verliezen door de langere injectievertraging geschat op 30%; (B, inzet) hyperpolarized signaal verval van pyruvaat na oplossen in afwezigheid van LDH (T ₁ = 75 ± 5 sec). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. LDH activiteit en kankercellijnen afbraak resulteert. Opbouw van [1- ¹³ C] lactaat signaal vanwege enzymatic omzetting bij een LDH concentratie van 10 ^-3 U / ml, gevolgd door signaal verval tengevolge van longitudinale relaxatie van ^13C magnetisatie. De rode lijn toont de fit met de in vergelijking (2) beschreven model omvat de effecten van ontspanning en enzymatische omzetting. (Inzet) verhouding tussen [1- ¹³ C] lactaat en [1 ^-13 C] pyruvaat concentratie met een extrapolatie van de reactiesnelheid op tijdstip t = 0 (rode lijn). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De kritische punten van de ontbinding DNP NMR experiment zijn: (i) het polarisatieniveau bereikt voor het substraat, waarbij het laagste productconcentratie noodzakelijk experimenten en het aantal signaal acquisities die kunnen worden uitgevoerd en (ii) de levensduur bepaalt magnetisatierichting ten opzichte van de duur van de overdracht tussen de polarisatie en de detectie sites en de snelheid van substraat transformatie. Het injectiesysteem van de ontbinding DNP opstart hierin beschreven maakt monsteroverdrachtsstrook in slechts 3-4 sec. Hoewel de overdracht zo snel als in de door S. Bowen en C. Hilty voorgestelde methode was niet ^werden 26 polarisatie verliezen voor pyruvaat beperkt als gevolg van de gematigde longitudinale ontspanning in het lage gebied. [1- ¹³ C] pyruvaat, met zijn lange carbon- nucleaire T _1, maakt het meten van de flux door LDH bij concentraties van slechts 10 ^-3 U / ml.

De hoge signaal-ruisverhouding verkregen met oplossing DNP suggereert dat gevoelig is voor zelfs lager [1- ¹³ C] pyruvaat concentraties en lagere enzymatische conversie kan zijn. De bereikte polarisatieniveau biedt meer dan 200 experimenten met een grote signaal-ruisverhouding in de vloeibare-NMR spectrometer te verkrijgen met een lage kantelhoek α = 10 °. Dit laat ruimte voor optimalisatie, zowel in termen van herhaling tijden en flip hoeken. Voor de opbouw van polarisatie in de solid-state sommige moleculen polariseren goed met een aantal polariserende middelen (TEMPO, OXO63) ⁴ en anderen niet, om redenen die nog niet volledig worden begrepen. Experimentele proeven zijn de enige manier om te bepalen of de polarisatie stap succesvol is. Om de polarisatie niveau te verbeteren, kan men het gebruik van verschillende radicale soorten ^{4 en} de toepassing van verschillende technieken te vertrouwen op 'cross-polarisatie' te verkennen. ²⁵

NHOUD "> Verdere optimalisatie van radicale en substraatconcentraties en de oplosmiddelsamenstelling in de DNP monster kan worden geprobeerd polarisatie te verbeteren. De techniek is beperkt tot moleculen waarin een kern of een groep kernen kunnen polarisatie behouden na ontbinding kan geïdentificeerd. polarisatie kan worden gehandhaafd hetzij als een onevenwicht tussen mono-nucleaire eigentoestanden hoge magnetische velden of in de vorm van LLS gedelokaliseerd twee of meer gekoppelde kernen. de eerste optie wordt de probe kern heeft ver van andere kernen met hoog beschouwd gyromagnetische verhouding, zoals protonen. als dergelijke positie niet natuurlijk wordt gevonden, verrijking in NMR-actieve kernen in geïsoleerde plaatsen in het molecuul of vervanging van protonen in de nabijheid van actieve kernen door deuteronen, de magnetische dipool sterkte verlagen, nodig . om LLS, een theoretische analyse van de magnetische koppelingen in groepen van kernen uit ^27,28 om optimale middelen supp te voeren vindenort polarisatie. Deze strategie is nuttig gebleken om kleine moleculen zoals aminozuren ²⁹ en kan worden toegepast op andere moleculen die betrokken zijn in metabole cycli plaats. Om magnetisatie beter behouden tijdens het experiment, de combinatie van ontbinding DNP met excitatie van LLS belooft de meting tijdspanne verlengen andere enzymatische reacties. ²⁰

De DNP-NMR experiment beschreven is ingericht voor het meten van pyruvaatstofwisseling in kankercellen. ⁶ de real-time meting van enzymatische activiteit door oplossen DNP versterkte NMR kunnen huidige inspanningen op kankerdiagnose helpen door DNP-versterkte MRI, reeds in de clinic. ¹² de moleculaire specificiteit van DNP versterkte NMR laat een voorkeursmethode voor het onderscheid tussen moleculaire doelen en de producten van hun transformaties. Toekomstige verbeteringen zal zich richten op de beoordeling van andere moleculaire tracers voor metabole omzettingen ³⁰

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNP polarizer	Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)	///	Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components	Edwards vacuum (France)	Various	- turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components
DNP 3.35T Magnet	Bruker (France)
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker (France)
Origin 8.0	OriginLab (US)		Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C	Sigma Aldrich (France)	490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D	Sigma Aldrich (France)	186414
4-Hydroxy-TEMPO 97%	Sigma Aldrich (France)	176141
Deuterium oxide	Sigma Aldrich (France)	151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)	Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0	Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in	Sigma Aldrich (France)	L-2500
bovine serum albumin, BSA	Sigma Aldrich (France)