Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

Abstract

Il limite principale di indagini NMR-based è bassa sensibilità. Questo richiede lunghi tempi di acquisizione, evitando misure NMR in tempo reale delle trasformazioni metaboliche. Iperpolarizzazione tramite dissoluzione DNP aggira parte della sensibilità emette grazie alla grande magnetizzazione nucleare fuori equilibrio derivante dal trasferimento polarizzazione di spin elettrone-to-nucleo. Il segnale alto NMR ottenuto può essere utilizzato per monitorare le reazioni chimiche in tempo reale. L'aspetto negativo di hyperpolarized NMR risiede nella finestra di tempo limitato disponibile per l'acquisizione del segnale, che è di solito dell'ordine di spin nucleare longitudinale costante di tempo di rilassamento, T _1, o, in casi favorevoli, dell'ordine della costante di tempo di rilassamento associato il singoletto-stato di nuclei accoppiati, T _LLS. assorbimento cellulare di molecole endogene e tassi metabolici in grado di fornire informazioni essenziali per lo sviluppo del tumore e la risposta ai farmaci. Numerosi precedenti studi NMR hyperpolarized hanno dimostrato la pertinenza di piruvato come substrato metabolico per monitorare l'attività enzimatica in vivo. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della configurazione sperimentale e metodi richiesti per lo studio delle reazioni enzimatiche, in particolare il tasso piruvato-to-lattato conversione in presenza di lattato deidrogenasi (LDH), mediante NMR iperpolarizzato.

Introduction

Polarizzazione nucleare dinamica (DNP), ^1,2 di una tecnica progettata per migliorare la polarizzazione di spin nucleare, vale a dire, lo squilibrio tra 'up' e 'down' popolazioni di spin (P = [N _↑ - _↓ N] / [N + N _{↑ ↓]),} è stato introdotto nel 1950. Spin nucleari come ¹³ C possono essere polarizzati fino a P = 10 ^-1 in condizioni favorevoli, tipicamente ad una temperatura dell'ordine di 1 K e in un campo magnetico di 3.357 T. ^3,4 Una svolta per applicazioni biologiche venuto nel primi del 2000 con lo sviluppo di scioglimento DNP che consiste nello sciogliere campioni polarizzati congelati in acqua surriscaldata pur mantenendo il livello di polarizzazione nucleare ottenuto a bassa temperatura. ⁵ il segnale NMR allo stato liquido è aumentata di un fattore 10 ³ -10 ⁴ rispetto ai Comunetermicamente polarizzato condizioni RT NMR. Dissoluzione DNP fornisce quindi un modo per misurare biochimico velocità di reazione non invasivo in situ in tempo reale, consentendo dinamiche monitoraggio di NMR con una risoluzione temporale di 1 sec o inferiore ^{6 -. 10} 'diventato possibile rilevare analiti in concentrazioni molto basse ^11.

Tra i non invasivi modalità di imaging molecolare, hyperpolarized NMR è l'unica tecnica che permette contemporaneamente misurare un substrato e dei suoi metaboliti in tempo reale. Dissoluzione DNP è stato ricevuto con entusiasmo in vari settori scientifici vanno da in vitro NMR per MRI clinica ^{12 e} le applicazioni più promettenti sono legati al monitoraggio in situ del metabolismo. ^13,14 Il principale limite di scioglimento DNP è che, dopo un tempo sulla dell'ordine di cinque volte il tempo di rilassamento longitudinale costante T _1, la migliorata polarezazione è perduto. È quindi necessario utilizzare molecole portanti spin nucleari espongono relativamente lungo T _1. Per estendere il lasso di tempo della valorizzazione di polarizzazione, lentamente-relax stati di spin nucleari, noti come stati longevi (LLS), può essere ^usato 15 ^{-. 17} LLS sono insensibili al intra-coppia di interazione dipolo-dipolo, quindi la loro tempo di rilassamento caratteristica costante, T _LLS, può essere molto più lungo di T _1. ¹⁸ Una vita di magnetizzazione di decine di minuti e fino a 1 ora potrebbe quindi essere ottenuto, ^19,20 e LLS sono stati proposti sia per spettroscopia di risonanza magnetica (MRS) e la risonanza magnetica. ²¹

I punti principali che devono essere attentamente ottimizzata per studiare tassi reazione enzimatica hyperpolarized NMR sono: (i) massimizzare la polarizzazione allo stato solido e (ii) ridurre al minimo la perdita di polarizzazione durante il trasferimento della soluzione iperpolarizzato dalpolarizzatore allo spettrometro NMR. Questo articolo descrive l'adattamento di un sistema di apparecchi e di iniezione DNP dissoluzione su misura per studiare le reazioni enzimatiche. Le caratteristiche e le prestazioni della messa a punto saranno dimostrate con il ben noto e diffuso substrato hyperpolarized [1- ¹³ C] piruvato. I motivi principali di questa scelta sono, in primo luogo, la sua naturale lungo ¹³ C tempo di rilassamento longitudinale (T _1> 50 sec a campi magnetici elevati e temperature superiori a 293 K) che permette le reazioni di monitoraggio durante alcuni minuti, e, dall'altro, il suo ruolo centrale nel cancro metabolismo. ^13,14 Utilizzando dissoluzione DNP NMR e di un sistema di iniezione personalizzato sviluppato, l'ossidazione del piruvato catalizzata dalla lattato deidrogenasi (LDH) può essere monitorato in presenza di un pool iniziale di lattato non marcato ^9,22 o senza lattato non marcato aggiunto , come mostrato qui. E 'stato dimostrato che il segnale lattato [1- ¹³ C] misurato in vivo (anche in cellule) dopo l'iniezione di iperpolarizzato [1- ¹³ C] piruvato è principalmente dovuta ad uno scambio un'etichetta veloce tra piruvato e lattato piuttosto che la produzione di lattato. ⁶

Presentiamo qui la produzione in tempo reale [1- ¹³ C] lattato dal piruvato iperpolarizzato [1- ¹³ C] iniettato in un tubo NMR contenente LDH ma inizialmente non lattato.

Descrizione del sistema
Ci sono due parti principali in una configurazione di dissoluzione DNP (Figura 1): il polarizzatore DNP e spettrometro NMR. L'elemento principale del polarizzatore DNP è un criostato al raffreddamento del campione a circa 1 K in un bagno di elio pompato. Il criostato è inserito in un superconduttore magnete 3,35 T e presenta una geometria che garantisce di avere il campione polarizzante all'isocentro del magnete (Figura 1). All'interno del criostato, il campione (a) è circondato da una bobina NMR (b), per misurare la polarizzazione buildup, contenuta in una cavità a microonde overmoded (c). L'intero campione viene mantenuto a bassa temperatura in un bagno di elio pompato (d) e irradiato con microonde attraverso la guida d'onda. L'intero sistema è gestito da un software su misura (Figura 2D).

L'hardware e le attrezzature criogeniche necessari per eseguire DNP ed il successivo scioglimento sono ancora una sfida tecnologica. Un nuovo DNP criostato ^23,24 è stato sviluppato e testato per determinare le sue prestazioni criogenici e poi ottimizzata per un veloce raffreddamento, l'elio hold-tempo e il consumo globale di elio minimo durante il funzionamento.

Il criostato è costituito da due parti. La prima parte del criostato è dewar isolamento (Figura 2A) che possono essere grossolanamente diviso in parte superiore (a) la coda, o lo spazio campione (b), e la camera a vuoto esterna (OVC) tenuti sotto alto vuoto e l'alloggiamento della schermi di radiazione (c). La seconda parte del criostato è il principalesert (Figura 2B), inserito nel dewar isolante, in cui sono gestite tutte le normative di flusso. L'elio liquido proveniente dal dewar memorizzazione esterno attraverso la linea di trasferimento (a), è nella prima fase condensata nel separatore (b), una camera intermedia usato sia per tenere la parte superiore del freddo criostato e rimuovere l'elio evaporato durante il trasferimento. La pressione del separatore viene abbassato di pompaggio attraverso un capillare (c) avvolto intorno alla parte superiore del criostato; il flusso di elio freddo in questo capillare viene utilizzata per raffreddare i setti (d) e gli schermi di radiazione del dewar isolamento (OVC). Il campione è posto e polarizzata nello spazio campione. Lo spazio campione è collegato al separatore attraverso un altro capillare (e), avvolto intorno alla coda dell'inserto criostato principale. Questo capillare può essere aperto o chiuso tramite una valvola a spillo azionato manualmente dall'esterno.

Per ottenere la bassa temperatura usato per il pr DNPocess, l'elio liquido devono essere raccolti nello spazio campione criostato e la sua pressione abbassata alla gamma mbar. Le operazioni necessarie per il funzionamento criostato vengono eseguite tramite un sistema di pompaggio piuttosto complesso, con tre serie di pompe, monitorati e gestiti in diversi punti con strumenti elettronici e elettromeccanici (Figura 2C). Il criostato OVC deve essere pompata ad alto vuoto dal primo sistema di pompaggio. Questo sistema è composto da una pompa turbomolecolare sostenuto da una pompa rotativa (a). L'elio liquido viene trasferito dal dewar di stoccaggio (b) attraverso la linea di ingresso trasferimento criostato al separatore criostato. Il separatore ha una uscita collegata alla seconda serie di pompaggio. Questo insieme è composto da una pompa a membrana / hr 35 m ³ (c). Questa linea permette di rimuovere il gas elio bollito durante il trasferimento dal dewar e durante il raffreddamento separatore. L'elio liquido raccolto nel separatore può essere trasferita allo spazio campione attraverso il tappotubi Illary descritti sopra. Per trasferire elio liquido dal separatore allo spazio campione e successivamente abbassare la pressione spazio campione a mbar gamma, un terzo sistema di pompaggio composto da 250 m ³ / hr Roots pompa sostenuto da una / hr pompa rotativa 65 m ³ (d) è collegato al criostato attraverso una valvola a farfalla manuale (e).

Tutte le operazioni del sistema a vuoto sono controllati e regolati da un dispositivo elettropneumatico misura (f). Tale dispositivo controlla connessioni di linea di vuoto tra il separatore criostato (g) e lo spazio campione (h) punti, il secondo sistemi di pompaggio / terzi (c, d), una bottiglia di elio compresso (i) e l'esterno. La comunicazione tra (f) e l'esterno passa attraverso una valvola unidirezionale (j). Il dispositivo elettro-pneumatico (f) nonché tutti i parametri di sistema e l'hardware di dissoluzione sono controllati ed azionati da un dispositivo elettronico USB interfacciato misura con un comune PC. Infine tutto il sistema, attraverso l'elettronicadispositivo, è gestito da un software standalone su misura (Figura 2D) in cui le operazioni rilevanti vengono lanciate attraverso un'interfaccia utilizzando i tasti software.

Per gestire il campione e misurare NMR segnale accumulo allo stato solido sono utilizzati una serie di inserti (Figura 3A). Per preparare il criostato per la polarizzazione, posizionare l'inserto campione principale (a), nel criostato. L'inserto campione principale è provvisto di una bobina NMR (b) collocato all'interno di una cavità a microonde dorato overmoded. Pre-freeze substrato contenente soluzione da polarizzato (soluzione polarizzante) alla temperatura dell'azoto liquido in un contenitore idoneo campione e collocarlo nella parte inferiore fine del portacampioni vetroresina (c). Far scorrere il supporto del campione nella inserto campione principale per raggiungere la isocentro magnete. Inserire la guida d'onda placcato in oro (d) nel supporto del campione. La guida d'onda permette microonde generato da una sorgente di microonde esterna viaggiare con perdite minime to il campione.

Il software su misura per la gestione del criostato gestisce automaticamente, dopo aver fatto clic sul pulsante corrispondente interfaccia, diverse operazioni come cooldown (la temperatura criostato si abbassa vicino alla temperatura dell'elio liquido), riempiendo (criostato è riempito con elio liquido ad un livello predeterminato ), un ulteriore passaggio di raffreddamento a T ≈ 1 K (bagno di elio liquido viene pompato per raggiungere la temperatura più bassa possibile), pressurizzazione (criostato è pressurizzato pressione leggermente superiore camera al P = 10-30 mbar per consentire l'apertura criostato senza rischi di contaminazione del criostato aereo) e dissoluzione (procedura automatica per sciogliere il campione DNP e trasferire la soluzione risultante iperpolarizzato al sito di misura, cioè, lo spettrometro NMR).

La polarizzazione viene eseguito irradiando il campione con microonde a 94 GHz (in un campo di polarizzazione B ₀ T _DNP, dove T _DNP è il tempo di polarizzazione accumulo. T _DNP è dello stesso ordine di grandezza del tempo di rilassamento longitudinale dei nuclei bersaglio a stato solido al campo data e temperatura. In tutti gli esperimenti il campione è stato polarizzato per più di 5 T _DNP.

Alla fine del tempo di polarizzazione, il campione deve essere sciolto in una soluzione RT per essere utilizzato per la misurazione dell'attività enzimatica. Durante il processo di dissoluzione, 5 ml di surriscaldato D ₂ O dalla caldaia dell'inserto di dissoluzione (Figura 3B) sono spinte da gas elio compresso (P = 6-8 bar) per raggiungere il campione DNP-enhanced e farla sciogliere. La soluzione hyperpolarized risultante viene inserito l'inserto di dissoluzione del gas elio compresso attraverso l'uscita inserto di dissoluzione (Figura 3C-b 23 Il tempo necessario per il trasferimento del campione dal polarizzatore DNP al sito spettrometro NMR è di circa 3 sec.

Il processo di dissoluzione viene effettuata usando un inserto di dissoluzione (Figura 3B). L'inserto di dissoluzione è composto da un componente elettronico-pneumatico (a), un bastone in fibra di carbonio (b) contenente tubi di collegamento tra caldaia nel gruppo pneumatico e l'armadietto contenitore del campione (c), che consente l'accoppiamento a tenuta con il campione contenitore e indietro alla presa. Il gruppo elettro-pneumatico (Figura 3C) è utilizzato per produrre e guidare surriscaldato D _{2 O} attraverso il bastone fibra di carbonio per il contenitore del campione e poi estrarre la soluzione iperpolarizzato dal criostato. Il gruppo elettro-pneumatico è composto di valvole pneumatiche (a) che controllano i collegamenti tra il coelio mpressed (P = 6-8 bar) linea (b), la caldaia (c) se il D ₂ O viene iniettato attraverso la valvola (d), e l'uscita (e) attraverso il bastone in fibra di carbonio (f). Il sistema è completato da un G pressione, un termometro e un filo resistivo riscaldamento in caldaia (c), un trigger (h) e una scatola di connessione (i) usato per interfacciare il sistema con il dispositivo di gestione elettronica.

Il criostato DNP e lo spettrometro NMR sono collegati da una linea di trasferimento, cioè, un tubo in PTFE di 2 mm di diametro interno all'interno del quale la soluzione iperpolarizzato viene spinto a elio in pressione (P = 6-8 bar) quando la dissoluzione viene attivata.

La sequenza di dissoluzione è composto dai seguenti operazioni: nei primi 300 msec, surriscaldato D ₂ O viene spinto al contenitore del campione per sciogliere e dissolvere la soluzione congelata iperpolarizzato. Successivamente, la soluzione iperpolarizzato viene estratta dal criostato per mezzo di prespressurizzate (P = 6-8 bar) gas elio e spinto attraverso il tubo in PTFE di diametro interno di 2 mm (Figura 3C-e) al sito di misura in cui l'iniezione viene eseguita con una delle procedure descritte nella Fase 6.2.1 o Passo 6.2 .2.

Il secondo componente della dissoluzione configurazione DNP NMR è spettrometro NMR. Nella configurazione descritta, lo spettrometro NMR opera ad un campo B ₀ = 11.7 Tesla. Una sonda NMR 5 millimetri è utilizzato per misurare il segnale iperpolarizzato dopo la dissoluzione. Lo spettrometro NMR è gestito tramite la console NMR, utilizzati sia per a stato solido e allo stato liquido misure NMR, ed il software XWinNMR ditta fornito. Una misura tipica è composta da un impulso rigido basso flip angle (sia tarato, per liquidstate o non calibrata, per misure a stato solido) seguita da acquisizioni del segnale.

Le misurazioni del segnale di polarizzazione termica allo stato solido e si DNP-derivatosegnal accumulo vengono eseguite usando la bobina misura ¹³ C al sito del polarizzatore DNP (Figura 3ab) accoppiato allo spettrometro NMR. In questa particolare situazione lo spettrometro NMR non effettua il bloccaggio del segnale. Quando le misurazioni a stato solido sono svolte, al fine di evitare perturbazioni significative alla polarizzazione, l'intervallo di tempo tra le acquisizioni dovrebbe essere abbastanza lungo, circa più di 0,5 T _DNP.

L'enhancement a stato solido è definito come dove è il segnale iperpolarizzato (ottenuto nel passaggio 3.3) e è il segnale a stato solido (ottenuto in equilibrio termico alla temperatura dell'elio liquido pompato nel passo 3.2) (Figura 4A). Questo parametro Defines la polarizzazione massima disponibile per esperimenti NMR, prima inevitabili perdite durante il trasferimento della soluzione iperpolarizzato. La misura viene eseguita con una semplice sequenza di impulsi-acquisiscono utilizzando un basso medaglia impulso angolo non calibrato. calibrazione Pulse è comunemente saltato per le misurazioni stato solido.

Una procedura analoga può essere utilizzata per determinare il potenziamento del segnale iperpolarizzato nello stato liquido. In questo caso, il campione posto nel tubo spettrometrico prima dell'iniezione (passo 6.2) è composto da 500 ml di D ₂ O. Dopo la dissoluzione e iniezione, ci sono due parametri importanti da monitorare. Il primo è il miglioramento iperpolarizzato nel sito spettrometro NMR, (Figura 4B), dove è il segnale subito dopo l'iniezione del iper soluzione polarizzata (ottenuta nel passo 7.1) e è il segnale di polarizzazione termica (ottenuto nel passo 7.2). Il secondo è il tempo di rilassamento longitudinale, T ₁ (Figura 4B, riquadro), associato con il substrato ed ogni prodotto metabolico (ottenuto da segnali esponenziali montaggio ottenuti nel passo 7.1). Questi due parametri definiscono la concentrazione minima del substrato necessaria per ottenere un rapporto sufficiente segnale-rumore (SNR) e la finestra di tempo disponibile per la misura delle trasformazioni metaboliche. Il rapporto tra la polarizzazione a stato solido e polarizzazione liquidstate dà una stima delle perdite dovute alla polarizzazione relax durante il trasferimento soluzione iperpolarizzato. Un valoreation12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "/> dovrebbe essere osservata in assenza di perdite di rilassamento.

Protocol

NOTA: Tutte le analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software commerciale.

1. Preparare la soluzione polarizzante

1. Preparare 2 ml di piruvato di sodio 1,12 M ¹³ C-marcato (Na ⁺ [CH ₃ COO -CO- ^{13] -,} substrato) soluzione drogato con 33 mM di TEMPOL radicale (4-idrossi-2,2,6,6 tetrametilpiperidin-1-oxyl, agente polarizzante) ⁴ a 2: 1 d _{2 O} / d ₆ -etanolo ^per 13 C osservazioni. ATTENZIONE: Precauzioni d'uso devono essere prese a causa della natura infiammabile del d ₆ -etanolo.
2. Verificare che la concentrazione radicale è ottimale in termini di polarizzazione realizzato.
   1. Cambiare leggermente la concentrazione radicale della soluzione al punto 1.1 (ad esempio, a 30 mM o 35 mM).
   2. Determinare iterativamente la valorizzazione a stato solido (vedi punto 3) e trovare la concentrazione radicale che porta alla valorizzazione massima.

2. Polarizatione

1. Abbassare la temperatura criostato DNP attraverso la procedura di ricarica. Fare clic sul pulsante 'Cooldown' sull'interfaccia software criostato (Figura 2D).
2. Raccogliere elio liquido nel criostato DNP attraverso la procedura di riempimento. Fare clic sul pulsante 'riempimento' sull'interfaccia software criostato (Figura 2D).
3. Mettere 300 microlitri della soluzione polarizzante ottimizzata dal punto 1.1 nel contenitore esempio fornito con il polarizzatore DNP. Congelare il contenitore del campione con il campione all'interno immergendolo delicatamente in un bagno di azoto liquido.
4. Eliminare l'azoto liquido che può essere presente nel contenitore del campione dopo la procedura di congelamento (Passo 2.3) estraendo il contenitore del campione dal bagno azoto liquido e ruotandolo capovolto.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ottenere una dissoluzione completa del campione (vedi punto 5).
5. Inserire il campione nel criostato.
   NOTA: Questo Step, composto dai seguenti sotto-fase, deve essere eseguita rapidamente (cioè, in meno di 10-20 sec) per evitare che il campione dalla fusione.
   1. Inserire il contenitore del campione nel supporto del campione. Inserire il supporto del campione nell'inserto criostato principale. Inserire la guida d'onda microonde nel supporto del campione.
6. Abbassare la temperatura del criostato avviando la procedura di 1 K raffreddamento. Fare clic sul pulsante '1K Cooling' sull'interfaccia software criostato (Figura 2D).
7. Accendere la sorgente di microonde acceso e irradiare il campione. Fare clic sul pulsante 'MW-ON' sull'interfaccia software criostato (Figura 2D).

3. a stato solido NMR Misure

1. Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento console NMR dalla bobina spettrometro ruotando il connettore in senso antiorario di 90 ° e tirandolo. Collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale del criostatobobina di NMR. Inserire il connettore maschio del cavo di console NMR nel connettore femmina della bobina criostato NMR, prestando attenzione al perno di orientamento; spinga saldamente e ruotare il connettore in senso orario di 90 °.
2. Misurare il segnale termico NMR nello stato solido al sito criostato utilizzando una semplice sequenza di impulsi-acquisiscono con un-calibrato bassi impulsi di flip-angolari ripetute ad intervalli di T = 5 min. Dopo aver impostato la misura, scrivere nella riga di comando del software 'ZG' e premere il tasto della tastiera 'Invio'. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli sul funzionamento dello spettrometro e la configurazione di misurazione.
3. Misurare il segnale NMR DNP-enhanced. Ripetere le operazioni di passaggio 3.2 dopo l'inizio del processo di DNP come descritto nella Sezione 2.
4. Scollegare il cavo coassiale canale di rilevamento console NMR dalla bobina NMR criostato ruotando il connettore in senso antiorario di 90 ° e tirandolo. Collegare il cavo coassiale del detecanale ction al connettore coassiale della bobina spettrometro. Inserire il connettore maschio del cavo console NMR nel connettore femmina della bobina spettrometro, prestando attenzione al perno di orientamento; spinga saldamente e ruotare il connettore in senso orario di 90 °.

4. Ottimizzare l'omogeneità del Main Magnete Field ( 'spessoramento')

1. Posizionare nello spettrometro una provetta contenente 500 ml di miscela di prodotti in esperimenti precedenti (cioè dopo passo 6.2).
2. Eseguire spettrometro NMR shimming variando la corrente nelle bobine di gradiente shimming ricerca della massima 'bloccare' segnale di deuterio. Selezionare la bobina spessoramento relativo premendo il pulsante corrispondente sulla console NMR.
   1. Ruotare la manopola sulla consolle NMR per determinare la direzione di rotazione che aumenta il segnale di blocco. Continuare a ruotare fino a quando il segnale raggiunge un massimo. Selezionare un'altra bobina shimming e ripetere l'ONU massimizzazionefino un massimo locale per tutte le bobine spessoramento si trova. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli. Al termine, rimuovere il campione usato per la chiusura.

5. Scioglimento

1. Inserire 5 ml di D ₂ O nella caldaia inserto dissoluzione. Pressurizzare e riscaldare il D ₂ O mediante il filo resistivo fino al raggiungimento T ≈ 180-200 ° C. Fare clic sul pulsante 'Preparare Heater' sull'interfaccia software criostato (Figura 2D).
2. Dopo il completamento della procedura di esempio di polarizzazione (per esempio dopo 3 T _DNP), pressurizzare criostato leggermente sopra pressione ambiente. Fare clic sul pulsante 'SS' Operazioni sull'interfaccia software criostato (Figura 2D). Rimuovere la guida microonde dall'inserto scioglimento.
3. Far scorrere l'inserto di dissoluzione (Figura 3B) verso il basso nel supporto del campione (Figura 3A-c). L'inserto di dissoluzione deve raggiungere il fondo del supporto del campione e deve essere inserito saldamente per effettuare una connessione a tenuta con il contenitore del campione per evitare D ₂ O fuoriuscita nel criostato.
4. Premere il grilletto hardware (Figura 3C-h) per avviare la sequenza di dissoluzione, una sequenza temporizzata predeterminato di operazioni di valvole pneumatiche.

6. iniezione

1. Prima posto dissoluzione un tubo NMR 5 mm contenente 500 microlitri del campione (ad esempio, D ₂ O per Misurazione al punto 7 o LDH soluzione dal punto 8 per misure di attività enzimatica nel passaggio 9), nel isocentro dello spettrometro 11.74 T NMR (vedi punto 4).
2. Subito dopo la dissoluzione (Fase 5), miscelare 500 ml di soluzione iperpolarizzato con il campione posizionato nello spettrometro NMR nel passaggio 6.1.
   1. Iniezione manuale: raccogliere il iperpolarizzatosoluzione al termine di un lungo tubo di trasferimento 2,5 m in un bicchiere di vetro posizionato vicino al magnete spettrometro NMR. iniettare manualmente 500 ml di soluzione hyperpolarized Nella provetta NMR attraverso un sistema capillare misura.
   2. iniezione automatica: prima del processo di dissoluzione, collegare il tubo di trasferimento ad un dispositivo di iniezione misura automatizzato che separa la soluzione iperpolarizzato dal gas elio utilizzato per il trasferimento. Il dispositivo fornisce automaticamente 500 ml di soluzione hyperpolarized nella provetta.

Misura NMR 7. allo stato liquido

1. Dopo la dissoluzione, misurare il segnale iperpolarizzato NMR dal campione nello spettrometro da una serie di 10 ° vibrazione angolo sequenze di impulsi acquisire distanziate di 1,5 sec per seguire la progressione della magnetizzazione del substrato (A) ed il prodotto (B). Dopo aver impostato la misura, scrivere nella riga di comando del software 'ZG' e premere il & #39; Invio 'tasto della tastiera. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli sul funzionamento dello spettrometro e la configurazione di misurazione.
2. Una volta che la magnetizzazione è completamente rilassato (cioè, dopo T = 10 T _1), misurare il segnale termico NMR da una serie di 90 ° flip angle impulsi acquisire sequenze intervallate da T = 3 T ₁ ≈ 3 min. Dopo aver impostato la misura, scrivere nella riga di comando del software 'ZG' e premere il tasto della tastiera 'Invio'. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli sul funzionamento dello spettrometro e la configurazione di misurazione.

8. Preparazione di enzimi contenenti campioni (specifico per la trasformazione piruvato-to-lattato)

1. Preparare il tampone di reazione con la seguente ricetta: 50 mM nicotinammide adenin dinucleotide (NADH), etilene-acido diaminetetraacetic 1 mM (EDTA), 0.1 mM ditiotreitolo (DTT) in tampone fosfato 0,1 M, pH =7.0.
2. Preparare una soluzione LDH muscolo coniglio 1 U / ml preparati di fresco in tampone di reazione con 20 mg / ml di albumina sierica bovina, BSA.
3. Mescolare 478 microlitri tampone di reazione (punto 8.1), 20 ml D _{2 O} per consentire la stabilizzazione campo spettrometro ( 'blocco') e la soluzione di LDH 2 ml (Passo 7.2).
4. Posizionare il volume della soluzione 500 microlitri preparata al punto 8.3 in un tubo NMR 5 mm e posizionare il tubo nello spettrometro NMR a 500 MHz.

9. Completare enzimatica di reazione Tasso Procedura di misurazione

1. Preparare il campione di polarizzazione (Fase 1) e polarizzare esso (Fase 2).
2. Eseguire shimming sullo spettrometro (Fase 4) e preparare il campione enzimatico (passo 8).
3. Eseguire la dissoluzione (Fase 5) e l'iniezione (Passaggio 6).
4. Misurare una serie di segnali dal campione iperpolarizzato con 10 ° vibrazione impulsi angolari acquisizioni distanziate di 1,5 sec (passo 7). Questo passaggio consente la misurazione della iperpolarizzatodecadimento del segnale e il segnale accumulo di metaboliti.

10. Raccordo

1. Per ogni spettro acquisito nel passo 9.4, identificare i picchi corrispondenti al substrato (A) e del prodotto (B) rispettivamente e integrarli (determinare l'area dei picchi). I picchi integrali danno i segnali corso del tempo di magnetizzazione (M _{(A, B)} (t), vedi equazione 2).
2. Utilizzando la soluzione dell'equazione (2), determina il valore di F = (R _A + k _eff ) Da una semplice misura esponenziale del segnale substrato integrato nel passo 10.1.
3. Utilizzando il valore F = (R _{A +} k _eff ) Determinato punto 10.2, determinare k _eff e R _B da una misura del segnale prodotto M _B (t) con la funzione ottenuta integrando l'equazione (2). Fare riferimento alla sezione risultati Rappresentante (Enzymatattività IC e le misurazioni metaboliche) per i dettagli sulla correzione di modellazione reazione, montaggio e RF.

Representative Results

guadagni segnale NMR utilizzando dissoluzione DNP
L'effetto DNP consiste nel trasferimento della elevata polarizzazione degli spin elettrone spaiato, tipicamente da molecole di radicali stabili, a nuclei NMR attivi, sotto irradiazione con microonde del campione. I radicali liberi più spesso utilizzati sono TAM (OXO63) e TEMPOL. ⁴ procedure di polarizzazione utilizzando TEMPOL possono essere ottimizzate da 'polarizzazione incrociata'. ²⁵

Ottimizzando la concentrazione del radicale stabile per ottenere la polarizzazione nucleare massima allo stato solido è cruciale per il successo della tecnica. La concentrazione ottimale TEMPOL è risultato essere di 33 mm nelle condizioni sperimentali di questo studio. Questa polarizzazione del substrato scelto è sufficiente seguire la sua conversione enzimatica in tempo reale.

Il campo magnetico della polarizer installato a Paris Descartes è B ₀ = 3.35 T ed i componenti di questo sistema sono state descritte in precedenza (figure 1 - 3). Il design criostato garantisce che la posizione campione finale coincide con all'isocentro magnete. Il campo magnetico del polarizzatore era rampa e spessorato utilizzando le bobine superconduttori shim solo, con criostato a posto. Il protone finale line-larghezza di un campione di acqua 1 x 0,5 x 0,5 cm è stato 23 KHz. abbiamo valutato e per [1 ¹³ C] piruvato. Per fare ciò, è necessario prima di determinare il segnale ¹³ C DNP-enhanced allo stato solido al sito polarizzatore prima della dissoluzione (Figura 4A). Dopo lo scioglimento, abbiamo misurato il [1-13 C] segnale hyperpolarized piruvato e il suo decadimento nel sito spettrometro. Il segnale stato liquido è stato misurato su una dissoluzione di prova usando 500 ml di D _{2 O} come campione nello spettrometro NMR. Questo ci ha permesso di determinare la a stato solido DNP miglioramento (Figura 4B, nel riquadro), il liquido allo stato di livello di polarizzazione NMR (Figura 4B) e le perdite di polarizzazione durante il trasferimento. Il rapporto tra i segnali misurata al punto 3.3 e punto 3.2 definiscono la valorizzazione a stato solido, . Il rapporto tra il primo segnale misurato nel passo 7.1 e il segnale dal punto 7.2 definisce la valorizzazione iperpolarizzato allo stato liquido, .

I dati di Fase 3, summarized in Figura 4A e Figura 4A (riquadro), mostrano che la tecnica permette di polarizzare ¹³ C in [1- ¹³ C] piruvato fino a = 22 ± 5, corrispondente ad una polarizzazione ¹³ C = 1.5 ± 0.3%.

Questo livello di polarizzazione è più di mille volte la polarizzazione termica carbonio in condizioni MRS comuni (ad esempio, 11.74 T e 300 K). I dati di Fase 7, riassunti nella figura 4B e Figura 4B (nel riquadro), consentono di determinare lo stato liquido ¹³ C iperpolarizzazione di [1- ¹³ C] piruvato, = 1 ± 0,2%. Il miglioramento ottenuto allo stato solido per piruvato erasufficiente ai fini dell'esperimento, se miglioramenti maggiori sono stati dimostrati mediante radicali diversi. ^{5 Il tempo} dati del corso adattano dal punto 7.1 dà una misura della costante di tempo di rilassamento. Il tempo di rilassamento longitudinale piruvato nella miscela composta da 500 microlitri DNP migliorata soluzione e 500 microlitri D ₂ O, era T ₁ = 75 ± 5 sec dopo la correzione rf (vedi equazione (3)).

L'attività enzimatica e misurazioni metaboliche
Dissoluzione rilevamento DNP NMR ^del 13 substrato C-marcato (A) può essere utilizzata per seguire la dinamica di conversione enzimatica in tempo reale e osservare la formazione di prodotto (B):

Subito dopo l'iniezione del substrato iperpolarizzato (A),il segnale di prodotto (B) è nullo. Poi, la conversione enzimatica (1) inizia a produrre (B). La magnetizzazione ^dei 13 C nuclei non è influenzata dai diversi spostamenti chimici e la modifica chimica delle molecole. Tuttavia, il nuovo ambiente può portare a differenti velocità di rilassamento longitudinale per il ¹³ C in B. Il corso dell'articolo Tempo segnale può essere qualitativamente diviso in tre fasi: all'inizio, la conversione enzimatica trasformare A in B produce un aumento del segnale B; dopo un certo tempo, dipende dalle condizioni sperimentali, le perdite dovute alla magnetizzazione rilassamento, bilanciare questo aumento e il segnale di B raggiunge un massimo; infine, in tempi più lunghi, il segnale B decade causa di rilassamento longitudinale. Nell'ipotesi di saturazione dell'enzima, trascurando indietro conversione e tenendo conto rilassamento magnetico, la magnetizzazione delle due specie molecolari (A e B) durante la conversione enzimatica può essere descritto da un couPLED sistema di equazioni differenziali: ²²

dove M _{(A, B)} (t) sono magnetizzazione di specie molecolari A e B rispettivamente, k _eff è la costante di velocità di conversione efficaci per il trasferimento del segnale mediante la reazione enzimatica e R _{(A, B)} sono le apparenti longitudinali costanti di velocità di rilassamento di nuclei osservati nella specie molecolare rispettivamente a e B, R _{(a, B)} conto sia per il rilassamento magnetizzazione longitudinale pura e l'effetto di rf pulsazione.:

dove T _{1, (A, B)} è il rilassamento longitudinalecostante di tempo del nucleo nell'ambiente molecolare locale di specie molecolari A e B, rispettivamente. θ e τ sono l'angolo rf vibrazione e il ritardo tra due acquisizioni del segnale rispettivamente.

In questo studio, substrato A e B erano prodotto [1- ¹³ C] piruvato e [1- ¹³ C] lattato, rispettivamente, e lo scopo era di misurare [1- ¹³ C] produzione di lattato dalla LDH in condizioni in cui non (isotopicamente non marcato) lattato era presente nella soluzione all'inizio dell'esperimento. La misura consiste in una serie di ¹³ C spettri registrati con una semplice sequenza pulseacquire a T = 21 ° C. Un calibrato impulso angolo di 10 ° vibrazione è stato utilizzato per le eccitazioni sequenziali (Passo 9). Il ritardo tra due impulsi successivi era τ = 1.5 sec. La sequenza di acquisizione NMR stato avviato poche decine di secondi prima solut iperpolarizzatoiniezione di ioni. La concentrazione del substrato piruvato nella provetta del campione dopo l'iniezione era 25-35 mM. Al punto 10 del lattato di velocità di conversione piruvato ad una concentrazione di LDH di 10 ^-3 U / ml è stata misurata. Il segnale registrato dal lattato e piruvato misura bene il modello nell'equazione (2) (linea tratteggiata in figura 5) e resa k _eff = 0,9 ± 0,1 x 10 ^-3 sec ^-1 (Figura 5). Questo valore concorda con la velocità di reazione iniziale determinato dal [Lac] Rapporto / [Pyr] al tempo 0 sec (figura 5, nel riquadro).

Figura 1. Schema dell'apparato sperimentale. Il polarizzatore (sinistra) è costituito da una cavità a microonde (c) che si trova all'interno di un criostato (d) posto in un ampio foro 3,35 T magnete superconduttore. Una bobina NMR su misura (b) t circostanteegli campione (a) viene utilizzato per monitorare la polarizzazione di spin nucleare in situ. La temperatura del bagno di elio viene mantenuta a 1,12 ± 0,03 K mentre il campione è irradiato alla frequenza delle microonde ν _mw = 94 GHz. Il sistema consente la misurazione NMR da eseguire sul campione allo stato solido durante la polarizzazione. Il campione polarizzata viene sciolto in acqua surriscaldata e spinto con gas elio compressa attraverso la linea di trasferimento nella provetta precedentemente posizionato all'interno di uno spettrometro NMR adiacente (a destra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Criostato e del sistema del vuoto schemi. (A) Dewar isolamento criostato; (B) cry stesso organismo inserto principale; (C) le connessioni del sistema del vuoto; (D) screenshot dell'interfaccia software di gestione con i tasti utilizzati per eseguire operazioni specifiche descritte nella Fase 2 e Fase 5 della sezione di protocollo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. La manipolazione del campione e la dissoluzione. (A) inserti gestione dei campioni; (B) inserto scioglimento; (C) dettaglio di connessioni elettro-pneumatico di inserimento dissoluzione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4.-stato solido di polarizzazione accumulo e segnali di dissoluzione DNP hyperpolarized segnale di decadimento.. (A) allo stato solido NMR polarizzazione del segnale accumulo di una soluzione piruvato 1,12 M di sodio [1- ¹³ C] durante una polarizzazione DNP (croci, dotato di una funzione esponenziale S (t) = A x exp (-t / T _b) + B della costante di tempo T _b = 270 sec) e relax (circoli, S (t) = A · exp (t / T _b) + B, T ^ss ₁ = 840 sec); (A, riquadro) confronto tra DNPenhanced e termicamente polarizzati (scalati fino 10 volte) segnali di magnetizzazione allo stato solido (ε _ss = 22 ± 5, corrispondente ad una polarizzazione stato solido P _SS = 1,5 ± 0,3%); (B) confronto tra il primo spettro registrata dopo la dissoluzione e l'averaspettro GED (scala fino a 100 volte) ottenuto dalla termicamente polarizzata ¹³ C gira a temperatura ambiente usando 1.024 transitori (ε = 1.000 ± 200). Il processo di dissoluzione preso 3,3 sec e l'iniezione automatica circa 2 sec con una perdita di segnale stimato del 40%. Per gli esperimenti eseguiti trasferimento del campione per iniezione manuale, ulteriori perdite a causa del ritardo di iniezione più lungo sono stati stimati al 30%; (B, riquadro) hyperpolarized segnale decadimento del piruvato dopo dissoluzione in assenza di LDH (T ₁ = 75 ± 5 sec). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. LDH attività e il metabolismo delle cellule tumorali risultati. Build-up di [1- ¹³ C] segnale lattato a causa di Enzymaconversione tic ad una concentrazione di LDH 10 ^-3 U / ml seguito da decadimento del segnale a causa di rilassamento longitudinale di ¹³ C magnetizzazione. La linea rossa mostra la forma con il modello descritto nell'equazione (2) comprendente gli effetti di rilassamento e di conversione enzimatica. (Riquadro) rapporto tra [1- ¹³ C] lattato e [1 ^-13 C] concentrazione piruvato con un'estrapolazione della velocità di reazione al tempo t = 0 (linea rossa). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I punti critici della dissoluzione dell'esperimento DNP NMR sono: (i) il livello della polarizzazione raggiunto per il substrato, che determina la concentrazione di prodotto minima necessaria per esperimenti nonché il numero di acquisizioni di segnali che possono essere eseguite e (ii) le durate della magnetizzazione, rispetto alla durata del trasferimento polarizzazione e siti di rilevamento e al tasso di substrato trasformazione. Il sistema di iniezione del setup DNP dissoluzione qui descritto consente il trasferimento del campione in meno di 3-4 sec. Anche se il trasferimento non era rapida come nel metodo proposto da S. Bowen e C. Hilty, ²⁶ perdite di polarizzazione per piruvato erano limitate a causa del rilassamento longitudinale moderata nel campo bassa. [1- ¹³ C] piruvato, con la sua lunga T nucleare carbossilico _1, permette la misurazione del flusso attraverso LDH a concentrazioni basse come 10 ^-3 U / ml.

il elevato rapporto segnale-rumore ottenuto usando dissoluzione DNP suggerisce che uno potrebbe essere sensibili anche inferiore [1- ¹³ C] concentrazioni piruvato, e più bassi tassi di conversione enzimatici. Il livello di polarizzazione realizzato permette più di 200 esperimenti con un significativo rapporto segnale-rumore da acquisire nello spettrometro NMR allo stato liquido utilizzando un basso angolo di vibrazione a = 10 °. Questo lascia spazio per l'ottimizzazione sia in termini di tempi di ripetizione e angoli a fogli mobili. Per l'accumulo di polarizzazione in stato solido alcune molecole polarizzano bene con alcuni agenti di polarizzazione (TEMPO, OXO63) ⁴ e altri no, per ragioni che non sono ancora pienamente compresi. Prove sperimentali sono l'unico modo per determinare se il passo polarizzazione è riuscita. Per migliorare il livello di polarizzazione, si può esplorare l'uso di diverse specie di radicali ^{4 e} l'applicazione di diverse tecniche basandosi su 'polarizzazione incrociata'. ²⁵

ontent "> Ulteriore ottimizzazione delle concentrazioni di radicali e substrato, nonché la composizione del solvente presente nel campione DNP è cercato di migliorare la polarizzazione. La tecnica è limitata a molecole in cui un nucleo o un gruppo di nuclei in grado di sostenere la polarizzazione dopo la dissoluzione può essere identificato. polarizzazione può essere sostenuta o come uno squilibrio tra autostati mono-nucleare in alti campi magnetici o in forma di LLS delocalizzata su due o nuclei più accoppiati. per la prima opzione, il nucleo della sonda deve essere distante da altri nuclei con alta rapporto giromagnetico, come protoni. Se tale posizione non si trova naturalmente, arricchimento in nuclei NMR attivi in ​​siti isolati nella molecola o la sostituzione di protoni nella zona di nuclei attivi da deutoni, per abbassare la resistenza dipolo magnetico, sono necessarie . per ottenere LLS, un'analisi teorica dei giunti magnetici all'interno di gruppi di nuclei possono essere effettuate ^27,28 per trovare mezzi ottimali per supppolarizzazione ort. Questa strategia è risultata efficace in piccole molecole, come gli amminoacidi ²⁹ e può essere applicato ad altre molecole coinvolte nei cicli metabolici di interesse. Per preservare meglio magnetizzazione durante l'esperimento, la combinazione di scioglimento DNP con eccitazione LLS promette di estendere l'intervallo di tempo di misura per altre reazioni enzimatiche. ²⁰

L'esperimento DNP-NMR qui descritto è adatto per la misura del metabolismo del piruvato in cellule tumorali. ^{6 La} misurazione in tempo reale dell'attività enzimatica mediante dissoluzione DNP rafforzata NMR può aiutare sforzi attuali nella diagnosi del cancro da DNP-enhanced MRI, già utilizzato nel clinica. ¹² La specificità molecolare di DNP-enhanced NMR lo rende un metodo di scelta per distinguere tra bersagli molecolari ed i prodotti delle loro trasformazioni. Futuri miglioramenti si concentreranno sulla valutazione di altri traccianti molecolari per metabolico trasformazioni ³⁰

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNP polarizer	Vanderklink s.a.r.l (Switzerland)	///	Cryostat and electronic equipment for sample polarization
Vacuum system components	Edwards vacuum (France)	Various	- turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components
DNP 3.35T Magnet	Bruker (France)
500 MHz NMR Spectrometer	Bruker (France)
Origin 8.0	OriginLab (US)		Data analysis software
Chemicals
SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C	Sigma Aldrich (France)	490709
ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D	Sigma Aldrich (France)	186414
4-Hydroxy-TEMPO 97%	Sigma Aldrich (France)	176141
Deuterium oxide	Sigma Aldrich (France)	151882
reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)	Sigma Aldrich (France)
ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich (France)
dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich (France)
phosphate buffer, pH = 7.0	Sigma Aldrich (France)
LDH enzyme in	Sigma Aldrich (France)	L-2500
bovine serum albumin, BSA	Sigma Aldrich (France)