Abstract
NMR tabanlı araştırmaların ana sınırlama düşük hassasiyettir. Bu nedenle metabolik dönüşümlerin gerçek zamanlı NMR ölçümleri önlenmesi, uzun satın alma süreleri için ister. çözünme DNP aracılığıyla hiperpolarizasyon duyarlılığı parçası elektron-to-çekirdeğe dönüş polarizasyon transferi kaynaklanan büyük out-of-denge nükleer manyetizasyon sayesinde sorunları circumvents. elde edilen yüksek NMR sinyali, gerçek zamanlı olarak kimyasal reaksiyonların izlenmesi için de kullanılabilir. Hiperpolarize NMR olumsuz ilişkili gevşeme zamanı sabiti sipariş üzerine olumlu durumlarda, nükleer spin uzunlamasına gevşeme zamanı sabiti, T 1, ya da sipariş üzerine genellikle sinyal alımı için mevcut olan sınırlı zaman penceresi içinde bulunduğu birleştiğinde çekirdeklerin tekli-devlet, T LLS. endojen moleküller ve metabolik oranları hücresel alımı tümör gelişiminde ve ilaç cevabına gerekli bilgi sağlayabilir. Nuyanında bir çok önceki hiperpolarize NMR çalışmaları, in vivo enzimatik aktivitesini izlemek için bir metabolik alt-tabaka olarak piruvat alaka göstermiştir. Bu çalışma, özellikle hyperpolarized NMR laktat dehidrogenaz (LDH) varlığında piruvat-to-laktat dönüşüm oranı, enzimatik reaksiyonların çalışması için gerekli olan deney düzeneği ve yöntemleri ayrıntılı bir açıklama sağlar.
Introduction
Dinamik nükleer polarizasyon (DNP), 1,2 yani nükleer spin polarizasyon, 'yukarı' ve 'aşağı' Spin popülasyonları (p = arasındaki dengesizliği geliştirmek için tasarlanmış bir tekniktir [N ↑ - N ↓] / [N ↑ + N ↓]), ilk 1950 yılında tanıtıldı. Örneğin 13 ° C olarak nükleer spin tipik haliyle 1 K civarında bir ısıda ve biyolojik uygulamalarda bir atılım geldi 3.357 bir manyetik alan T. 3,4, uygun koşullarda, P = 10 -1 kadar polarize edilebilir bir faktör. düşük sıcaklıkta elde edilen yüksek nükleer polarizasyon seviyesini korurken süper ısıtılmış su içinde dondurulmuş polarize örnekleri çözündürülmesinden ibarettir erime DNP gelişimi 2000 erken 5 sıvı hal NMR sinyal geliştirilmiştir 10 3 -10 4 ile karşılaştırıldığında ortakRT NMR koşulları termal olarak polarize. Fesih DNP bu nedenle 1 sn veya daha az bir zamansal çözünürlüğe sahip NMR ile izleme dinamikleri izin gerçek zamanlı olarak yerinde non-invaziv önlem biyokimyasal reaksiyon oranları için bir yol sağlar 6 -. 10 O da çok düşük konsantrasyonlarda analitlerin tespit etmek mümkün olmuştur 11.
non-invaziv moleküler görüntüleme yöntemlerinin arasında, hiperpolarize NMR aynı anda bir substrat ve gerçek zamanlı metabolik ürünlerini ölçmek sağlar tek tekniktir. Dağılma DNP metabolizması yerinde izlenmesi ile ilgili klinik MRG 12 ve en umut verici uygulamalara in vitro NMR arasında değişen çeşitli bilimsel alanlarda coşku ile karşılandı. 13,14 çözünme DNP ana sınırlama olduğunu, bu konuda bir süre sonra beş kez uzunlamasına gevşeme zamanı sabiti T 1 sırası, kutup gelişmişleştirilmesi kaybolur. Nispeten uzun bir T 1 sergileyen, nükleer spin taşıyan moleküller kullanımı gereklidir. Polarizasyon geliştirme zamana yayılma uzatmak için, uzun ömürlü devletler (LLS) olarak bilinen nükleer spin durumları, yavaş yavaş-rahatlatıcı, kullanılabilir 15 -. 17 LLS onların böylece, içi çift dipol-dipol etkileşimi duyarsız T LLS karakteristik gevşeme süresidir sabit. T 1 çok daha uzun dakika onlarca bir mıknatıslanma süresi 18 olabilir ve 1 saat kadar, bu nedenle elde edilebilir, 19,20 ve LLS manyetik rezonans spektroskopi hem de önerilmiştir (MRS) ve MR. 21
dikkatle hiperpolarize NMR ile enzimatik reaksiyon oranlarını incelemek için optimize edilmesi gereken başlıca noktalar şunlardır: (i) katı hal polarizasyon maksimize etmek ve (ii) den hyperpolarized çözümün transferi sırasında polarizasyon kaybını en aza indirmekNMR spektrometresi ile polarize. Bu makale enzimatik reaksiyonları incelemek için ısmarlama bir çözünme DNP cihaz ve enjeksiyon sisteminin adaptasyonu anlatır. Özellikleri ve kurulum performansı iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan hyperpolarized substrat [1- 13 C] pirüvat ile gösterilecektir. İkinci, birkaç dakika boyunca izleme reaksiyonları izin verir, ve onun merkezi rolü, bu seçim için başlıca nedenleri, ilk olarak, doğal olarak uzun 13C boyuna relaksasyon zamanı vardır (yüksek manyetik alanlar ve 293 K üzerindeki sıcaklıklarda T 1> 50 sn) çözünme DNP NMR ve geliştirilmiş özel bir enjeksiyon sistemi, laktat dehidrogenaz (LDH) tarafından katalize piruvat oksidasyonunu kullanarak kanser metabolizması. 13,14 etiketsiz laktat 9,22 bir başlangıç havuzu ya da eklenen herhangi bir etiketsiz laktat ile varlığında izlenebilir burada görüldüğü gibi. [1- 13C] laktat sinyal vi ölçülen gösterilmiştirhiperpolarize [1- 13C] piruvat enjeksiyonunun ardından (hücreler de dahil olmak üzere), VO bağlı pirüvat ve laktat arasındaki yerine laktat üretimine hızlı etiket değişimi esas olarak. 6
Biz burada LDH içeren bir NMR tüpü ama başlangıçta hiçbir laktat enjekte hiperpolarize [1- 13 C] piruvat gelen [1- 13 C] laktat gerçek zamanlı üretim sunuyoruz.
Sistem açıklaması
DNP polarize ve NMR spektrometresi: Bir çözünme DNP kurulumunda iki ana bölümden (Şekil 1) vardır. DNP polarize ana unsuru bir pompalanan helyum banyosunda yaklaşık 1 K numunenin soğutma Kriyostaz olduğunu. Kriyostat bir 3.35 T süper iletken mıknatıs yerleştirilmiş ve mıknatıs (Şekil 1) İzomerkez de polarize örnek olması için garanti bir geometriye sahiptir. kriyostat içinde, örnek, (a) bir polarizasyon B ölçmek için bir NMR bobini (B) ile çevrilidiruildup bir overmoded bir mikrodalga kavite (C) 'de ihtiva etmiştir. Bütün numune pompalanır helyum banyosuna (d) 'de, düşük sıcaklıkta tutulur ve dalga kılavuzu boyunca mikrodalgalar ile ışınlanır. Tüm sistem ısmarlama yazılımlar (Şekil 2B) tarafından yönetilmektedir.
Donanım ve DNP gerçekleştirmek için gerekli kriyojenik ekipman ve sonraki çözünme hala teknolojik meydan okumadır. Yeni bir DNP kriyostat 23,24 geliştirilen ve kriyojenik performanslarını belirlemek için test ve ardından operasyon sırasında hızlı soğuma, helyum tutma zamanı ve genel asgari helyum tüketimi için optimize edilmiştir.
kriyostat iki bölümden oluşmaktadır. Kriyostat ilk bölümü kuyruğu ya da örnek alanı (B) ve dış vakum odası (ovc), yüksek vakum ve yuva altında tutuldu: (a) yaklaşık olarak üst kısmında ayrılabilir yalıtım Dewar (Şekil 2A) olduğu radyasyon ekranlar (c). kriyostat ikinci bölümünde ana olduğunuSert (Şekil 2B), tüm içten akma düzenlemeleri yönetilir yalıtım dewar içine yerleştirilir. Transfer hattı (a) 'dan harici depolama Dewar gelen sıvı helyum, (b) ayırıcı içinde kondense birinci aşamasında, bir ara bölme kriyostat soğuk üst kısmı tutmak için ve buharlaştırılmıştır helyum çıkarmak için de kullanılmıştır nakil sırasında kullanılabilirler. Ayırıcı basıncı kriyostat üst kısmı etrafında sarılmış bir kılcal (c) ile pompalayarak indirilir; Bu kılcal soğuk helyum akış yalıtım Dewar (OVC) bölmeleri (d) ve radyasyon ekranları soğumasını kullanılır. Numune örnek uzayında yerleştirilir ve polarize edilir. Örnek alanı temel kriyostat ucun kuyruk sarılı bir kılcal (e) 'ayırıcı, bağlanır. Bu kılcal elle dışarıdan çalıştırılan bir iğne valf aracılığıyla açılabilir veya kapatılabilir.
DNP pr sırasında kullanılan düşük sıcaklık elde etmek içinkapsayabilecektir, sıvı helyum kriyostat örnek uzayında toplanan gerekmektedir ve basınç mbar aralığında indirdi. Kriyostat çalışması için gerekli işlemler pompa, izlenmesi ve elektronik ve elektro-mekanik araçların (Şekil 2C) ile farklı noktalarda işletilen üç setleri ile oldukça karmaşık bir pompalama sistemi ile yapılmaktadır. Kriyostat ovc birinci pompalama sistemi ile yüksek vakum pompalanması gerekmektedir. Bu sistem, bir döner pompa (a) ile desteklenen bir turbo-moleküler pompa oluşmaktadır. sıvı helyum Kriyostat ayırıcı kriyostat transfer hattı girişi boyunca depolama Dewar (b) aktarılır. Ayırıcı ikinci pompalama grubu bağlı bir çıkış bulunur. Bu set, bir 35 m3 / saat membran pompası (c) oluşmaktadır. Bu hat Dewar gelen ve ayırıcı soğutma sırasında transferi sırasında haşlanmış helyum gazı çıkarmadan sağlar. ayırıcı toplanan sıvı helyum daha sonra kap ile örnek uzay aktarılabilirIllary borular, yukarıda tarif edilen. 65 m 3 / saat döner pompa (d) tarafından desteklenen pompa aralığı, 250 m 3 / saat Roots oluşan üçüncü bir pompalama sistemi mbar örnek alan ve daha sonra alt örneklem uzayı basıncına ayırıcıdan gelen sıvı helyum aktarmak için manuel kelebek vana (e) 'kriyostat bağlanır.
Tüm vakum sistemi operasyonları kontrol ve bir elektro ısmarlama bir cihazın (f) tarafından düzenlenir. Bu cihaz, kriyostat ayırıcı (g) ve örnek alanı (h) çıkışları, ikinci / üçüncü pompa sistemleri (c, d), sıkıştırılmış bir helyum tankları (I) 'e ve dış arasındaki vakum hattı bağlantıları kontrol eder. (F) ve dış arasındaki iletişim, tek yönlü bir valf (j) geçer. elektro-pnömatik cihaz (f) yanı sıra tüm sistem parametreleri ve çözünme donanım ortak PC ile ısmarlama elektronik cihaz arayüz USB ile kontrol edilmekte ve işletilmektedir. Elektronik aracılığıyla nihayet bütün sistemi,Cihaz, ilgili işlemleri yazılım düğmelerini kullanarak bir arayüz üzerinden başlatılan ısmarlama bağımsız yazılım (Şekil 2B) tarafından yönetilmektedir.
Örnek yönetmek ve ekler bir dizi kullanılır katı hal (Şekil 3A) NMR sinyali birikmesini ölçmek için. polarizasyon Kriyostat hazırlamak için kriyostat içine ana numune insert (a) yerleştirin. Ana Örnek insert bir overmoded altın kaplamalı mikrodalga boşluğunun içine yerleştirilmiş bir NMR bobini (B) temin edilmektedir. Ön dondurma çözeltisi içeren substrat uygun bir örnek kapta sıvı azot sıcaklığında (polarize çözüm) polarize ve fiberglas numune tutucu (c) uç alt kısmına yerleştirin edilecek. mıknatıs İzomerkez ulaşmak için ana numune içine doğru numune tutucu kaydırın. Numune tutucu altın kaplama dalga kılavuzu (d) takın. dalga kılavuzu harici mikrodalga kaynağından üretilen mikrodalga asgari kayıpları t yolculuk yapmasına olanak veriyorörnek o.
Kriyostat yönetimi için ısmarlama yazılım, farklı işlemler bekleme süresi gibi, (kriyostat sıcaklığı sıvı helyum sıcaklığına yakın indirilir) kriyostat önceden belirlenmiş bir düzeye sıvı helyum ile doldurulur (dolum tekabül eden arayüz butonuna tıklayarak üzerine, otomatik olarak kolları ), (sıvı helyum banyosu mümkün olan en düşük sıcaklık elde etmek için pompalanır) T ≈ 1 K basınçlandırma soğutma ek bir adım (kriyostat 10-30 mbar riskleri olmaksızın kriyostat açılmasına izin verecek = P oda basıncının biraz üzerinde basınç uygulanır hava ile kriyostat kontaminasyon) ve çözünme (DNP örnek çözülür ve ölçüm sitesi, yani NMR spektrometre) elde edilen hyperpolarized çözüm aktarmak için otomatik prosedür.
Polarizasyon polarize alan B 0 (94 GHz mikrodalga ile örnek ışınlanması yapılır T DNP polarizasyon birikimi zamanıdır. T DNP belirli bir alanda ve sıcaklığında katı halde hedef çekirdeklerin boyuna relaksasyon zamanı aynı büyüklük düzenin 3 T DNP, sonra polarize sayılır. Tüm deneylerde numune fazla 5 T DNP için polarize edilmiştir.
polarizasyon süresi sonunda, örnek enzimatik aktivite ölçümü için kullanılmak üzere bir RT çözeltisi içinde çözülmüş olması gerekir. Çözünme işlemi sırasında, çözünme insert (Şekil 3B) kazandan kızgın D 2 O 5 ml DNP geliştirilmiş örnek ulaşmak ve bunu eritmek için sıkıştırılmış helyum gazı (p = 6-8 bar) tarafından itilir. Elde edilen hyperpolarized çözüm çözünme eklemek çıkış ağzından, sıkıştırılmış helyum gazı ile çözünme ekleme dışarı itilir (Şekil 3C-b 23 300 msn yaklaşık 3 sn.
Çözünme süreci erime elemanını (Şekil 3B) kullanılarak gerçekleştirilir. çözünme insert bir elektronik-pnömatik montaj oluşur: (a), numune ile sızdırmaz bağlantıyı sağlayan pnömatik montaj kazan ve numune kabı soyunma (c) arasındaki bağlantı tüpleri içeren bir karbon fiber çubuk (b) konteyner ve geri prize dışarı. Elektro-pnömatik düzeneği (Şekil 3C) üretimi ve örnek kabına karbon fiber çubuk boyunca ısıtılmış D 2 O sürücü ve kriyostat gelen hiperpolarize çözeltinin özümlenmesi için kullanılır. elektro-pnömatik montaj co arasındaki bağlantıları kontrol pnömatik valfler (a) oluşmaktadırmpressed helyum (p = 6-8 bar) hattı (B), karbon fiber çubuk yoluyla D 2 O vana (d) 'enjekte edilir ısıtıcısı (c) ve çıkış (e) (f)'. Sistem bir basınç G, bir termometre ve ısıtıcısı (c) 'de bir ısıtma direnç teli, bir tetikleyici (h) ve bir bağlantı kutusu (I)' in elektronik yönetim cihazı ile, sistem arayüzü için kullanılan ile tamamlanmaktadır.
DNP kriyostat ve NMR spektrometresi, bir transfer hattı, yani erime tetiklenir hiperpolarize çözelti, baskı altına alınan helyum ile itilir içindeki 2 mm, iç çapı (p = 6-8 bar) bir PTFE tüp ile bağlanmıştır.
Çözünme sekansı aşağıdaki işlemlerden oluşmaktadır: ilk 300 msn'de, süper ısıtılmış D 2 O hiperpolarize dondurulmuş çözelti eritilmesi ve eritmek için numune kabına doğru itilir. Daha sonra, hyperpolarized çözüm pres ortalamasından ile kriyostat elde edilirsurized (p = 6-8 bar) enjeksiyonu Aşama anlatılan prosedürlerin biri ile yapılır ölçüm sitesine helyum gazı ve 2 mm iç çap PTFE borusu içinden itilir (Şekil 3C-E) 6.2.1 veya 6.2 Adım 0,2.
çözünme DNP NMR kurulum ikinci bileşeni NMR spektrometre olduğunu. Burada tarif edilen kurulumunda, NMR spektrometresi alan B 0 = 11.7 Tesla çalışır. 5 mm'lik NMR prob çözünmesinden sonra hiperpolarize sinyalini ölçmek için kullanılır. NMR spektrometre solid-state ve sıvı-devlet hem de NMR ölçümleri için kullanılan, NMR konsolu aracılığıyla işletilen ve firma tarafından sağlanan yazılım XWINNMR edilmektedir. Tipik bir ölçüm düşük çevirme açısı sert darbe oluşan sinyal satın almalar takip (ya liquidstate veya un kalibre solid-state ölçümleri için, için, kalibre).
katı hal termal polarizasyon sinyali ve DNP türevi si ölçümlerignal birikmesi NMR spektrometresi bağlanmış DNP polarize (Şekil 3Ab) yerinde ölçüye 13C bobini kullanılarak gerçekleştirilir. Bu özel durumda NMR spektrometre sinyal kilitleme yapmaz. Solid-state ölçümleri yapılırken, polarizasyon önemli tedirginlikler önlemek için, satın almalar arasındaki zaman gecikmesi kabaca uzun 0.5 T DNP daha uzun yeterli olmalıdır.
solid-state geliştirme olarak tanımlanmaktadır 
nerede 
hyperpolarized sinyali (Aşama 3.3'de elde edilmiş) ve 
(Kademe 3.2 pompalanan sıvı helyum sıcaklıkta, dengede elde edilmiş), katı durum sinyali (Şekil 4A) 'dir. Bu parametre dhyperpolarized çözümün transferi sırasında kaçınılmaz kayıplar öncesinde NMR deneyleri için kullanılabilir maksimum kutuplaşmayı, efines. Ölçüm un kalibre düşük çevirme açısı darbe kullanarak basit bir darbe acquire dizisi ile yapılır. Darbe kalibrasyonu yaygın katı hal ölçümler için atlanır.
Benzer bir usul, sıvı halde hiperpolarize sinyal artışı belirlemek için kullanılabilir. Bu durumda, enjeksiyondan önce spektrometresi tüpüne yerleştirilmiştir örneği (Aşama 6.2), D 2 O 500 ul oluşmaktadır çözünme ve enjeksiyondan sonra izlemek için iki önemli parametre vardır. İlk, NMR spektrometresi yerinde hyperpolarized geliştirmesidir 
(Şekil 4B), 
Sinyal sadece hiper enjeksiyonundan sonra ise (Adım 7.1 elde edilen) polarize çözüm ve 
Termal polarizasyon sinyali (Adım 7.2 elde edilen) 'dir. İkinci alt-tabaka ve (Kademe 7.1 'de elde edilen üstel bağlantı sinyalleri ile elde edilir), her metabolik bir ürünü ile bağlantılı boyuna gevşeme süresi, T 1 (Şekil 4B, ek) vardır. Bu iki parametre, yeterli bir sinyal-gürültü oranı (SNR), ve metabolik dönüşümler ölçülmesi için uygun bir zaman penceresini elde etmek için gerekli en az alt-tabaka konsantrasyonu tanımlamaktadır. solid-state kutuplaşma arasındaki oran 
ve liquidstate kutuplaşma 
hyperpolarized çözüm transferi sırasında nedeniyle gevşeme polarizasyon zararların tahminini verir. Bir değeration12 "src =" / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg "width =" 80 "/> gevşeme kayıpları yokluğunda dikkat edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bütün veriler analiz ticari yazılımı kullanılarak yapıldı.
1. Polarize Çözüm hazırlayın
- Bir 1.12 M, 13C-etiketli sodyum piruvat 2 mi hazırlama (Na + [CH3-CO- 13 COO-] -, alt-tabaka) çözeltisi kökü TEMPOL 33 mM katkılı (4-hidroksi-2,2,6,6- tetrametilpiperidin-1-oksil, polarize madde) 4, 2: 1 D 2 O / D 13 C gözlemler için 6 -etanol. DİKKAT: Kullanım önlemleri nedeniyle d6 -etanol yanıcı doğası alınmalıdır.
- Radikal konsantrasyon elde kutuplaşma açısından en uygun olduğundan emin olun.
- (30 mM veya 35 mM için, örneğin) biraz noktasında 1.1 çözeltinin radikal konsantrasyonunu değiştirin.
- iteratif solid-state geliştirme belirleme (Adım 3) ve maksimum arttırılmasına neden radikal konsantrasyonunu bulmak.
2. Polarizatiyon
- bekleme süresi usulü ile DNP kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında 'Cooldown' butonuna tıklayın.
- doldurma usulü ile DNP kriyostat sıvı helyum toplayın. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında 'Dolum' butonuna tıklayın.
- DNP polarize ile sağlanan örnek kapta Adım 1.1 optimize kutuplaştırıcı çözeltisi 300 ul yerleştirin. yumuşak bir sıvı azot banyosu içine daldırılmasıyla içindeki numune ile numune muhafazası dondurun.
- su azot banyosunda örnek kabın açılan ve ters çevirerek dondurma prosedürü (adım 2.3) sonra örnek kap içinde mevcut olabilir, sıvı azot ortadan kaldırır.
NOT: Bu adım, örnek tam bir çözünme elde etmek için çok önemli olan (adım 5). - kriyostat içine örnek yerleştirin.
NOT: Bu StEP aşağıdaki alt adımı oluşan (yani, en az 10-20 sn) erime numunenin önlemek için hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.- numune tutucu örnek kabı yerleştirin. Ana Kriyostat insert örnek tutucu yerleştirin. numune tutucuya mikrodalga dalga kılavuzu yerleştirin.
- 1 K soğutma işlemini başlatarak kriyostat sıcaklığını düşürün. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında '1K Soğutma' düğmesini tıklayın.
- mikrodalga kaynağını açın ve örnek ışın tedavisi. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında 'MW-ON "butonuna tıklayın.
3. Solid-state NMR Ölçümleri
- 90 ° Konnektörü saat yönünün tersine döner ve çekerek spektrometre bobininden NMR konsol algılama kanalı koaksiyel kablosunu çıkarın. kriyostat koaksiyel bağlantı algılama kanalının koaksiyel kablo takınNMR bobin. oryantasyon pin dikkat, kriyostat NMR bobin dişi konnektör NMR konsol kablosunun erkek konnektörü takın; sıkıca bastırın ve 90 ° konektör saat yönünde çevirin.
- T = 5 dakika aralıklarla tekrarlanan un kalibre düşük çevirme açısı darbeleri ile basit bir darbe Edinme sekansı kullanılarak kriyostat yerinde katı halde NMR ısı sinyali ölçer. ölçüm kurduktan sonra, yazılım 'ig' komut satırında yazmak ve 'Enter' klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun.
- DNP geliştirilmiş NMR sinyali ölçün. Bölüm 2'de açıklandığı gibi DNP süreci başlatıldıktan sonra adım 3.2 tekrarlayın işlemleri.
- 90 ° Konnektörü saat yönünün tersine döner ve çekerek kriyostat NMR bobininden NMR konsol algılama kanalı koaksiyel kablosunu çıkarın. deterjanları koaksiyel kablo takınspektrometre bobin koaksiyel konnektörüne ction kanalı. oryantasyon pin dikkat, spektrometre bobin dişi konnektör NMR konsol kablosunun erkek konnektörü takın; sıkıca bastırın ve 90 ° konektör saat yönünde çevirin.
4. Ana Mıknatıs Field ( 'terazi ayarına') 'in Homojenliğinde optimize
- Spektrometresi önceki deneyler (örneğin, Aşama 6.2) sonra üretilen karışımın 500 ul ihtiva eden bir tüp yerleştirin.
- maksimum arama layneri degrade bobinler akım değiştirerek NMR spektrometre shimming gerçekleştirmek döteryum sinyali 'kilit'. NMR konsolunda gelen düğmeye basarak ilgili layneri bobini seçin.
- Kilit sinyalini artırır dönüş yönünü belirlemek için NMR konsolda düğmeyi çevirin. Sinyal maksimum ulaşana kadar dönmeye devam eder. Başka layneri bobini seçin ve maksimizasyonu un tekrartüm shimming bobinler için yerel maksimum til bulunur. Daha fazla bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun. Sonunda, kilitleme için kullanılan numuneyi çıkar.
5. Fesih
- Çözünme insert kazandaki D 2 O 5 ml ekleyin. Basınç ile T ≈ 180-200 ° C ulaşana kadar dirençli tel ile D 2 O ısıtın. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında 'Isıtıcı hazırlayın' butonuna tıklayın.
- Örnek polarizasyon işlemin tamamlanmasından sonra, (örneğin, 3 T DNP sonra), oda basıncının biraz üzerinde Kriyostat basınç. Kriyostat yazılım arayüzü (Şekil 2B) hakkında 'SS operasyonların' düğmesini tıklayın. çözünme insert mikrodalga kılavuzunu çıkarın.
- Numune tutucu içine çözünme insert (Şekil 3B) kaydırın (Şekil 3A-c). Erime uç numune tutucusunun alt ulaşmak zorundadır ve kriyostat D 2 O sızmaması için, numune kabı ile sızdırmaz bir bağlantı kurmak için sıkı bir şekilde itilmesi gerekir.
- Çözünme sekansı, pnömatik valflar işlemleri, önceden belirlenmiş bir zaman ayarlı dizisini başlatmak için donanım tetik (Şekil 3C-H) basın.
6. Enjeksiyon
- 500 ul örneği içeren çözülme yeri 5 mm NMR tüpü, (örneğin, D 2 O için önce
11.74 T NMR spektrometresi İzomerkez Aşama 9 enzimatik aktivite ölçümleri için Adım 8'den Adım 7 veya LDH çözelti), ölçüm (Adım 4) bakın. - Sadece çözündürme (aşama 5), Adım 6.1 NMR spektrometresi yer numune ile hiperpolarize çözeltisi 500 ul karıştırın.
- Manuel Enjeksiyon: hiperpolarize toplamakNMR spektrometresi mıknatısa yakın yerleştirilmiş bir cam beher içinde, bir 2.5 m uzunluğunda bir transfer borusunun sonunda, çözelti. El ile özel yapılmış kılcal sistem içinden NMR tüpte hiperpolarize çözeltisi 500 ul enjekte edilir.
- Otomatik enjeksiyon: çözünme işleminden önce, transfer için kullanılan helyum gazı hyperpolarized çözüm ayıran otomatik ölçüye enjeksiyon cihazına transfer tüpü bağlayın. cihaz otomatik deney tüpüne hiperpolarize çözeltisi 500 ul sağlar.
7. Sıvı halde NMR Ölçümü
- dağılmasından sonra, alt-tabaka (A) manyetizasyon ilerlemesini ve (b) ürünü takip 1.5 sn aralanmış 10 ° dönüş açısı darbe Edinme dizileri bir dizi spektrometresinde numuneden NMR hiperpolarize sinyali ölçer. ölçüm kurduktan sonra, yazılım 'ig' komut satırında yazma ve & # tuşuna39; klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun.
- Mıknatıslanma, T = 3 T 1 ≈ 3 dakika aralıklı 90 ° dönüş açısı darbe elde dizileri bir dizi (T = 10 T 1, yani sonra), NMR ısı sinyali ölçüm tamamen rahat sonra. ölçüm kurduktan sonra, yazılım 'ig' komut satırında yazmak ve 'Enter' klavye tuşuna basın. spektrometre çalışma ve ölçüm kurulumu hakkında ayrıntılı bilgi için NMR spektrometresi kullanım kılavuzuna başvurun.
(Piruvat-to-laktat Dönüşümü için spesifik) enzim içeren Örneklerinde 8. hazırlanması
- Aşağıdaki reçete ile reaksiyon tamponu hazırlayın: 50 mM, 0.1 M fosfat tamponu içinde nikotinamid adenin dinükleotit (NADH), 1 mM etilen-diamintetraasetik asit (EDTA), 0.1 mM ditiotreitol (DTT), düşük pH =7.0.
- bir tavşan kas LDH çözeltisi 20 ug / ml bovin serum albümini, BSA ile reaksiyon tamponu içinde taze hazırlanmış 1 U / ml hazırlayın.
- 478 ul reaksiyon tamponu (8.1 Adım) karıştırın, 20 ul D 2 O spektrometre alan stabilizasyon ( 'kilit') ve 2 ul LDH solüsyonu (7.2 Adım) için izin vermek.
- 5 mm NMR tüpü içine Adım 8.3 hazırlanan 500 ul çözüm hacmini yerleştirin ve 500 MHz NMR spektrometresi içine tüp yerleştirin.
9. Komple Enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümü Prosedürü
- polarizasyon örnek (Adım 1) hazırlayın ve onu (Adım 2) polarize.
- spektrometre (Adım 4) üzerine shimming gerçekleştirin ve enzimatik örneği (Adım 8) hazırlar.
- çözündürme (aşama 5) ve enjeksiyon (Aşama 6) uygulayın.
- 1,5 sn (Adım 7) aralıklı 10 ° çevirme açısı bakliyat satın almalar ile hyperpolarized numuneden gelen sinyallerin bir dizi ölçün. Bu adım hiperpolarize ölçüm veriyorSinyal çürüme ve metabolitleri sinyal birikmesi.
10. Montaj
- Aşama 9.4'te elde edilen her bir spektrum için, sırasıyla, (A) ve (b) ürünü, substrat ve entegre karşı gelen bir zirve tespit (tepe alanı belirlemek). Zirveleri integraller (denklem 2 bkz M (A, B) (t)) mıknatıslanma zamanı ders sinyallerini veriyor.
- Denkleminin çözümünü (2) kullanarak, K = (RA + K eff değerini belirlemek ) Adım 10.1 entegre substrat sinyalinin basit üstel uyum gelen.
- Değeri F = (R A + k eff kullanma ) Aşama 10.2 belirlenen, denklem entegre ederek elde edilen fonksiyonu ile ürün sinyal M B (t) bir uyum K eff ve Rb belirlenmesi (2). (Temsilcisi sonuçları bölümüne Enzymat bakınReaksiyon modelleme, montaj ve rf düzeltme ile ilgili ayrıntılar için ic faaliyet ve metabolik ölçümler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
çözünme DNP kullanarak NMR sinyali kazançlar
DNP etkisi numunenin mikrodalga ışıması altında, genellikle istikrarlı radikal moleküller, NMR aktif çekirdeklere eşleşmemiş elektron spin yüksek kutuplaşma transferi oluşur. En sık kullanılan serbest radikallerin TAM (OXO63) ve TEMPOL vardır. 4 Polarizasyon prosedürleri TEMPOL kullanarak 'çapraz polarizasyon' ile optimize edilebilir. 25
katı halde yüksek nükleer polarizasyon elde edilmesi için kararlı bir radikal konsantrasyonunun en iyi duruma getirme tekniğinin başarısı için çok önemlidir. Optimal TEMPOL konsantrasyonu bu çalışma deneysel koşullarda 33 mm olduğu tespit edilmiştir. Seçilen alt-tabakanın bu kutuplaşma, gerçek zamanlı olarak enzimatik dönüşümü takip yeterlidir.
Polari manyetik alanızer Paris Descartes kurulu B 0 = 3.35 T ve bu sistemin bileşenleri (Şekil 1-3) Yukarıdaki tarif edildi. Kriyostat tasarımı son örnek pozisyon mıknatıs İzomerkez denk gelmesi garanti eder. polarize manyetik alanı rampalı ve yerinde Kriyostat ile, sadece süperiletken şim bobinleri kullanılarak shimmed. 1 x 0.5 x 0.5 cm su numunesinin son proton çizgisi genişliği 23 KHz oldu. Biz değerlendirildi 
ve 
[1 13C] piruvat için. Bunu yapmak için, 13C DNP gelişmiş sinyal belirlemek için ilk gereklidir Çözünme (Şekil 4A) önce, polarize yerinde katı halde. dağılmasından sonra, biz [1- ölçülen13 C] pirüvat hyperpolarized sinyal ve spektrometre yerinde bozunum. Sıvı haldeki sinyali NMR spektrometresi içinde örnek olarak D 2 O 500 ul kullanarak bir test çözünme ölçülmüştür. Bu bize solid-state DNP geliştirme (Şekil 4B, içerlek), sıvı-devlet NMR polarizasyon seviyesi (Şekil 4B) ve aktarım sırasında polarizasyon kayıplarını belirlemek için izin verdi. sinyaller arasındaki oran, Adım 3.3 ölçülen ve 3.2 katı-hal geliştirme tanımlamak Adım . Adım 7.1 olarak ölçülen ilk sinyal ve Adım 7.2 gelen sinyal arasındaki oran, sıvı-devlet hyperpolarized geliştirme tanımlar .
Aşama 3 veriler, sŞekil 4A ve Şekil 4A (ilave) olarak ummarized, teknik [1- 13 C] pirüvat kadar 13 C polarize izin verdiğini gösteriyor Bir 13C polarizasyon tekabül eden ± 5 = 22, = 1.5 ± 0.3%.
Bu kutuplaşma düzeyi ortak MRS koşulları (örn 11.74 T ve 300 K) birden fazla bin kat karbon termal kutuplaşma olduğunu. Şekil 4B ve Şekil 4B (ek) özetlenmiştir Adım 7 veriler, [1- 13 C] piruvat sıvı devlet 13 C hiperpolarizasyona belirlenmesi izin = 1 ± 0.2%. piruvat katı halde elde geliştirdiğiniyüksek geliştirmeleri farklı radikalleri kullanılarak gösterilmiştir olsa, deney amacıyla yeterli. 5 ders veri Adım 7.1 den uygun zaman gevşeme zamanı sabiti bir ölçü verir. Karışımda piruvat boyuna gevşeme süresi 500 ul DNP geliştirilmiş çözeltisi ve 500 ul D 2 O oluşan T 1 olduğu = 75 ± 5 saniye sonra RF düzeltmesi (denklem bakınız (3)).
Enzim aktivitesi ve metabolik ölçümler
13C işaretli substrat (A) Erime DNP NMR algılama ürünün (B), gerçek zamanlı enzimatik dönüşüm dinamikleri takip gözlemlemek için kullanılabilir:
Hemen hiperpolarize alt-tabaka (A) enjeksiyonundan sonra,Ürün (B) sinyal null. Daha sonra, enzimatik dönüşümü (1) (b) üretmeye başlar. 13C çekirdeklerin mıknatıslanma farklı kimyasal kaymalar ve moleküllerin kimyasal değişim etkilenmez. Bununla birlikte, yeni bir ortam ürün sinyali zaman süreci niteliksel üç adımda ayrılabilir B. 13 ° C için farklı boylamsal gevşeme oranlarına yol açabilir: Başlangıçta, B içine A B sinyalinde bir artış üreten transforme enzimatik dönüşümü; Belirli bir süre sonra, deneysel koşullara bağlı nedeniyle gevşeme mıknatıslanma kayıpları, bu artış ve B sinyali dengelemek maksimum ulaşır; Nihayet, uzun zamanlarda, B sinyal uzunlamasına gevşeme nedeniyle azalır. Enzim doyma hipotezi, dönüşüm geri ihmal ve hesap manyetik gevşeme alınarak, enzimatik dönüşümü sırasında iki molekül türleri (A ve B) mıknatıslanma cou ile tanımlanabilirPLED diferansiyel denklem sistemi: 22
M (A, B) (±) moleküler tür, A ve B mıknatıslanmasından olduğu sırasıyla k eff sinyali enzimatik reaksiyon ile aktarımı ve R için etkili bir dönüşüm oranı sabiti (A, B) belirgin uzunlamasına gevşeme oranı sabitleri sırasıyla moleküler türler A ve B, gözlemlenen çekirdeklerin R saf boyuna mıknatıslanma rahatlama ve rf palslama etkisi hem (A, B) hesabına.:
t, 1 (A, B), uzunlamasına gevşeme buradaZaman sırasıyla moleküler türler A ve B yerel moleküler ortamda çekirdeğin, sürekli. θ ve τ sırasıyla rf çevirme açısı ve iki sinyal satın almalar arasındaki gecikme vardır.
Bu çalışmada, alt-tabaka A ve ürün B ve [1- 13C] piruvat ve [1 13 C] laktat, sırasıyla, amaç izotopik olarak burada herhangi bir (koşullar altında LDH laktat üretimi [1- 13 ° C] ölçmektir etiketlenmemiş) laktat deneyin başlangıcında çözeltisi mevcuttu. Ölçüm, T = 21 ° C de, basit bir pulseacquire dizisi ile kaydedilen 13C spektrumları bir dizi içerir. Bir kalibre edilmiş 10 ° dönüş açısı darbe sıralı zorlamalara (Aşama 9) için kullanılmıştır. Birbirini takip eden iki darbe arasındaki bir gecikme τ = 1.5 saniyeydi. NMR edinme dizisi hyperpolarized SOLUT önce saniye birkaç on başladıiyon enjeksiyon. enjeksiyondan sonra tüpte piruvat substrat konsantrasyonu 25-35 mm'dir. Aşama 10 10 -3 U / ml'lik bir LDH konsantrasyonunda piruvat dönüşüm hızı laktat ölçülmüştür. Laktat ve pirüvat kaydedilen sinyal = 0.9 ± 0.1 x 10 -3 sn-1 (Şekil 5) de (2) (Şekil 5 de noktalı çizgi) Denklem uygun ve k eff verir. Bu değer oranı [Lac] / [Pir] zaman 0 sn (Şekil 5, içerlek) tarafından belirlenen ilk tepki oranı ile kabul eder.
Deney düzeneğinin 1. Şemalar Şekil. polarize (sol) içine yerleştirilmiş bir kriyostat (d) içinde yer alan, bir mikrodalga kavite (C) oluşur 3.35 t süper-iletken mıknatıs geniş çaplı. t çevreleyen bir ölçüye NMR bobin (b)o (a) in situ nükleer spin polarizasyon izlenmesi için kullanılır örnek. Örnek Mikrodalga frekansı ν MW = 94 GHz ışımaya helyum banyo sıcaklığı 1.12 ± 0.03 K muhafaza edilmektedir. NMR ölçümü polarizasyon esnasında katı hal numune üzerinde gerçekleştirilmesi için sistem sağlar. Polarize örnek kızgın su içinde çözülmüş ve daha önce bitişik NMR spektrometresi (sağda) içine yerleştirilen numune tüpüne transfer hattı aracılığıyla sıkıştırılmış helyum gazı ile itilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Kriyostat ve vakum sistemi şemaları. (A) kriyostat yalıtım termos; (B) ağlamak Ana insert ostat; (C) vakum sistemi bağlantıları; (D) Adım 2 ve protokol bölümünün 5. adımda açıklanan belirli işlemleri gerçekleştirmek için kullanılan düğmeleri ile yönetim yazılımı arayüzü ekran görüntüsü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Örnek kullanım ve çözünme. (A) numune alma ekler; (B) çözünme eki; (C) çözünme ekin elektro-pnömatik bağlantı detay. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Katı hal polarizasyon birikimi ve hyperpolarized sinyal çürüme. Çözünme DNP sinyaller. (A) DNP kutuplaşma sırasında 1.12 M sodyum [1- 13 C] pirüvat çözeltisinin katı hal NMR polarizasyon birikmesi sinyali (haç, bir üstel fonksiyon S (t) ile donatılmış / T x exp (-t = b) + zaman sabiti T b = 270 sn) ve gevşeme (çevreler, S (t) B) · exp (t / T b) + B, T ss 1 = 840 sn =; (A, ek) katı halde DNPenhanced ve termal polarize (büyütülüyor 10 kez) mıknatıslanma sinyalleri arasındaki karşılaştırma (ε ss = katı hal polarizasyon P SS = 1.5 ± 0.3% tekabül 22 ± 5); (B) dağılmasından ve Avera sonra kaydedilen ilk spektrumu arasındaki karşılaştırmatermal polarize 13 ° C elde edilen ged spektrumu (100 kez büyütülüyor) 1.024 ansılların kullanılarak oda sıcaklığında spin (ε = 1,000 ± 200). çözünme süreci% 40 tahmini sinyal kaybı ile 3.3 sn ve otomatik enjeksiyon yaklaşık 2 saniye sürdü. Deneyler manuel enjeksiyon yoluyla numune transferi gerçekleştirilen için uzaması nedeniyle enjeksiyon gecikme ek kayıplar% 30 olarak tahmin edilmiştir; (B, ek) LDH yokluğunda (T 1 = 75 ± 5 sn) içinde çözüldükten sonra piruvat hyperpolarized sinyal çürümesi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Nedeniyle enzyma için [1 13 C] laktat sinyalin Şekil 5. LDH aktivitesi ve kanser hücrelerinin metabolizma sonuçları. Build-up10 -3 U / bir LDH konsantrasyonunda tik dönüşüm nedeniyle 13 C manyetizasyon uzunlamasına rahatlama sinyal çürüme tarafından takip ML. kırmızı çizgi gevşeme ve enzimatik dönüşümü etkilerini içeren denklem (2) 'de tarif edilen bir model ile uygun gösterir. [1 13 C] laktat ve süresi t = 0 (kırmızı çizgi) reaksiyon hızı bir ekstrapolasyonu [1 -13 C] pirüvat konsantrasyonu arasında (Ankastre) oranı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
erime DNP NMR deneyinde kritik noktalar şunlardır: deneyler için gerekli olan en düşük ürün konsantrasyonu olarak gerçekleştirilir ve (ii) yaşam süreleri sinyalinin satın alma sayısını belirler: (i) alt-tabaka için elde polarizasyon seviyesi, manyetizasyon, kutuplaşma ve algılama siteleri arasında ve yüzey dönüşüm oranına transfer süresine göre. Burada tarif edilen çözünme DNP kurulum enjeksiyon sistemi kadar az 3-4 olarak sn numune transferi için izin verir. Transferi S. Bowen ve C. Hilty tarafından önerilen yöntemde gibi hızlı olmasa da, piruvat 26 polarizasyon kayıpları düşük alanda orta uzunlamasına rahatlama ile sınırlı kalmıştır. [1- 13C] piruvat, uzun karboksilik nükleer T 1, 10 -3 U / ml kadar düşük konsantrasyonlarda LDH boyunca akışı ölçüm sağlar.
yüksek sinyal-gürültü oranı DNP biri bile düşük [1- 13 C] pirüvat konsantrasyonları ve daha düşük enzimatik dönüşüm oranları duyarlı olabileceğini düşündürmektedir çözünme kullanılarak elde edilmiştir. Elde edilen polarizasyon seviyesi önemli bir sinyal-gürültü oranı ile 200'den fazla deney düşük çevirme açısı α = 10 ° kullanarak sıvı-devlet NMR spektrometresi elde edilecek tanıyor. Bu optimizasyon için hem tekrarlama süreleri ve flip açıları bakımından odayı terk eder. Bazı moleküller bazı polarize ajanlar (TEMPO, OXO63) 4 ve diğerleri ile iyi polarize solid-state kutuplaşmanın birikmesi için henüz tam olarak anlaşılamamıştır nedenlerle, yok. Deneysel çalışmalar polarizasyon adım başarılı olup olmadığını belirlemek için tek yol vardır. Polarizasyon düzeyini artırmak için, biri farklı radikal türler 4 ve 'çapraz polarizasyon' güvenerek farklı tekniklerin uygulanması kullanımını keşfedebilirsiniz. 25
ontent "> kökü ve alt tabaka konsantrasyonları yanı sıra DNP örnek solvent kompozisyonunun daha fazla optimizasyon polarizasyon geliştirmek için denenebilir. tekniği molekülleri ile sınırlı olan bir çekirdeği ve çözünme olabilir sonra polarizasyon sürdürmek mümkün çekirdeklerin bir grup belirledi. Polarizasyon ya yüksek manyetik alanlarda veya LLS formu iki veya daha fazla birleştiğinde çekirdekler üzerinde delokalize mono-nükleer özdurumların arasındaki dengesizlik olarak devam edilebilir. ilk seçenek için, sonda çekirdeği yüksek olan diğer çekirdeklerin uzak olmak zorunda protonlar dönermıknatıslık oranları. Böyle bir pozisyonu doğal olarak bulunan ise, döteronların aktif çekirdek çevresinde proton molekül veya değiştirilmesi izole bölgelerde NMR aktif çekirdeklerin zenginleştirme, manyetik dipol gücünü düşürmek için gerekli olan . LLS, Supp için en uygun çare bulmak için dışarı 27,28 yapılabilir çekirdeklerin grupları içinde manyetik kaplinler bir teorik analiz elde etmek içinort polarizasyon. 29 amino asit ve ilgi metabolik süreçlerde yer alan diğer moleküllere uygulanabilir örneğin Bu strateji, küçük moleküller başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Daha iyi deney sırasında mıknatıslanma korumak için, LLS uyarılması ile çözünme DNP kombinasyonu, diğer enzimatik reaksiyonlar için ölçüm zaman aralığı genişletmek için vaat ediyor. 20Burada anlatılan DNP-NMR deneyi kanser hücrelerinde piruvat metabolizma ölçümü için uyarlanmıştır. Çözünme DNP gelişmiş NMR ile enzimatik aktivite gerçek zamanlı ölçüm DNP-enhanced MRG ile kanser teşhisinde mevcut çabalara katkıda bulunabilir 6, zaten kullanılan klinik. 12 DNP-enhanced NMR moleküler özgünlüğü moleküler hedeflerin ve bunların dönüşümleri ürünleri arasında ayrım için tercih edilen bir yöntem haline. Metabolik 30 dönüşümler için gelecek gelişmeler, diğer moleküler izleyiciler değerlendirilmesi üzerinde durulacak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarları rakip olduğunu beyan
Acknowledgments
Yazarlar yararlı tartışmalar için Dr. F. Kateb ve Dr G. Bertho yanı sıra, ekipman seçimi ve montaj yardım için Dr JJ van der Klink teşekkür ederim. AC İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (PPOOP2_157547 hibe) tarafından desteklenmiştir. Biz Paris Sorbonne Cité (NMR Com, DIM Analytics, Ville de Paris, Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708) ve Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK finansman kabul. Ekibimiz Equipex programlarının Paris-en-rezonans parçasıdır ve CACSICE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNP polarizer | Vanderklink s.a.r.l (Switzerland) | /// | Cryostat and electronic equipment for sample polarization |
| Vacuum system components | Edwards vacuum (France) | Various | - turbomolecular pumping setup - membrane pumping setup - high capacity roots pumping system - vacuum fittings and components |
| DNP 3.35T Magnet | Bruker (France) | ||
| 500 MHz NMR Spectrometer | Bruker (France) | ||
| Origin 8.0 | OriginLab (US) | Data analysis software | |
| Chemicals | |||
| SODIUM PYRUVATE-1-13C, 99 ATOM % 13C | Sigma Aldrich (France) | 490709 | |
| ETHANOL-D6, ANHYDROUS, 99.5 ATOM % D | Sigma Aldrich (France) | 186414 | |
| 4-Hydroxy-TEMPO 97% | Sigma Aldrich (France) | 176141 | |
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich (France) | 151882 | |
| reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) | Sigma Aldrich (France) | ||
| ethylene-diaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich (France) | ||
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich (France) | ||
| phosphate buffer, pH = 7.0 | Sigma Aldrich (France) | ||
| LDH enzyme in | Sigma Aldrich (France) | L-2500 | |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma Aldrich (France) |
References
- Overhauser, A. W. Polarization of Nuclei in Metals. Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).
- Abragam, A., Goldman, M. Principles of dynamic nuclear polarisation. Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395 (1978).
- Wolber, J., Ellner, F., et al. Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization. Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).
- Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals. PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy. Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).
- Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging. JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).
- Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction. An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).
- Harrison, C., Yang, C., et al. Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR. NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).
- Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy. Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).
- Lerche, M. H., Meier, S., et al. Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism. NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).
- Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate. Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108 (2013).
- Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research. Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).
- Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function. Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).
- Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields. PRL. 92 (15), 153003 (2004).
- Carravetta, M., Levitt, M. H. Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field. J. Chem. Phys. 122 (21), 214505 (2005).
- Vasos, P. R., Comment, A., et al. Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization. PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).
- Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance. JMR. 239, 81-86 (2014).
- Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution. JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).
- Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution. Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).
- Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer. MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).
- Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).
- Comment, A., van den Brandt, B., et al. Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner. Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).
- Balzan, R. Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei. 5966, EPFL - EDPY. Available from: http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf 1-140 (2013).
- Bornet, A., Melzi, R., et al. Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization. JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).
- Bowen, S., Hilty, C. Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy. PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).
- Cavadini, S., Vasos, P. R. Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy. Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).
- Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Long-lived States in Multiple-Spin Systems. Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).
- Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states. Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).
- Sarkar, R., Comment, A., et al. Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization. JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).
