DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Introduction

個々の筋線維は、大規模な、高度に組織化された合胞体細胞です。筋肉のためのいくつかの細胞培養モデルがあります。しかし、これらのモデルは、彼らが完全に成熟した筋線維に分化していない彼らの主要な制限として持ちます。例えば、C2C12およびL6細胞株は、マウス、ラット、それぞれ^1-4から誘導されます。血清飢餓の条件下で、単核「筋芽細胞様」細胞は、増殖を止める細胞周期の撤退を受けて、サルコメアと多核細胞を形成する筋形成プログラムに入力して、筋管と呼ばれます。長期培養条件では、筋管が収縮特性を示すことができ、培養中の「けいれん」。ヒト細胞株は、今も⁵確立されています。これらの不死化細胞株に加えて、単核筋芽細胞が筋から単離することができ、血清飢餓の同様の条件下での筋管を形成します。これらの細胞株および初代筋芽細胞培養物は、高度に使用されていますそれらはプラスミドでトランスフェクトまたはウイルスで形質導入し、基本的な細胞生物学的プロセスを研究するために使用することができるので、FUL。筋管を形成するように誘導された場合しかし、これらの細胞は、さらに、成熟した筋組織の顕著な特徴の多くを欠いています。具体的には、筋管は、個々の成熟した筋線維よりもはるかに小さく、筋線維の正常な形状を欠いています。批判的に、筋管は、筋形質全体で効率的なのCa ^2+放出のために必要な膜状のネットワークを横断（T-）細管を欠いています。

一次筋芽細胞または筋原細胞株の代替方法は、成熟した筋線維を使用することを伴います。形質転換は、標識タンパク質の発現を確立するために使用することができるが、この方法は、コストと時間がかかる。マウス筋肉のインビボ電気穿孔は、速度と信頼性^6-10ための好ましい方法として浮上しています。

in vivoでのエレクトロポレーションおよび筋線維ヘクタールを効率的に分離するための方法マウス短趾屈筋（FDB）の筋肉⁶のために最適化されまし。方法は簡単に完了し、プラスミドからin vivo発現誘導するために最小限の侵襲性ですることができます。このアプローチは現在、筋細胞膜^6,7のレーザ破壊後のイメージングを含む高解像度イメージング法と組み合わされます。蛍光色素および蛍光標識されたタンパク質の発現の組み合わせは、成熟筋線維中の細胞の生物学的プロセスをモニターするために使用することができます。

Protocol

この研究における方法は、医療施設内動物管理使用委員会（IACUC）のノースウェスタン大学フェインバーグ学校と倫理に従って行ったガイドラインを承認しました。すべての努力は苦痛を最小限にするために行われました。

マウスにおける屈筋Digitorumブレビスの in vivoエレクトロポレーション（FDB）筋肉バンドル1.実験手順

1. 哺乳動物細胞で発現することが知られているプロモーターを用いたin vivo発現のためにデザインプラスミド（例えば、サイトメガロウイルス、CMV）または筋肉内（例えば、筋肉クレアチンキナーゼ^{、MCK）6,7。}大きなプラスミドは、低いレベルで発現することができます。 CMVプロモーターは^6,7広く使用されてきました。
2. 大腸菌からのプラスミドを精製大腸菌は、製造者の指示に従ってエンドトキシンを含まない条件を使用して。 5μgのプラスミド/μL - 2で滅菌、エンドトキシンを含まないTE緩衝液中のプラスミドを溶かします。
3. concentratioにプラスミドを希釈し、分取滅菌エンドトキシンフリーのTE（2μgの/μl）を10μlの中のDNAの20μgのn個の滅菌マイクロチューブに注入ごとにバッファリング。注射当たり1つのアリコートを準備します。
4. 8単位の最終濃度を与えるカルシウムとマグネシウムを含まない滅菌リン酸緩衝化生理食塩水で1Xにヒアルロニダーゼの株式（ - / - PBS）を希釈します。滅菌マイクロチューブに小分け注射当たり希釈ヒアルロニダーゼを10μl。
5. 鎮静さとテールやつま先のピンチに反応しないまで、2.5％イソフルランを用いてマウスを麻酔。正常な体温を維持するために加熱パッドや加熱テーブルの上に仰臥位で動物を置きます。
6. 予備校技術針サイトから発信し、外側に放射を使用して、ポビドンヨードスクラブとアルコールの交互のアプリケーションで三回マウスのフットパッドを清掃してください。この手法は、病原体の導入を最小限に抑え、無菌状態で針サイトを維持しています。
7. 目のフットパッドを注入皮膚や滅菌1mlシリンジを使用して筋肉の間に1倍のヒアルロニダーゼ溶液10μl（2 mg / mlの= 8台）付きの電子マウス。ヒアルロニダーゼは、筋線維へのプラスミドのより効率的な入力を可能にするために、細胞外マトリックスの成分を消化。ヒールの底に入力し、つま先に向かって針を進めます。針が後退するようにゆっくり液体をリリース。皮膚の下に注射部位を拡張し、ピンクをオンに開始します。
8. 繰り返しは反対の足で1.6と1.7を繰り返します。
9. 麻酔を外し、戻ってケージにマウスを置きます。マウスが完全に麻酔から回復できるようにします。
10. 2時間待ちます。
11. 麻酔と足​​滅菌手順を繰り返して、1.5と1.6を繰り返します。
12. ヒアルロニダーゼと同じやり方でフットパッドに希釈されたプラスミドDNAを注入します。最大容量は20μL以下であることを確認してください。デュアルプラスミド発現のために20＆の最大容量と各プラスミド20μgのを注入＃181; l以下。
13. 反対側の足蹠にプラスミド注射を繰り返すか、コントロール注射のための反対側の足を使用しています。
14. 最初に注射した足で、細かいピンセットで離れ下線筋肉から皮膚を持ち上げ、足の癒しつま先のラインに垂直位置につま先近くの皮膚のボールを介して1 27 G針を配置します。第二滅菌27 G針を取り、かかとの皮膚を水平に配置します。置き針は互いに離れ約1 cmの平行。
15. ワニクランプを使用して、針が互いに接触していないことを確認することパラレル針に電極を固定します。粘土の使用は、所定の位置にクランプを固定することができます。
16. 電気刺激に電極を接続します。
17. 100 V / cmので、1 Hzで、20パルス、持続時間が20ミリ秒/各を適用することにより、筋肉をエレクトロポレーション。つま先が刺激とけいれんがあります。
18. 必要に応じて反対側の足に刺激手順を繰り返します。
19. 針を外します。ポビドンヨードスクラブとフットパッドを拭きます。
20. 麻酔をオフにします。回復ケージにマウスを返すとアクティビティを監視します。予想通りの手順を実施した場合、動物は、30分以内に正常な歩行を取り戻し、プレ噴射の動作から歩行や活動レベルに差を示さないはずです。したがって、後手順の鎮痛剤は必要ありません。回復時には、動物施設に動物を返します。
    注：タンパク質の発現は、エレクトロポレーション後早くも48時間のようにアッセイすることができます。 14日エレクトロポレーション¹⁰後-しかし、エレクトロポレーション後のより完全な回復を可能にするために、我々は7筋線維の単離および研究を好みます。発現は、4週間後にエレクトロポレーション限りアッセイすることができます。

屈筋Digitorumブレビス（FDB）繊維の単離のための2.実験方法

1. コラゲナーゼを解凍します。各FDBバンドルの12ウェル組織培養プレート中に2個のウェルを準備します。 1でよく1メートルを追加予熱したダルベッコ改変イーグル培地+ウシ血清アルブミン（DMEM + BSA）のLおよび他にも予め温めておいたリンガー溶液1mlを加えます。また、料理をシルガード35ミリメートルに1×リンゲル液の新鮮な10ミリリットルを追加します。
2. 死を確実にするために、頸椎脱臼または他の方法に続いて、CO ₂や麻酔ガスの吸入を介して動物を生け贄に捧げます。
3. きれいなカミソリの刃を使用して足関節以上の後足を外し、35ミリメートルシルガード皿に1×リンゲル液に浸します。
4. 片足タイトピンは、5つま先の先端の各々を通ると足首で30 G針でシルガード皿に、唯一の上を向いて。
5. 足首から開始して、注意しないニックに、まっすぐつま先に向かって生え際に沿って足の側まで皮膚の下の筋肉を皮膚を切り取ります。足の反対側に繰り返します。
6. 細かいピンセットで足首の基部に皮を持ち、かかと全体の皮膚を切りました。
7. 肌をリフティング皮膚にないようニック筋肉に向かってあなたのはさみを指して、鉗子でフラップ。効果的に皮膚を削除し、下にある結合組織をスニップ。
8. FDB筋バンドルを削除するには、骨から腱を解放するためにかかとで大きな腱を切りました。鉗子で腱を持ち、慎重にはさみでFDBに接続されているすべての結合組織を取り除く大きな白い腱からFDBバンドルを分析。適切に行われている場合、バンドルは、簡単に個々の数字につながる明るい白の腱を明らかに根本的な腱のリフトオフます。足からバンドルを解放つま先に近い腱でFDBをカットします。
9. よく含有するDMEM + BSA中で全体の筋束を配置します。
10. 反対側の足の上に繰り返します。
11. 一旦全てのFDB筋を含む各ウェルのDMEM + BSAおよび筋肉にコラゲナーゼの100μlを添加、分離されています。
12. 消化前に倒立蛍光顕微鏡上のエレクトロポレーションの成功を確認してください。 properl行われた場合Y、90％のトランスフェクション効率の上方を達成することができます。
13. 約1時間、10％CO ₂の加湿、37℃のインキュベーター内でプレートをインキュベートします。インキュベーション時間は、疾患モデルと背景とコラゲナーゼのロットに依存して変化し得ます。
14. 1時間後、慎重に含むウェルのみリンゲル液にFDBバンドルを転送します。
15. 1ミリリットルピペットを用いてリンゲル液で十分にFDBバンドルを粉砕します。バンドルを簡単にピペットの先端を通過することができるようにきれいなかみそりの刃でピペットチップの先端をカットします。静かにバンドルが渡すと、先端に平行ダウンすることができ、筋肉（〜15倍）を粉砕​​します。無傷の繊維は、リンゲル液中に落ちます。繊維が簡単にバンドルをオフに該当しない場合には、コラゲナーゼ溶液に背筋を配置します。
16. プレート当たり〜500μlの皿の上の孤立した繊維をプレート。
17. 筋肉を15分間ウェル中で消化できるようにします。
18. 繰り返し2.15ステップ2.17にバンドルのサイズが小さくなるまで、繊維の大部分は、バンドル（2〜3回の通常合計）から解離されます。一度筋肉は簡単に1ミリリットルピペットチップを通過し解離しました。
19. 繊維が15分の最低皿に添付してみましょう。新鮮なリンゲル液は、残留コラゲナーゼを希釈し、プレートに添加し、または時間的制約に応じて変更することができます。
    注：繊維は今イメージングのための準備ができています。

共焦点顕微鏡を用いて、レーザ誘起膜損傷の可視化のための3実験手順

1. リンゲル液にFM 4-64染料2.5μMのFM 1-43の300μlの画像化の直前にロード繊維。一般的に、分離後の画像繊維15分に2時間。しかし、繊維は、24時間後の単離まで撮像することができます。
2. UVレーザおよび60X / 63Xの対物レンズを搭載した共焦点顕微鏡のガラス底皿を置きます。
3. 繊維の位置を確認します。繊維がしっかりと接続されていることを確認顕微鏡ベースをタップして皿に。解離過程で破損された繊維を除外します。損傷を受けた繊維が強くカールまたは屈曲膜ブレブ、FM色素の取り込みを高レベルで含有してもよいです。
4. 繊維上の膜損傷を誘導するために、核の明確な視野を持つ撮像窓の中央に筋鞘を置きます。筋細胞膜が非常にシャープであるように、FM色素チャンネルを使用して、筋細胞膜に焦点を当てています。
5. FM 4-64チャネルを利用し、筋細胞膜上のROIクロス髪を置きます。
6. 3秒（X〜350nmの領域350 nm）の80％の電力で1画素点を照射します。 FM色素は、損傷部位に細胞に入ります。電力及び時間は傷害の面積を増加または減少させるように調整することができます。
7. 最大5分ごとに10秒間、その後、損傷時には、損傷前に2秒ごとポスト損傷を繊維の画像をキャプチャします。タイミングは、必要に応じて調整することができます。個々の画像はイメージJ.にタイムラプスムービーに変換することができます
8. 手順を繰り返し皿ごとに最大3繊維上の3.7を介して3.3。

Representative Results

エレクトロポレーションは、効率的に短趾屈筋（FDB）の筋肉の束（ 図1A）に精製したプラスミドDNAを導入して低侵襲的手法です。七日には、蛍光標識タンパク質が分離された筋線維（ 図1B）で可視化され、トランスフェクション後。単離された繊維は、次に、播種し、共焦点顕微鏡で画像化のために調製されます。繊維は、レーザ誘起損傷を受けることができます。 FM色素は膜損傷の部位を同定するために使用することができる（ 図1C）

消化プロセスの間に、筋線維の数が少ない（白矢印）（ 図2A）を負傷することができます。損傷した筋線維は筋細胞膜（黒矢印）で膜ブレブ形成の存在によって同定することができます。損傷した繊維は、更なる実験に適していないため、使用しないでください。式Oを示す代表的な共焦点画像分離された筋線維図2B内のFAの蛍光融合タンパク質。 CMVプロモーターの利用は、筋線維における最適なタンパク質の発現を駆動します。 DICイメージングは​​、最適な光ファイバを示しています。 FM 4-64は、低レベルでの膜に存在する前に損傷（ 図2C）にあります。

ライカSP 5共焦点顕微鏡上に結像し、FM 4-64を搭載した筋線維の代表的な画像。筋細胞膜は、ビュー（白箱）とROIの十字線（白X）のフィールドの中央に筋核を欠いている領域での筋細胞膜の鮮明な蛍光エッジ（ 図3、中央）上に整列されます。核は、それらがFM色素分析後画像に影響を与えることができるように回避されます。膜の損傷時には、FM色素は最小限に通常の筋線維（ 図3、右）に入ります。膜修復に欠陥筋線維は、レーザ誘起損傷時にFM色素の取り込みのレベルの増加が表示されます。

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in vivoでの エレクトロポレーションおよびレーザー損傷議定書の 図1の回路図 。（A）ヒアルロニダーゼは、麻酔したマウスの足蹠に注射します。プラスミドDNAを注入され、電圧が印加されます。 （B）の7日は、注射後、短趾屈筋（FDB）の束（白の矢印中央のパネル）が露出した腱（黒矢印）を残しフットパッドから分離されています。 （C）繊維はメッキされ、レーザ誘起の損傷が生筋繊維上で行われます。左のパネル、スケールは50μm。右パネル、スケール5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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蛍光タグ付きタンパク質を発現図2.単離された筋線維。七日後にエレクトロポレーションは、タンパク質の発現は、筋線維全体で検出されました。 （A）の異なる膜ブレブ形成（黒矢印）と膜の中断（白矢印）で使用できない筋線維の数が少ない中で単離手順の結果。目盛は5μm。 （B）健康筋線維の代表的な画像。等間隔の筋節は、DICイメージング（左）で可視化されています。筋線維表現アネキシンA6は、GFP（中央パネル）でタグ付けされました。前損傷（右パネル）に最小限のFM色素信号があります。スケール5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

レーザー図3アラインメントFM陽性筋細胞膜上の十字線は筋細胞膜上の関心領域は、視野内の中央に配置されます。筋細胞膜が拡大される（白点線のボックス）とROIの十字線は、核（中央パネル）を欠いている領域での筋細胞膜の鋭いFM-ポジティブエッジで整列されます。破損時には、FM色素は、損傷部位（右パネル、白矢印）に入ります。スケール5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

生体内での蛍光タグ付きタンパク質を研究するためのエレクトロポレーションの使用は忠実に筋肉の全体のセル構造を複製し、適切な細胞株モデルの欠如与えられた筋肉の研究のために理想的に適しています。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレーザー創傷後のタンパク質の局在化及び転座の詳細な画像を提供するために、高解像度の共焦点顕微鏡の利用を説明しています。この方法は、細胞骨格の再編成、輸送、及び融合を含む他の細胞プロセスを研究するために適合させることができます。

FDB筋束内、筋線維の90％までがこのプロトコルを使用して、プラスミドを発現し、これは、筋線維解離前と後の両方の蛍光顕微鏡で容易に見ることができます。注射部位寄りに観察高い発現を持つ式の勾配は、一般的にあります。なぜなら発現の勾配の、様々なタンパク質の発現の影響を監視することができるあちこちミリアン​​ペア単一の実験。すべてのトランスフェクション法と同様に、このアプローチは、過剰発現に関連する問題によって制限されます。注目すべきことに、高レベルの発現を、タンパク質凝集を生じることができます。我々の経験では、mCherryを蛍光タグ（たとえば⁷で図4を参照）の解像度及びタンパク質ドメインの鮮鋭度を低下させる高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）タグよりも多くの凝集を示します。さらに、mTurquise2と金星蛍光タグの両方が十分な蛍光発現を示します。しかし、両方のタンパク質は、eGFPをより小さく明るいです。

この方法は、試験医薬剤と細胞損傷を含む様々な条件下で画像のリビング筋繊維に使用することができます。我々は、筋細胞膜を破壊するためのレーザー損傷を使用するが、他の創傷の処理は、この方法に適合させることができます。この目的のために、ガラスビーズを圧延することによって誘発される浸透圧ショックによって作成された膜のブレブならびに膜損傷の形成をすることもできますエレクトロポレーション筋線維^{11,12を利用し}評価しました。レーザー創傷については、タイプ及びレーザのパワー、ならびに目的は、膜病変^{13,14を作成するために必要な}時間の長さに影響を与えます。また、外付けバッファは、具体的にバッファ内のカルシウムおよびFM色素の濃度は、修復プロセス^{13,15に影響を与えます} 。この方法は、両方のニコンとライカ共焦点イメージングシステム上でテストされ、両方の技術を実行することが可能です。 FM 4-64は、緑色蛍光タンパク質⁷を用いた実験に適しています。その他は、FM 1-43、負この染料^13,15,16の適用を制限する610 nmの、で470 nmおよび発光ピークで励起ピークとの荷電リン脂質結合する他の親油性色素を使用しています。光退色や光毒性が原因オーバー画像の両方の可能な結果です。撮像された露出時間、イメージ周波数とチャンネル数との間の適切なバランスを決定しますパラメータは、容易にこれらの影響を減少させるために操作されます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	11995-073	Dissection Media Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II	Life Technologies	17101-015	Fiber Digestion Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes	Fisher Scientific	877229	Fiber Digestion
Ringers Solution			Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM   KCl 2 mM   CaCl2 1 mM   MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes	Axygen	T-1000-C-R	Digestion
Razor Blades	Personna	94-120-71	Digestion
Precision Glide 30 G needle	BD Biosciences	305128	Dissection
1x PBS (-/-)	Life Technologies	14190-250	Dissection
Sylgard 184	Fisher Scientific	50-366-794	Dissection
Forceps	FST by Dumont	#5/45	Dissection
Forceps	Roboz	RS-4913	Dissection
Scissors	World Precision Instruments	500260	Dissection
BSA	Sigma	A7906	Dissection media Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes	Fisher Scientific	08772B	Dissection- used to hold sylgard
Clay			Electroporation
Stimulator	Grass	s88x	Electroporation
Clamps	Radio Shack	270-356	Electroporation
Triadine	Aplicare	82-220	Electroporation
Precision Glide 27 G needle	BD Biosciences	305136	Electroporation
Simulator	Grass	SIU-V	Electroporation
Gauze	Covidien	2146	Electroporation
Hyaluronidase	Sigma	H4272	Injection Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)	BD Biosciences	329420	Injection
Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	02-682-550	Injection
35 mm glass bottom Microwell dish	MaTek	P35G-1.5-14-C	Microscopy
FM 4-64	Life Technologies	T-13320	Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43	Life Technologies	T-35356	Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid Purification