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Developmental Biology

सृजन CRISPR / Cas9 मध्यस्थता Monoallelic विलोपन माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में बढ़ाने समारोह का अध्ययन करने

Published: April 2, 2016 doi: 10.3791/53552
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

Introduction

विनियामक तत्वों न्यायपालिका जीन अभिव्यक्ति 2 के कारण इन तत्वों के विकास के 1 और संशोधन के दौरान जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक-सामयिक ठीक ट्यूनिंग रोग में परिणाम कर सकते हैं के लिए महत्वपूर्ण हैं। कई रोग से जुड़े जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन द्वारा की पहचान क्षेत्रों के गैर-कोडिंग क्षेत्रों में हैं और ट्रांसक्रिप्शनल enhancers 3-4 की विशेषताएं हैं। Enhancers पहचान करने और उन्हें जीन वे विनियमित जटिल है क्योंकि वे अक्सर जीन वे विनियमित से कई kilobases दूर स्थित हैं और एक ऊतक विशेष ढंग से 5-6 में सक्रिय किया जा सकता है के साथ मिलान। बढ़ाने भविष्यवाणियों सामान्यतः हिस्टोन संशोधन के निशान, मध्यस्थ-cohesin परिसरों पर आधारित हैं और सेल प्रकार विशिष्ट प्रतिलेखन के बंधन 7-10 कारकों। भविष्यवाणी की enhancers के मान्यकरण सबसे अधिक बार एक वेक्टर आधारित परख जिसमें बढ़ाने एक पत्रकार जीन 11-12 की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है के माध्यम से किया जाता है। इन आंकड़ों वी प्रदानख्यात बढ़ाने दृश्यों की नियामक क्षमता के बारे में जानकारी aluable लेकिन उनके अंतर्जात जीनोमिक संदर्भ में उनके कार्य को प्रकट या जीन वे विनियमित की पहचान नहीं है। जीनोम संपादन से नुकसान के समारोह विश्लेषण उनकी अंतर्जात संदर्भ में विनियामक तत्वों के समारोह का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है।

जीनोम संपादन, अर्थात् CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली में हाल के अग्रिमों, जीनोम समारोह की जांच की सुविधा। CRISPR / Cas9 प्रणाली कई जैविक प्रणालियों के लिए प्रयोग करने में आसान और अनुकूलनीय है। Cas9 प्रोटीन एक गाइड आरएनए (gRNA) 13 से जीनोम में एक विशिष्ट साइट के लिए लक्षित है। SpCas9 / gRNA जटिल अपने लक्ष्य जीनोमिक अनुक्रम के लिए जीनोम जो एक protospacer आसन्न मूल भाव (पीएएम) अनुक्रम, NGG 14-15 के लिए 5 होना चाहिए 'स्कैन करता है। gRNA अपने लक्ष्य के लिए, एक 20 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) अनुक्रम gRNA के पूरक के बेस बाँधना, को सक्रिय करता है SpCas9 nuclease गतिविधि एक doubl में जिसके परिणामस्वरूपई कतरा तोड़ (डीएसबी) 3 बीपी पीएएम अनुक्रम की नदी के ऊपर। विशिष्टता gRNA बीज क्षेत्र में पूरा आधार बाँधना के माध्यम से हासिल की है, 6-12 पीएएम से सटे nt; इसके विपरीत, बेमेल 5 'बीज की आमतौर पर 16-17 बर्दाश्त कर रहे हैं। या तो गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने से (NHEJ) डीएनए की मरम्मत या अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) mechanisms.NHEJ डीएनए की मरम्मत अक्सर बनाता लक्ष्य साइट पर कुछ बीपी कि बाधित कर सकते हैं के सम्मिलन / विलोपन (indels) शुरू की डीएसबी ठीक हो सकता है एक जीन का खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ)। जीनोम दो gRNAs है, जो ब्याज के क्षेत्र दिशा में बड़ा विलोपन उत्पन्न करने के लिए, 18-19 इस्तेमाल किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण ठिकाना नियंत्रण क्षेत्रों या सुपर-वर्धक जो पारंपरिक enhancers 9,18,20-22 से बड़े होते हैं में क्लस्टर ट्रांसक्रिप्शनल enhancers के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

Monoallelic विलोपन प्रतिलेखन के सीआईएस -regulation के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल हैं। चांग मनायाप्रतिलेख स्तर में ई एक बढ़ाने की monoallelic हटाए जाने के बाद confounding प्रभाव है कि हो सकता है जब दोनों alleles के प्रतिलेखन संभावित सेलुलर फिटनेस को प्रभावित प्रभावित है बिना जीन विनियमन में उस बढ़ाने की भूमिका के लिए संबद्ध। कम अभिव्यक्ति का मूल्यांकन हालांकि भेद करने के लिए जंगली प्रकार एलील से हटा क्षमता के बिना मुश्किल है। इसके अलावा, दो alleles भेद करने की क्षमता के बिना प्रत्येक एलील पर विलोपन जीनोटाइपिंग चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से 1 एमबी 23 जिसमें यह पीसीआर द्वारा पूरे जंगली प्रकार क्षेत्र बढ़ाना मुश्किल है करने के लिए> 10 केबी की बड़ी विलोपन के लिए है। मुसलमानों castaneus साथ क्रासिंग मस मस्कुलस 129 द्वारा उत्पन्न F1 ES कोशिकाओं के उपयोग के दो alleles एलील विशिष्ट पीसीआर 18,24 द्वारा भेदभाव किया जा करने के लिए अनुमति देता है। इन कोशिकाओं में संकर जीनोम एलील विशिष्ट विलोपन स्क्रीनिंग और अभिव्यक्ति विश्लेषण की सुविधा। औसत पर वहाँ एक एसएनपी इन दो जीनोम के बीच हर 125 बीपी हैअभिव्यक्ति और जीनोटाइपिंग के लिए प्राइमर डिजाइन में लचीलापन प्रदान विश्लेषण करती है। एक एसएनपी की उपस्थिति प्राइमर पिघलने के तापमान (टी एम) को प्रभावित करने और दो ​​alleles 25 के भेदभाव की अनुमति के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) प्रवर्धन में विशिष्टता लक्षित कर सकते हैं। इसके अलावा प्राइमर के 3 'अंत के भीतर एक बेमेल बहुत प्राइमर अवांछित एलील लक्ष्य 26 के प्रवर्धन रोकने से विस्तार करने के लिए डीएनए पोलीमरेज़ की क्षमता को प्रभावित करती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में वर्णित एक से अधिक 1 केबी का एलील विशिष्ट बढ़ाने विलोपन और बाद में अभिव्यक्ति विश्लेषण CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन प्रणाली (चित्रा 1) का उपयोग के लिए F1 ES कोशिकाओं का इस्तेमाल होता है।

आकृति 1
चित्रा 1. बढ़ाने विलोपन सीआईएस -reg अध्ययन करने के लिए CRISPR / Cas9 का उपयोग करजीन अभिव्यक्ति की आबादी। (ए) मस मस्कुलस 129 और मुसलमानों के बीच एक क्रॉस castaneus द्वारा उत्पन्न F1 ES कोशिकाओं एलील विशिष्ट हटाने के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया जाता है। (बी) के दो गाइड आरएनए (gRNA) बढ़ाने क्षेत्र की एक बड़ी Cas9 की मध्यस्थता विलोपन प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। (सी) प्राइमर सेट बड़ी मोनो और द्वि allelic विलोपन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। नारंगी प्राइमरों अंदर प्राइमरों हैं, बैंगनी प्राइमरों gRNA flanking प्राइमरों कर रहे हैं बाहर प्राइमरों और हरे रंग प्राइमरों हैं। (डी) जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन एलील विशिष्ट qPCR का उपयोग कर निगरानी कर रहे हैं। RFU अर्थ रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. डिजाइनिंग और निर्माण gRNA

  1. ट्रांसक्रिप्शनल बढ़ाने क्षेत्रों में दो gRNAs, एक 5 'और एक 3' हित के क्षेत्र के उपयोग को हटाने के लिए। अद्वितीय gRNA दृश्यों की पहचान करने के लिए (http://www.genome-engineering.org 15) माउस UCSC जीनोम ब्राउज़र झांग प्रयोगशाला द्वारा उत्पन्न ट्रैक का प्रयोग करें। इसके बाद इन gRNAs और SNPs और indels सेंगर इंस्टीट्यूट (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28 द्वारा प्रदान की ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर के लिए उनकी आसन्न पीएएम की जाँच करें। बराबर दक्षता के साथ दोनों alleles लक्षित करने के लिए, gRNA / पीएएम दृश्यों कि एक एसएनपी या INDEL जिनमें से बचें।
    1. gRNA का चयन करते समय, विलोपन जीनोटाइपिंग के लिए एलील विशिष्ट प्राइमरों डिजाइनिंग की व्यवहार्यता के लिए जाँच करें। एलील विशिष्ट प्राइमर डिजाइन के लिए धारा 5 को देखें।
  2. प्रोटोकॉल माली एट अल। 2013 15 में वर्णित के आधार पर दो gRNA plasmids इकट्ठा करो। चुने गए अनूठा 20 बीपी लक्ष्य अनुक्रम int शामिलओ 61mer ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के रूप में तालिका 7 में दिखाया गया है (दृश्यों उन्मुखीकरण '3' के लिए 5 में प्रदर्शित कर रहे हैं, और बोल्ड ठिकानों 20 बीपी लक्ष्य अनुक्रम है कि एक दूसरे के पूरक हैं रिवर्स कर रहे हैं)।
    1. 10 माइक्रोन gRNA Primer_F के 10 μl और एक ट्यूब में 10 माइक्रोन के पूरक Primer_R के 10 μl मिक्स।
    2. 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर मिश्रण incubating द्वारा प्राइमरों पानी रखना और फिर 25 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 डिग्री सेल्सियस / सेकंड शांत। इस कदम के लिए, एक पीसीआर मशीन का उपयोग करें या उबलते पानी में ट्यूब जगह है और यह आरटी को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. पानी की 18.5 μl, 5x एचएफ बफर के 10 μl, 10 मिमी dNTP के 1 μl मिश्रण और उच्च के 0.5 μl: annealed प्राइमर मिश्रण करने के लिए, प्रत्येक प्राइमर विस्तार करने के लिए 30 मिनट के लिए निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें और 72 डिग्री सेल्सियस पर सेते निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़।
    4. इस बात की पुष्टि करने के लिए 100 बीपी गाइड टुकड़े उत्पादन किया गया है एक 2% agarose जेल पर लक्ष्य टुकड़ा के 10 μl चलाएँ।
    5. gRNA वेक्टर (भू से एक उपहार Linearizerge चर्च; Addgene प्लाज्मिड # 41824) 15 Afl द्वितीय के साथ निम्नलिखित प्रतिक्रिया का उपयोग करके स्थापित: 20 इकाइयों / μl) gRNA वेक्टर रीढ़ की हड्डी (2-4 ग्राम), 10x बफर के 5 μl, एएफएल द्वितीय के 3 μl के 5 μl (और 32 μl पानी का। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
    6. एक 1% agarose जेल पर पचा उत्पाद चलाने के लिए और शुद्ध डीएनए बैंड 3.5 केबी के लिए इसी निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक जेल निकालना किट का उपयोग कर linearized gRNA वेक्टर।
    7. रेखीय gRNA वेक्टर (50 एनजी / μl), लक्ष्य टुकड़ा के 1 μl, 2x गिब्सन विधानसभा मास्टर मिश्रण के 10 μl के 1 μl: सेट अप गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रियाओं linearized gRNA सदिश का उपयोग और कदम 1.2.3 से टुकड़ा लक्ष्य के रूप में निम्नानुसार 29-30 और पानी की 8 μl। 60 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
  3. इकट्ठे gRNA वेक्टर साथ कोलाई कोशिकाओं के परिवर्तन।
    1. 1.2.7 से इकट्ठा gRNA वेक्टर के 1 μl मिक्सऔर DH5α (कोलाई तनाव) एक ट्यूब में कोशिकाओं के 50 μl। 45 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने से गर्मी झटका विधि द्वारा DH5α कोशिकाओं को बदलने।
    2. स्नैप 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों ठंडा; तब समाज माध्यम के 400 μl जोड़ें और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. एक लेग केनामाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) बदल कोशिकाओं के सकारात्मक चयन के लिए थाली पर DH5α कोशिकाओं के 100 μl बिखरा हुआ है और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
  4. GRNA सम्मिलित लिए सकारात्मक कोलाई कालोनियों स्क्रीनिंग।
    1. 3 मिलीलीटर लेग में एक केनामाइसिन प्रतिरोधी कॉलोनी और resuspend केनामाइसिन के 50 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त उठाओ। 6-8 कालोनियों के लिए एक ही दोहराएँ और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सीओ / एन में सभी ट्यूबों सेते हैं।
    2. निर्माता की पुस्तिका का पालन करके प्लाज्मिड मिनी किट का उपयोग कर प्रस्तुत करने का हे / एन बड़े संस्कृति से प्लास्मिड निकालें।
    3. GRNA अनुक्रम डालने के लिए जाँच करने के लिए एक ECOR मैं पाचन प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करेंप्लाज्मिड में। एंजाइम बफर के 2 μl, ECOR मैं के 1 μl, पानी के 15 μl: प्रत्येक नमूना के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण के रूप में निम्नानुसार तैयार करते हैं। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रतिक्रिया मिश्रण विभाज्य और प्लाज्मिड के 2 μl जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
    4. एक 1.5% agarose जेल पर पचा उत्पाद चलाएँ।
      नोट: डालने के साथ नमूने एक 475 बीपी बैंड आकार है कि सम्मिलित बिना क्लोन से 100 बीपी उच्च प्रदर्शित करेगा।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, सकारात्मक क्लोन sp6 (आगे) और T7 (रिवर्स) प्राइमरों (तालिका 7) वेक्टर अनुक्रम है कि बाँध का उपयोग कर डालने के एक gRNA की उपस्थिति में एक 642 बीपी आकार टुकड़ा देने के लिए एक कॉलोनी पीसीआर द्वारा जांच की जा सकती है। जब वहाँ gRNA अनुक्रम के भीतर एक ECOR मैं प्रतिबंध साइट है कॉलोनी पीसीआर दृष्टिकोण फायदेमंद है।
  5. डीएनए अनुक्रमण द्वारा gRNA सम्मिलित के अनुक्रम T7 प्राइमर का उपयोग पुष्टि करें।

2. अभिकर्मक

ध्यान दें:Electroporation ते कोशिकाओं में प्लास्मिड transfecting का एक कारगर तरीका है। विधि यहाँ वर्णित microporator अभिकर्मक प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में एक 10 सेमी जिलेटिन लेपित ते सेल मीडिया (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर युक्त पकवान में F1 ते कोशिकाओं को विकसित। कोशिकाओं को 85% तक पहुँच जब confluency मीडिया को हटाने और trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 5 मिनट के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: F1 ES कोशिकाओं बारबरा Panning 24 से प्राप्त की और अनुरोध पर उपलब्ध हो रहे थे।
  2. स्पिन मीडिया (तालिका 2) के 10 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर। पिपेट बार बार कोशिकाओं को पूरी तरह अलग करने के लिए।
  3. 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में सभी कोशिकाओं को ले लीजिए। 3 मिलीलीटर पीबीएस में Resuspend और एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।
  4. 5 मिनट और आर के 100 μl में resuspend के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 1 एक्स 10 6 ते गोली कोशिकाओं (मेजबान) बफर के रूप में किट निर्माता द्वारा आपूर्ति की।
  5. (किरण Musunuru से एक उपहार; Addgene प्लाज्मिड # 44719) 5 माइक्रोग्राम pCas9_GFP से प्रत्येक जोड़े 31, 5 'और 3' लक्ष्य क्षेत्र का विलोपन के लिए gRNA प्लास्मिड और बुलबुले की शुरूआत से बचने के लिए एक विंदुक के साथ धीरे मिश्रण।
  6. electroporation मिश्रण के 100 μl निकालना, टिप में एक बुलबुला से बचने के लिए सावधान किया जा रहा इलेक्ट्रॉनिक पिपेट टिप का उपयोग करें।
  7. कार्यक्रम वोल्ट, चौड़ाई और electroporation के लिए दालों। F1 ते कोशिकाओं के लिए, 3 दालों के लिए 1400 वी, 10 मिसे का उपयोग करें।
  8. समाधान में किसी भी स्पार्क्स के लिए देखने की नोक निरीक्षण electroporation चल रहा है। एक चिंगारी एक हवाई बुलबुले की उपस्थिति का संकेत है और अभिकर्मक के साथ हस्तक्षेप करेगा।
  9. एक 10 सेमी जिलेटिन लेपित 10 मिलीलीटर ते सेल मीडिया (तालिका 1) युक्त डिश में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ते निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं।

3. FACS ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं छंटनी

  1. 48 घंटे के बाद, trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को अलग और 5 मिनट के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. संग्रह बफर (3 टेबल) के 10 मिलीलीटर जोड़कर प्लेट बेअसर। 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में कोशिकाओं को ले लीजिए।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और छँटाई बफर (तालिका 4) के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं और पतला छँटाई मंच के आधार पर गणना। 15 मिलीलीटर ट्यूब में छँटाई के लिए और व्यक्तिगत कोशिकाओं 96 अच्छी तरह प्लेटों में सीधे छँटाई के लिए 0.5-1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं पतला 2-5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं पतला।
  4. क्रमबद्ध 32 कोशिकामापी एक FACS प्रवाह का उपयोग Cas9-GFP + ते कोशिकाओं। सीधे जिलेटिन लेपित 96 अच्छी तरह से अच्छी तरह / 100 μl ते सेल मीडिया वाले प्लेटों में कॉलोनी उठा, या ऐसा व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए 3.5 में वर्णित के रूप में 2 मिलीलीटर वसूली मीडिया (तालिका 5) और थाली के साथ ट्यूबों में थोक में कोशिकाओं को ले लीजिए (
  5. बीज 1-1.5 10 x 4 + GFP ते एक 10 सेमी जिलेटिन लेपित 10 एमएल ते सेल मीडिया (तालिका 1) युक्त डिश में कोशिकाओं। यह कम घनत्व पर चढ़ाना व्यक्ति ते सेल कालोनियों उठा सुविधा होगी।

4. जीनोटाइपिंग, एक्सप्रेशन विश्लेषण और ठंड सेल स्टॉक्स के लिए संवर्धन क्लोन

  1. छंटाई के बाद 4-5 दिन, ते सेल कालोनियों की उपस्थिति के लिए प्रत्यक्ष हल किया 96 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से स्कोर।
    1. मीडिया को दूर करने और trypsin के 30 μl जोड़कर ते सेल कालोनियों अलग कर देना। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ते सेल मीडिया (तालिका 1) के 170 μl जोड़कर trypsin बेअसर, और एकल कक्षों में कॉलोनी की पूरी हदबंदी के लिए ऊपर और नीचे पिपेट और। 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को विकसित जब तक कि अधिकांश कुओं में 70% से अधिक मिला हुआ (आमतौर पर 2-3 दिन) कर रहे हैं।
  2. वैकल्पिक रूप से 10 सेमी व्यंजन से व्यक्ति ते सेल कालोनियों लेनेएक औंधा माइक्रोस्कोप। पिपेट टिप का पालन कदम 4.1.1 एक 96 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में प्रत्येक कॉलोनी रखने, जिलेटिन के साथ pretreated में कॉलोनी श्वास और trypsin के 30 μl के बाद युक्त।
    नोट: कालोनियों आरटी पर trypsin में बैठ सकते हैं जबकि कालोनियों में से एक पूरी पंक्ति उठाया है।
  3. एक बार सभी कालोनियों उठाया और अलग मीडिया में सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित जब तक कि अधिकांश कुओं 70% मिला हुआ (आमतौर पर 2 दिन) खत्म हो गई हैं की है।
  4. जब 96 अच्छी तरह प्लेटें बंटवारे के लिए तैयार कर रहे हैं, मीडिया को दूर trypsin के 30 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एकल कक्षों में पूरा हदबंदी के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से और पिपेट अप करने के लिए ते सेल मीडिया के 180 μl (तालिका 1) जोड़ने और नीचे से trypsin बेअसर।
  5. जिसके परिणामस्वरूप 210 μl से, तीन जिलेटिन लेपित 96 अच्छी तरह प्लेटें प्रत्येक ते सेल मीडिया / अच्छी तरह से (तालिका 1) के 130 μl युक्त में 70 μl बीज। जीई के लिए इन प्लेटों का प्रयोग करेंnotyping, अभिव्यक्ति विश्लेषण और नीचे के रूप में वर्णित प्रत्येक क्लोन के लिए सेल के शेयरों में ठंड।
  6. जीनोटाइपिंग प्लेट 70-85% संगम तक पहुँच जाता है, थाली धारा 6 में "विलोपन जीनोटाइपिंग" वर्णित के रूप में व्यवहार करते हैं।
  7. अभिव्यक्ति विश्लेषण प्लेट 70-85% संगम तक पहुँच जाता है, मीडिया को दूर -80 डिग्री सेल्सियस पर टेप और दुकान सील तक क्लोन genotyped दिया है साथ थाली सील।
    नोट: अभिव्यक्ति विश्लेषण प्लेट क्लोन के प्रारंभिक मार्ग पर जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है। 96 अच्छी तरह से थाली से जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण संभव है, लेकिन के रूप में सेल नंबर कम कर रहे हैं एक आरएनए सूक्ष्म निकासी किट की सिफारिश की है।
  8. 96 अच्छी तरह से थाली रुक स्टॉक की तैयारी:
    1. जब जमे हुए सेल के शेयरों (शेयर -1) के लिए थाली 70-85% संगम तक पहुँच जाता है, मीडिया aspirate trypsin के 30 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. ते सेल मीडिया के 100 μl जोड़कर trypsin बेअसर (तालिका 1) टीओ हर अच्छी तरह से और पिपेट और एकल कक्षों में पूरा हदबंदी के लिए नीचे।
    3. स्थानांतरण प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए दो जिलेटिन लेपित 96 अच्छी तरह से प्लेटों से निलंबित कोशिकाओं के 15 μl, ते सेल मीडिया (तालिका 1) के प्रत्येक युक्त 185 μl और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: यह शेयर-2 के लिए है और -3 प्लेटें जो शेयर-1 से कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के मामले में अतिरिक्त बैक-अप क्लोन कर रहे हैं सफल नहीं है।
  9. इस बीच, 96 अच्छी तरह से थाली (शेयर -1) में शेष कोशिकाओं के 100 μl करने के लिए, ठंड मीडिया (तालिका 6) 2x के 100 μl जोड़ें। एक सील टेप के साथ थाली को सील करने और जल्दी से उचित मिश्रण के लिए थाली पलटना 4-5 बार। -80 डिग्री सेल्सियस पर थाली स्टोर तक क्लोन genotyped रहे हैं।
  10. जब शेयर -2 और शेयर 3 प्लेटें मीडिया ठंड महाप्राण के लिए तैयार हैं, trypsin के 30 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। (ते सेल मीडिया के 70 μl जोड़कर trypsin बेअसर टीप्रत्येक अच्छी तरह से और पिपेट अप करने में सक्षम 1) और एकल कक्षों में पूरा हदबंदी के लिए नीचे।
  11. , 2x ठंड मीडिया के 100 μl जोड़े टेप सील के साथ थाली सील करने और जल्दी से प्लेट उचित मिश्रण के लिए 4-5 बार पलटना। -80 डिग्री सेल्सियस पर थाली स्टोर जब तक इन प्लेटों की जरूरत है।

5. एलील विशिष्ट प्रथम डिजाइन

  1. डिजाइन प्राइमरों (चित्रा 1 सी) के 4 सेट वांछित हटाने के लिए क्लोन स्क्रीन करने के लिए: प्राइमरों, बाहर प्राइमरों, और gRNA flanking प्राइमरों (दोनों 5 'और' 3 gRNA लक्ष्य साइटों के लिए) के रूप में नीचे वर्णित के अंदर।
    1. एसएनपी ट्रैक http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html में 129 और कास्ट जीनोटाइप के लिए इसी प्राप्त करते हैं। दिए गए ट्रैक mm9 माउस जीनोम विधानसभा में निर्देशांक में 129 और कास्ट के बीच आधार प्रतिस्थापन पता चलता है।
      नोट: ऊपर स्थल पर कड़ी UCSC जीनोम ब्राउज़र को अनुप्रेषित और 129 के बीच SNPs युक्त एक कस्टम ट्रैक जोड़ सकते हैं और डाली जाएगी जीईnomes।
    2. क्षेत्र के समन्वय दर्ज नष्ट किया जा सके। वांछित विलोपन युक्त> 3 SNPs के बीच में लगभग 500 बीपी के एक क्षेत्र पर में ज़ूम।
    3. विकल्प बार में देखने> डीएनए और डीएनए मिल पर क्लिक करें ऊपरी मामले प्रारूप में लक्ष्य अनुक्रम डाउनलोड करने के लिए जाओ।
    4. दो FASTA दृश्यों बनाने के; 129 के लिए एक और एसएनपी स्थिति में आधार प्रतिस्थापन द्वारा डाली के लिए एक। एक कम मामले से SNPs निशान।
    5. Primer3 करने के लिए प्लस (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) जाओ और पेस्ट एसएनपी प्रतिस्थापित 129 अनुक्रम। प्राइमरों डिजाइन करने के लिए डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का प्रयोग करें।
    6. डिजाइन करने के लिए अंदर एलील विशिष्ट प्राइमरों कार्य ड्रॉप मेनू में Primer_List का चयन करें और प्राइमर चुनें क्लिक करें। एक आगे या रिवर्स प्राइमर या तो 3 'के अंत या 3 से 4 ठिकानों के भीतर' में एक एसएनपी है और गिर जाता है के अंदर क्षेत्र को हटाया जा सकता है कि चुनें।
      नोट: प्राइमर 3'end प्रदर्शन पर एक एसएनपी है कि qPCR में एलील विशिष्टता वृद्धि हुई है।
    7. मुख्य पृष्ठ पर दूसरे प्राइमर वापसी का चयन करने के लिए, कार्य ड्रॉप मेनू में पता लगाने का चयन करें और पृष्ठ के तल पर उपयुक्त बॉक्स में पहले प्राइमर अनुक्रम पेस्ट करें। सामान्य सेटिंग्स टैब में 80-200 बीपी के लिए उत्पाद का आकार सीमा के लिए सेटिंग बदलने और प्राइमरों चुनें क्लिक करें। एक किताब सूचीबद्ध प्राइमर जोड़े से सेट चुना है; इन 129 के अंदर एलील विशिष्ट प्राइमरों होगा।
    8. दोहराएँ 5.1.5 5.1.7 करने के लिए कदम कास्ट एलील के लिए प्राइमरों डिजाइन करने के लिए।
    9. UCSC जीनोम ब्राउज़र पर लौटें और दर्ज क्षेत्र के समन्वय को हटाया जा सके। देखने के लिए जाएं> अनुक्रम रिट्रीवल क्षेत्र विकल्प के तहत विकल्प बार, डीएनए में नदी के ऊपर 1,000 बीपी जोड़ने और नीचे की ओर लक्ष्य अनुक्रम डाउनलोड करने के लिए डीएनए मिल पर क्लिक करें।
    10. कोष्ठक में gRNA लक्ष्य अनुक्रम निशान। आगे बढ़ने से पहले इस पूरे क्रम को बचाओ।
    11. बाहर प्राइमरों दो gRNA लक्ष्य दृश्यों के बीच अनुक्रम को दूर करने के लिए डिजाइन। दोहराएँ कदम 5.1.4-5.1.8 बाहर एलील विशिष्ट प्राइमर डिजाइन करने के लिएरों लेकिन उत्पाद का आकार बदलने 400-800 बीपी।
    12. , 500 बी पी 5 'और' 3 gRNA लक्ष्य अनुक्रम के साथ दो-दो दृश्यों में अनुक्रम कदम 5.1.10 में प्राप्त विभाजित। दोहराएँ 5.1.5 5.1.7 के लिए डिजाइनिंग gRNA flanking क्षेत्रों के लिए गैर-एलील विशिष्ट प्राइमरों कदम है, लेकिन उत्पाद का आकार 400-800 बीपी बदल जाते हैं।
      नोट: गैर एलील विशिष्ट प्राइमरों के लिए, या तो 129 या कच्चा अनुक्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है और प्राइमरों चुना जाना चाहिए कि एक एसएनपी शामिल नहीं है। यह बाहर डिजाइन और gRNA प्राइमरों flanking के लिए 400-800 बीपी के एक उत्पाद का आकार निर्धारित करने की सलाह दी जाती है। यह भले ही छोटी indels मौजूद हैं प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है।
  2. 2 एनजी / μl में शुद्ध 129 और कास्ट तनाव जीनोमिक डीएनए का उपयोग qPCR द्वारा एलील विशिष्टता के लिए अंदर प्राइमरों का परीक्षण करें। qPCR प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए कदम 6.2-6.4 का पालन करें।
    नोट: यदि लक्षित क्षेत्र में 129 जीनोटाइप C57BL / 6J, C57BL / 6J से डीएनए के रूप में ही 129 डीएनए के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है। एलील विशिष्ट प्राइमरों कम से कम 5 चक्रों प्रदर्शित करना चाहिएसही पर सीटी (चक्र दहलीज) मूल्य बनाम गलत जीनोटाइप के बीच का अंतर। बाहर प्राइमरों F1 जीनोमिक डीएनए क्रमशः के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए वे विलोपन का उपयोग कर Cas9 / gRNA ES कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट बढ़ाना परीक्षण किया जा सकता है, और। बाहर प्राइमरों के एलील विशिष्टता एक बार monoallelic क्लोन पहचान की गई है परीक्षण किया जा सकता है।

6. जीनोटाइपिंग विलोपन

  1. जीनोटाइपिंग 96 अच्छी तरह से थाली 4.6 कदम है कि कॉलोनी विस्तार के बाद उत्पन्न होता है से प्लेट का उपयोग करने से जीनोमिक डीएनए निकालें।
    1. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण मिश्रण तैयार: पानी की 89 μl, 10x बफर के 10 μl और निष्कर्षण अभिकर्मक (निर्माता द्वारा आपूर्ति) के 1 μl। प्रत्येक अच्छी तरह से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण मिश्रण के 100 μl जोड़ें और एक सील टेप के साथ थाली सील।
    2. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    3. प्लेट में कुछ मिनट के लिए बर्फ पर एक incubating द्वारा शांत करने की अनुमति देंघ तो सेंट्रीफ्यूज संक्षेप में अच्छी तरह से नीचे के लिए किसी भी संक्षेपण व्यवस्थित करने के लिए। इस विलोपन स्क्रीनिंग के लिए टेम्पलेट डीएनए थाली के रूप में कार्य करता है।
  2. इस प्रकार के रूप में प्रत्येक क्लोन के लिए दो प्रतियों में qPCR प्रतिक्रियाओं सेट करें: 2x SYBR qPCR मिश्रण के 5 μl, आगे और प्राइमर (3 माइक्रोन) के प्रत्येक 1 μl और पानी की 1 μl रिवर्स। 384 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण के 8 μl द्वारा पीछा किया टेम्पलेट डीएनए के 2 μl जोड़ने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें।
  3. 600 XG पर टेप और स्पिन सील 2 मिनट सामग्री मिश्रण करने के लिए के साथ थाली सील। वास्तविक समय साइक्लर में 384 अच्छी तरह से थाली सरणी रखें।
  4. कार्यक्रम एक 2-कदम पीसीआर के लिए वास्तविक समय साइक्लर पता लगाने के साथ पिघल वक्र विश्लेषण के बाद इस प्रकार है: प्लेट पढ़ने के साथ 30 सेकंड के लिए 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 चक्र, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 62 डिग्री सेल्सियस और 10 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 5 सेकंड + प्लेट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस 5 डिग्री सेल्सियस के वेतन वृद्धि के साथ 95 डिग्री सेल्सियस के लिए पढ़ें।
    नोट: इसके अलावा डिजाइन प्राइमर के लिए, qPCR Miएक्स और चक्र मानकों को भी विशिष्टता प्राइमर के लिए योगदान करते हैं। मापदंडों के ऊपर वर्णित है और अभिकर्मकों सामग्री में सूचीबद्ध अधिक बार एलील विशिष्ट प्रवर्धन निकलेगा।
  5. का विश्लेषण qPCR परिणाम
    1. अंदर एलील विशिष्ट प्राइमरों के साथ प्रवर्धन के लिए प्रत्येक एलील की जाँच करें। एक एलील की कोई प्रवर्धन या उच्च सीटी मूल्य मतभेद (> 5 चक्र) alleles के बीच का सुझाव इन क्लोन उच्च / अनुपस्थित सीटी मूल्य के साथ एलील की एक विषमयुग्मजी विलोपन ले। दोनों alleles की कोई प्रवर्धन पता चलता है कि वे एक homozygous विलोपन ले।
    2. बाहर एलील विशिष्ट प्राइमरों के साथ प्रवर्धन के लिए प्रत्येक एलील की जाँच करें। जब लक्ष्य विलोपन के बाहर प्राइमरों के साथ 1 केबी प्रवर्धन से बड़ा है केवल जब एक विलोपन मौजूद है तब होती है। 22-28 की एक सीटी मूल्य विलोपन की पुष्टि करता है। 1 केबी की तुलना में छोटे लक्ष्य विलोपन के लिए, वैद्युतकणसंचलन द्वारा amplicon आकार की पुष्टि करें।
      नोट: बाहर प्राइमरों केवल मध्यम एलील विशिष्टता दिखाने (figu देखना2 आरई), amplicons बाहर प्राइमरों के बंद लक्ष्य प्रवर्धन के कारण monoallelic क्लोन में दोनों allelic प्राइमर सेट के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इस मामले में कम से कम पांच चक्रों में से दो alleles के बीच एक सीटी मूल्य के अंतर को सही एलील (कम सीटी मूल्य) के अंदर प्राइमरों से प्राप्त परिणामों के आधार पर हटाया जाता है की पुष्टि करनी चाहिए। अगर बनाम बंद लक्ष्य एलील सीटी अंतर के निशाने पर है कम से कम पांच चक्रों नई एलील विशिष्ट बाहर प्राइमरों डिजाइन।
    3. monoallelic विलोपन क्लोन में माध्यमिक स्क्रीनिंग का उपयोग कर, gRNA प्राइमरों flanking द्वारा गैर-हटाए एलील की अखंडता के लिए जाँच करें।
      नोट: gRNA लक्ष्य स्थल के आसपास> 25 बीपी आकार की indels 400-800 बीपी amplicons के लिए qPCR में पिघल वक्र में बदलाव को देख कर पहचाना जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, gRNA flanking प्राइमरों से amplicons <25 बीपी के छोटे indels का पता लगाने के अनुक्रम किया जा सकता है।
      1. '3' और 'जी 2 gRNA flanking प्राइमरों यानी, 5 के सेट के साथ qPCR प्रदर्शन करनाआरएनए CRISPR विलोपन पैदा करने में इस्तेमाल किया। प्राइमरों के इन सेटों के साथ कोई प्रवर्धन इंगित करता है indels qPCR amplicon से बड़ा monoallelic विलोपन क्लोन की गैर-हटाए एलील पर gRNA लक्ष्य साइट पर मौजूद हैं। त्यागें परिणाम के रूप में आगे के विश्लेषण से इन बड़े indels युक्त क्लोन विलोपन की हद तक जाने बिना व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
  6. amplicons एक पीसीआर निर्माता के निर्देश के बाद किट को साफ का उपयोग कर बाहर प्राइमर qPCR प्रतिक्रिया से प्राप्त शुद्ध।
  7. अनुक्रमण पिछले चरण से शुद्ध पीसीआर उत्पाद डीएनए द्वारा नष्ट कर दिया एलील के अनुक्रम की पुष्टि करें। आगे के लिए qPCR प्रवर्धन प्राइमरों का प्रयोग करें और अनुक्रमण रिवर्स।
    नोट: नष्ट कर दिया एलील के जीनोटाइप के एक माध्यमिक पुष्टि के रूप में amplicon अधिनियम के भीतर इस स्तर SNPs पर।

7. ऐल्लि विशिष्ट प्राइमरों के साथ विश्लेषण अभिव्यक्ति

  1. 96 अच्छी तरह से सेल शेयर pl गला लेंएक गर्म स्नान मनका पर रखकर -80 डिग्री सेल्सियस (शेयर -1 कदम 4.9 से) पर संग्रहीत खा लिया। थाली में कुओं के आधे से अधिक 5 मिनट के लिए 300 XG पर thawed रहे हैं, स्पिन।
  2. ध्यान से, सील टेप को दूर करने और जल्दी से जिलेटिन लेपित, 12 अच्छी तरह प्लेटें ते सेल मीडिया (तालिका 1) के 1 मिलीलीटर युक्त में विलोपन सकारात्मक कुओं से कोशिकाओं को हस्तांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  3. प्लेट 70-85% संगम, पारित होने की कोशिकाओं में पहुंचता है और उन्हें एक जिलेटिन लेपित, 6 अच्छी तरह से थाली के तीन कुओं, ते सेल मीडिया (तालिका 1) के प्रत्येक युक्त 2 मिलीलीटर में विभाजित है। (चरण 8 में वर्णित) तरल नाइट्रोजन में लंबी अवधि के भंडारण और आरएनए निकासी के लिए तीसरे अच्छी तरह से के लिए जमे हुए सेल के शेयरों के 2 शीशियों तैयार करने के लिए दो कुओं का प्रयोग करें।
  4. निकालें आरएनए एक शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर।
  5. रिवर्स transcribing (आरटी) आरएनए सीडीएनए संश्लेषण किट निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित का उपयोग करके सीडीएनए को शाही सेना के 100-500 एनजी कन्वर्ट। एक आर टी एन के शामिलप्रत्येक शाही सेना के नमूने के लिए egative प्रतिक्रिया शाही सेना के नमूने में डीएनए contaminating की राशि की निगरानी के लिए।
  6. और 1: 2: 1 के बीच के अनुपात में qPCR से पहले सीडीएनए पतला 4; ES कोशिकाओं में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है।
  7. मानक के रूप में वक्र (0.08 एनजी / μl करने के लिए 250 से 5 गुना dilutions) प्रतिलेख के स्तर का पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए के रूप में एफ 1 जीनोमिक डीएनए सहित ऊपर वर्णित qPCR सेट करें। एक उपयुक्त नियंत्रण जीन करने के लिए प्रत्येक पुष्टि की नष्ट कर दिया क्लोन में ब्याज की जीन के प्रत्येक एलील की अभिव्यक्ति की तुलना में, उदाहरण के GAPDH (तालिका 7 में सूचीबद्ध प्राइमरों) के लिए।
    नोट: नियंत्रण जीन प्राइमरों एलील विशिष्ट होने की जरूरत नहीं है। एलील विशिष्ट प्राइमर डिजाइन के रूप में प्रवर्धन के लिए लक्ष्य क्षेत्र के अपवाद के साथ जीनोटाइपिंग प्राइमरों के लिए वर्णित RT-qPCR प्राइमरों के लिए ही है। जीन अनुक्रम इस्तेमाल किया जाना चाहिए; अगर एक भी एक्सॉन या एक एक्सॉन-intron सीमा के लिए प्राइमरों का उपयोग (प्राथमिक प्रतिलेख पर नजर रखने के लिए) F1 जीनोमिक डीएनए के लिए इस्तेमाल किया जा सकतामानक वक्र। RT-qPCR पर अधिक जानकारी के लिए Forlenza एट अल देखें। 2012 33।

ES कोशिकाओं के लंबी अवधि के भंडारण के लिए 8. रुक स्टॉक तैयारी

  1. प्रत्येक 6 अच्छी तरह से (7.3 कदम से) के लिए trypsin के 300 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। स्पिन मीडिया (तालिका 2) के 2 मिलीलीटर एकल कक्षों में अलग कर देना कई बार ऊपर और नीचे trypsin और पिपेट बेअसर करने के लिए जोड़ें।
  2. 5 मिनट के लिए 300 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में कोशिकाओं स्थानांतरण।
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और ते सेल मीडिया (तालिका 1) के 500 μl जोड़ें। कोशिकाओं resuspend ऊपर और नीचे पिपेट और।
  4. एक 1.5 मिलीलीटर cryovial ट्यूब के लिए सामग्री के हस्तांतरण और 2x ते सेल ठंड मीडिया (3 टेबल) के 500 μl जोड़ें। inverting ट्यूब द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और एक शराब मुक्त सेल ठंड कंटेनर में ट्यूब जगह है। transferrin पहले कम से कम 12 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इस सेल ठंड कंटेनरों जगहएक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक में छ।

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Representative Results

यहां वर्णित प्रोटोकॉल F1 ते कोशिकाओं का उपयोग करता monoallelic बढ़ाने नष्ट कर दिया CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन (चित्रा 1) का उपयोग कर उत्पन्न कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति की सीआईएस -regulation अध्ययन करने के लिए। gRNA और जीनोटाइपिंग और जीन अभिव्यक्ति के लिए एलील विशिष्ट प्राइमर डिजाइन इस दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण कारक हैं। प्रत्येक एलील विशिष्ट प्राइमर सेट एलील विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए qPCR द्वारा मान्य किया जाना चाहिए। एलील विशिष्ट प्राइमरों है कि केवल उनके संबंधित जीनोमिक डीएनए लक्ष्य बढ़ाना आदर्श (चित्रा 2) कर रहे हैं। आदर्श रूप में इन प्राइमरों उनके 3 'के अंत में एक एसएनपी है। अगर वे बनाम गलत जीनोटाइप 25 सही करने के अपने प्रवर्धन में एक 5 सीटी मूल्य अंतर का एक न्यूनतम प्रदर्शन कम एलील विशिष्टता के साथ प्राइमर का इस्तेमाल किया जा सकता है। प्राइमर है कि अधिक 5 अंत '3 से 4 वें आधार से' एक एसएनपी ले आमतौर पर, एलील विशिष्टता प्रदर्शन करने के लिए विफल रहता है और बराबर दक्षता के साथ दोनों जीनोटाइप बढ़ानाप्राइमर 34 में एसएनपी स्थिति के महत्व खुलासा। इसके अलावा एक प्यूरीन / प्यूरीन या pyrimidine / pyrimidine प्रतिस्थापन एक प्यूरीन / pyrimidine प्रतिस्थापन 25 की तुलना में दो प्राइमरों के टी मीटर के अंतर पर एक बड़ा प्रभाव है दिखाया गया है।

ते सेल क्लोन से पृथक डीएनए के एक 96 अच्छी तरह से थाली की प्राथमिक जांच क्लोन है कि एक या दोनों alleles पर एक विलोपन ले जाने की पहचान करने के एलील विशिष्ट अंदर प्राइमरों के साथ आयोजित किया जाता है। ये नष्ट कर दिया क्लोन आगे प्रत्येक हटाए जाने की पुष्टि करने के लिए बाहर एलील विशिष्ट प्राइमरों के साथ जांच कर रहे हैं। उदाहरण के लिए यहां दिए गए एक कुशल gRNA जोड़ी है कि 129, कास्ट, या दोनों alleles (चित्रा 3) पर एक विलोपन ले जाने के क्लोन के 46% के परिणामस्वरूप से है। माध्यमिक स्क्रीनिंग की पुष्टि की monoallelic विलोपन क्लोन INDEL occurr की आवृत्ति के रूप में गैर-हटाए एलील पर gRNA लक्ष्य स्थलों के आसपास indels की पहचान करने के लिए किया जाता हैgRNA लक्ष्य साइट पर खिलाडि़यों उच्च 23 है। GRNA आसपास indels के रूप में इन क्लोन अंदर प्राइमरों के साथ कोई विलोपन दिखाने के लिए और बाहर प्राइमरों (चित्रा 4) के साथ बढ़ाना नहीं है, प्राथमिक जांच में पहचाने जाने योग्य नहीं हैं। Monoallelic विलोपन क्लोन है कि बाएँ और दाएँ gRNA flanking प्राइमरों के दोनों सेट के साथ प्रवर्धन देने के उनके अन्य एलील काफी हद तक बरकरार रूप में वे एक विलोपन 5 'या' 3 gRNA flanking amplicons से बड़ा शामिल नहीं है। gRNA flanking प्राइमरों से amplicons अनुक्रमण gRNA flanking amplicons जो qPCR में ध्यान देने योग्य नहीं हो सकता है की तुलना में छोटे indels की पहचान करेगा। monoallelic विलोपन क्लोन है कि माध्यमिक स्क्रीनिंग में दोनों क्षेत्रों में प्रवर्धन नहीं देते आगे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए शामिल नहीं हैं। gRNA लक्ष्य क्षेत्रों क्षेत्र के बाहर के रूप में चुना जाता है बढ़ाने समारोह का संदेह, indels gRNA flanking amplicons की तुलना में छोटे बढ़ाने समारोह और क्लोन चुनाव प्रभावित होने की संभावना नहीं हैंइन taining आगे के विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है।

एक एलील एक gRNA चुना जा सकता है जो बीज क्षेत्र या पीएएम में एक एसएनपी overlaps के लिए एक बड़ी विलोपन को प्रतिबंधित करने के लिए। यहाँ कास्ट एलील पर 3 'gRNA के लिए पीएएम में एक एसएनपी (चित्रा 5) की वजह से वर्णित एक उच्च दक्षता विलोपन (53%) 129 एलील पर का एक उदाहरण है। इस विलोपन एससीआर, ते कोशिकाओं 18,22 में एक हाल ही में वर्णित Sox2 विशिष्ट बढ़ाने हटा दिया। हालांकि बड़े विलोपन की शुरूआत बहुत कास्ट एलील पर कम हो गया था, तीन क्लोन (1, 11, 75) कास्ट एलील पर एक बड़ी विलोपन (चित्रा 5) के साथ पहचान की गई। इन तीन क्लोन के दो (1, 11) gRNA लक्ष्य क्षेत्र '3 के 50 बीपी के भीतर ब्रेक प्वाइंट' 3 निहित। तीसरे क्लोन के लिए हम 3 'ब्रेक प्वाइंट की पहचान करने में सक्षम नहीं थे और निष्कर्ष निकाला कि विलोपन था अधिक से अधिक से अधिक 11 केबी 18। एक या दोनों के साथ विलोपनआईआर ब्रेक प्वाइंट स्थित> 100 बीपी या तो 5 '3' के gRNA लक्ष्य क्षेत्र से जीनोटाइप के लिए मुश्किल हैं, आम तौर पर सभी क्लोन के 15-30% के लिए खाते हैं, और प्राथमिक जांच में uncharacterized रहने के रूप में विलोपन के बाहर के साथ परिलक्षित नहीं है प्राइमरों।

एक बार जब monoallelic विलोपन के साथ क्लोन पहचान की गई है कि वे रिवर्स प्रतिलेखन qPCR द्वारा पूर्ण मात्रा का ठहराव का उपयोग कर एलील विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। महत्वपूर्ण Sox2 बढ़ाने क्षेत्र, एससीआर की एक monoallelic विलोपन ले जाने के क्लोन से जीन अभिव्यक्ति, यहाँ दिखाया गया है (चित्रा 6) जंगली प्रकार F1 ते कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के साथ तुलना में। विशेष रूप से, 129 एलील पर बढ़ाने क्षेत्र के एक विलोपन ले जाने क्लोन जबकि कास्ट एलील पर एक विलोपन ले जाने क्लोन कास्ट प्रतिलेख के स्तर में कमी से प्रदर्शित 129 प्रतिलेख के स्तर में कमी का प्रदर्शन किया। एलील विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण वें पता चलाइस डिस्टल बढ़ाने क्षेत्र, एससीआर पर, ते कोशिकाओं 18 में Sox2 का एक महत्वपूर्ण सीआईएस -regulator है।

चित्र 2
चित्रा 2. परीक्षण 129 और कास्ट एलील विशिष्ट प्राइमरों के एलील विशिष्टता। (ए) 129 जीनोटाइप के लिए प्राइमरों से प्रवर्धन। (बी) कास्ट जीनोटाइप के लिए प्राइमरों से प्रवर्धन। दोनों एक बी में और लाइनों C57BL / 6 जीनोमिक डीएनए जो इन विशिष्ट SNPs में 129 डीएनए के रूप में एक ही जीनोटाइप है के लिए प्रवर्धन प्रोफाइल प्रदर्शित; खुला हलकों के साथ लाइनें डाली जीनोमिक डीएनए के लिए प्रवर्धन प्रोफाइल प्रदर्शित करते हैं। प्राइमर सबसे एलील विशिष्टता के साथ सेट से उत्पन्न प्रवर्धन हरे रंग में दिखाया गया है (एलील विशिष्ट प्राइमर-1), एक किताब के एक 5 सीटी अंतर प्रदर्शित सेट बैंगनी (एलील विशिष्ट प्राइमर-2) और एक प्राइमर सेट प्रदर्शित करने में दिखाया गया है सीटी मूल्य में कम से कम अंतर है rलाल रंग में epresented (एलील विशिष्ट प्राइमर-3, 7 तालिका में प्राइमर विवरण)। लाल प्राइमर सेट एलील विशिष्ट स्क्रीनिंग के लिए उचित नहीं होगा। RFU अर्थ रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. परिणाम एलील विशिष्ट अंदर और बाहर प्राइमरों के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली स्क्रीनिंग के बाद प्राप्त की। (ए) के अंदर प्राइमरों (Enh_del_IS_F1_129, Enh_del _IS_F1C, Enh_del _IS_R1) बी) के बाहर के साथ स्क्रीन से qPCR परिणामों के साथ स्क्रीन से qPCR परिणाम प्राइमरों (Enh_del_OS_F1, ENH del_OS_R1_129, Enh_del_OS_F2C, Enh_del_OS_R3, टेबल 7 में प्राइमर विवरण)। दोनों ग्रे सलाखों में डाली विशिष्ट प्राइमरों से प्रवर्धन प्रतिनिधित्व करते हैं और काली सलाखों के 129 विशेष रस्मी से प्रवर्धन का प्रतिनिधित्व नेताओं। एक पर ध्यान दें एक विलोपन के साथ कि केवल क्लोन या दोनों alleles के बाहर प्राइमरों के साथ जांच कर रहे हैं। प्रत्येक एलील के रिश्तेदार प्रवर्धन 2 -CT का उपयोग कर प्रारंभिक एकाग्रता लगभग करने के लिए और बाद में दो alleles की राशि का एक प्रतिशत के रूप में प्रत्येक एलील व्यक्त गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक monoallelic विलोपन के साथ क्लोन gRNA लक्ष्य स्थलों पर बड़े indels की पहचान के लिए जांच कर रहे हैं। GRNA लक्ष्य क्षेत्रों flanking प्राइमर पुष्टि करने के लिए है कि गैर-हटाए एलील बरकरार है उपयोग किया जाता है। गैर-हटाए एलील पर लक्षित स्थलों पर बड़े indels बिना केवल monoallelic क्लोन बाद अभिव्यक्ति विश्लेषण में उपयोग किया जाता है। tp_upload / 53552 / 53552fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. क्लोन Sox2 एससीआर विलोपन। दिखाया से प्राप्त अंदर प्राइमरों के साथ एक स्क्रीन से qPCR परिणाम हैं (pr111R, pr111F_129, pr111F_Cast, टेबल 7 में विवरण)। ग्रे सलाखों कास्ट विशिष्ट प्राइमरों से प्रवर्धन प्रतिनिधित्व करते हैं और काली सलाखों के 129 विशिष्ट प्राइमरों से प्रवर्धन प्रतिनिधित्व करते हैं। ध्यान दें कि विलोपन कास्ट एलील पर 3 'gRNA लक्ष्य क्षेत्र के पीएएम में एक एसएनपी की उपस्थिति के कारण 129 एलील के प्रति भारी विषम है। प्रत्येक एलील के रिश्तेदार प्रवर्धन 2 -CT का उपयोग कर प्रारंभिक एकाग्रता लगभग करने के लिए और बाद में दो alleles की राशि का एक प्रतिशत के रूप में प्रत्येक एलील व्यक्त गणना की गई। फ़ाइलें / ftp_upload / 53552 / 53552fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 एससीआर विलोपन नाटकीय रूप से 129 से Sox2 की अभिव्यक्ति कम कर देता है। प्रतिनिधि परिणाम या कच्चा एससीआर नष्ट कर दिया क्लोन। लाल सलाखों Sox2 कास्ट एलील की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं और नीली पट्टी Sox2 129 एलील के प्रवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है। 129 एलील कम किया जबकि Sox2 (कास्ट) की कास्ट एलील कम अभिव्यक्ति पर एससीआर का विलोपन Sox2 की अभिव्यक्ति (129) पर एससीआर का विलोपन। प्रदर्शित डेटा तीन तकनीकी प्रतिकृति की एक औसत रहे हैं, त्रुटि सलाखों नहीं दिखाया गया है। Sox2 अभिव्यक्ति विश्लेषण [Sox2_F, Sox2 (129) _R, Sox2 (कास्ट) _R] के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर टेबल 7 में सूचीबद्ध हैं।पलोड करें / 53552 / 53552fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक शेयर एकाग्रता आयतन अंतिम एकाग्रता
GlutaMAX 200 मिमी 6 मिलीलीटर 2 मिमी
2-Mercaptoethanol 10 मिमी 6 मिलीलीटर 0.1 मिमी
सदस्य गैर-जरूरी aminoacids (NEAA) 10 मिमी 6 मिलीलीटर 0.1 मिमी
सोडियम पाइरूवेट 100 मिमी 6 मिलीलीटर 1 मिमी
Pencillin / स्ट्रेप्टोमाइसिन 10,000 इकाइयों 3 मिलीग्राम 50 यू / मिलीलीटर
FBS 90 मिलीलीटर 15% CHIR99021 * 10 मिमी 3 सुक्ष्ममापी
PD0325901 * 10 मिमी 1 माइक्रोन
LIF * 10 7 इकाइयों / मिलीलीटर 1000 U / एमएल
# ते सेल मीडिया को तैयार करने, उच्च ग्लूकोज DMEM के 500 मिलीलीटर के लिए ऊपर घटकों को जोड़ने। ते सेल मीडिया अधिक से अधिक 4 सप्ताह के लिए और अवरोधकों * नहीं अधिक से अधिक 2 हफ्तों के साथ नहीं रखना चाहिए।

तालिका 1 ते सेल मीडिया।

अभिकर्मक शेयर एकाग्रता आयतन अंतिम एकाग्रता
GlutaMAX 200 मिमी 5 मिलीलीटर 2 मिमी
Pencillin / स्ट्रेप्टोमाइसिन 10,000 इकाइयों 5 मिलीलीटर 100 यू / एमएल
FBS 50 मिलीलीटर 10%
# स्पिन मीडिया को तैयार करने, उच्च ग्लूकोज DMEM के 500 मिलीलीटर के लिए ऊपर घटकों को जोड़ने।

तालिका 2 स्पिन मीडिया।

अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता मात्रा (50 एमएल)
सीए के बिना 1x पीबीएस / 2 मिलीग्राम + 42.0 मिलीलीटर
बीएसए भिन्न वी (7.5%) 15% (वी / वी) 7.5 मिलीलीटर
0.5 एम EDTA > 5 मिमी 0.5 मिलीलीटर

तालिका 3. संग्रह बफर।

अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता मात्रा (50 एमएल)
1x HBSS 47.25 मिलीलीटर
1M HEPES 25 मिमी 1.25 मिलीलीटर
0.5 एम EDTA 5 मिमी 0.5 मिलीलीटर
बीएसए भिन्न वी (7.5%) 1% (वी / वी) 0.5 मिलीलीटर
FBS 1% (वी / वी) 0.5 मिलीलीटर

तालिका 4 बफर छंटनी।

तरीके "> ते सेल मीडिया 60% FBS 40%

सारणी 5. रिकवरी मीडिया।

ते सेल मीडिया 60%
FBS 20%
DMSO 20%

6 तालिका 2x ठंड मीडिया।

टेबल 7A
टेबल 7b
टेबल 7. प्राइमरों की सूची।

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Discussion

CRISPR / Cas9 मध्यस्थता जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी जीनोम संशोधन के लिए एक सरल, तेज और सस्ता तरीका प्रदान करता है। विधि यहाँ विस्तृत पैदा करते हैं और कार्यात्मक बढ़ाने लक्षण वर्णन के लिए monoallelic बढ़ाने विलोपन का विश्लेषण करने के लिए F1 माउस कोशिकाओं में SNPs का लाभ लेता है। दृष्टिकोण के इस प्रकार के लाभ हैं: 1) monoallelic बढ़ाने विलोपन confounding प्रभाव होती है कि जब एक महत्वपूर्ण बढ़ाने दोनों alleles से विनियमित जीन मारक सेल करने के लिए अग्रणी के प्रोटीन के स्तर में काफी कमी नष्ट कर दिया, यानी, या बदल जाता है का उत्पादन नहीं करते phenotype; 2) यदि monoallelic विलोपन की आवृत्ति कम एक homozygous विलोपन प्राप्त करने के कम होने की संभावना है; हालांकि, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में एलील विशिष्ट प्राइमरों के उपयोग के साथ एक एक monoallelic विलोपन के साथ क्लोन का विश्लेषण कर सकते हैं; 3) प्राइमरों के चार सेट का उपयोग कर monoallelic विलोपन स्क्रीन करने के लिए आंशिक या बड़े विलोपन जो उलझाना युक्त क्लोन के उन्मूलन के लिए परमिटनीचे की ओर विश्लेषण।

एलील विशिष्ट प्राइमर डिजाइन जीनोटाइपिंग मोनो / biallelic CRISPR विलोपन और एक एलील विशेष तरीके में जीन अभिव्यक्ति पर प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह और अधिक आसानी से हासिल किया जाता है जब F1 इस्तेमाल कोशिकाओं अधिक लगातार SNPs कि दो alleles के भेदभाव की अनुमति होती है। यहाँ एक मस मस्कुलस 129 x मुसलमानों castaneus पार इस्तेमाल कर रहे हैं से उत्पन्न कोशिकाओं es, हालांकि, अन्य कोशिकाओं को अगर दो alleles के बीच SNPs एलील विशिष्ट विलोपन स्क्रीनिंग और अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और पर्याप्त डेटा सक्रिय बढ़ाने क्षेत्रों की भविष्यवाणी करने के लिए मौजूद है, तो चुने हुए सेल प्रकार में निशाना बनाया जा सकता है। इसलिए, इस विधि किसी भी सेल लाइन जहां allelic SNPs के बारे में जानकारी उपलब्ध है अनुकूलित किया जा सकता। प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक विशिष्ट स्थानों पर SNPs पर निर्भरता है। कुछ लक्ष्य क्षेत्रों में कम SNPs बनाता है जो एलील विशिष्ट बाहर प्राइमरों कि बढ़ाना एक <800 बीपी च डिजाइनिंग लेचुनौतीपूर्ण ragment। ऐसे मामलों में एक पीसीआर दृष्टिकोण एक बड़ा amplicon के लिए अनुमति qPCR स्क्रीनिंग के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा वहाँ F1 ते कोशिकाओं के phenotype में एसएनपी जुड़े मतभेद हो सकता है; अतिरिक्त जीनोटाइप में विशिष्ट enhancers के समारोह पुष्टि करने के लिए homozygous विलोपन मानक ते लाइनों में आयोजित किया जा सकता है। SpCas9 nuclease की विशिष्टता विशेष रूप से नैदानिक ​​दृष्टिकोण में संभावित आवेदन पर विचार करने में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। SpCas9 विशिष्टता की जांच से पता चला है दोनों 6-12 NT gRNA मान्यता अनुक्रम का बीज क्षेत्र और आसन्न पीएएम nuclease गतिविधि 13-14,17 के लिए महत्वपूर्ण हैं। लक्ष्य से दूर म्यूटेशन सुनिश्चित बीज क्षेत्र और आसन्न पीएएम जीनोम में अद्वितीय संशोधित किया जा रहा 14,16 हैं कि द्वारा कम किया जा सकता है।

एक monoallelic विलोपन दृष्टिकोण यहाँ वर्णित एलील विशिष्ट शाही सेना seq के साथ मिलकर निश्चित जीन या जीन एक विशिष्ट ई द्वारा विनियमित प्रकट कर सकते हैंnhancer 18। इन प्रयोगों भी रिपोर्टर-परख मान्य enhancers का विलोपन हमेशा जीन अभिव्यक्ति 18 प्रभावित नहीं करता है के रूप में समझ जीनोम समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, enhancers जीनोम में निकटतम जीन को विनियमित नहीं कर सकते हैं या एक से अधिक जीन 1,20,35 विनियमित करते हैं। नतीजतन, हानि के समारोह के विश्लेषण सबसे जानकारीपूर्ण दृष्टिकोण एक बढ़ाने क्षेत्र के समारोह का निर्धारण करने के लिए है। यह तेजी से CRISPR / Cas9 की मध्यस्थता monoallelic विलोपन का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों हितों के टकराव पर जौव की नीतियों पढ़ सकते हैं और कोई खुलासा करने के लिए संघर्ष किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824 A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid
pCas9_GFP Addgene 44719 Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid
AflII NEB R0520S
EcoRI NEB R3101S
Neon Transfection System 100 µL Kit Life Technologies MPK10096 Microporator transfection technology
prepGEM ZyGEM PT10500 genomic DNA extraction reagent
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
High-Speed Plasmid Mini Kit Geneaid PD300
Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free  Geneaid PME25
SYBR select mix for CFX Life Technologies 4472942 qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kit Bio-rad 170-8891 Reverse transcription reagent
0.25% Trypsin with EDTA Life Technologies 25200072
PBS without Ca/Mg2+ Sigma D8537
0.5 M EDTA Bioshop EDT111.500
HBSS Life Technologies 14175095
1 M HEPES Life Technologies 13630080
BSA fraction V (7.5%) Life Technologies 15260037
Max Efficiency DH5α competent cells Invitrogen 18258012
FBS ES cell qualified FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency
DMSO Sigma D2650
Glutamax Invitrogen 35050
DMEM Life Technologies 11960069
Pencillin/Streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360
Non-essential aminoacid Invitrogen 11140
β-mercaptoethanol Sigma M7522
96-well plate Sarstedt 83.3924
Sealing tape Sarstedt 95.1994
CoolCell LX Biocision BCS-405 alcohol-free cell freezing container
CHIR99021 Biovision 1748-5 Inhibitor for F1 ES cell culture
PD0325901 Invivogen inh-pd32 Inhibitor for F1 ES cell culture
LIF Chemicon ESG1107 Inhibitor for F1 ES cell culture

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 110 बढ़ाने CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन monoallelic विलोपन एकल nucleotide बहुरूपता भ्रूण स्टेम कोशिकाओं मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रतिलेखन जीन एक्सप्रेशन
सृजन CRISPR / Cas9 मध्यस्थता Monoallelic विलोपन माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में बढ़ाने समारोह का अध्ययन करने
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Moorthy, S. D., Mitchell, J. A.… More

Moorthy, S. D., Mitchell, J. A. Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (110), e53552, doi:10.3791/53552 (2016).

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