Introduction
転写調節エレメントは、異常な遺伝子発現2に起因する疾患をもたらし得る発展1およびこれらの要素の変更時の遺伝子発現の時空間微調整のために重要です。ゲノムワイド関連解析により同定された多くの疾患関連領域は非コード領域にあり、転写エンハンサー3-4の機能を備えています。エンハンサーを特定し、彼らはしばしば、数キロベース離れて、彼らが調節する遺伝子から位置しており、組織特異的様式5-6で活性化することができるように複雑である調節する遺伝子とそれらをマッチング。エンハンサー予測は一般にヒストン修飾マーク、メディエーターコヒーシン複合体に基づいており、細胞型特異的転写因子7-10の結合されています。予測エンハンサーの検証は、ほとんどの場合、エンハンサーは、レポーター遺伝子11-12の発現を活性化するベクトルベースのアッセイを介して行われます。これらのデータは、Vを提供します推定されるエンハンサー配列の規制の可能性についてaluable情報が、それらの内因性のゲノムのコンテキストでそれらの機能を明らかにするまたはそれらが調節する遺伝子を特定するものではありません。ゲノム編集が機能喪失分析によってそれらの内因性コンテキスト内の転写調節エレメントの機能を研究するための強力なツールとして機能します。
ゲノム編集、すなわち、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムにおける最近の進歩は、ゲノム機能の研究を促進します。 CRISPR / Cas9システムは使いやすく、多くの生物学的システムに適応可能です。 Cas9タンパク質は、ガイドRNA（gRNA）13によるゲノムの特定部位に標的化されます。 SpCas9 / gRNA複合体はprotospacer隣接モチーフ（PAM）シーケンス、NGG 14-15に5 'である必要があり、その標的ゲノム配列のためのゲノムをスキャンします。そのターゲットにgRNA、gRNAに相補的な20ヌクレオチド（nt）の配列の塩基対形成は、doublその結果SpCas9ヌクレアーゼ活性を活性化します電子鎖切断（DSB）PAM配列の上流の3bp。特異性はgRNAシード領域における完全な塩基対形成を介して達成され、6月12日は、PAMに隣接NT;逆に、シードのミスマッチが5 'は通常16-17を許容しています。導入されたDSBは、いずれかの修理非相同末端結合（NHEJ）DNA修復または相同性によって中断されることが標的部位で数塩基対の修復を（HDR）mechanisms.NHEJのDNA修復がしばしば挿入/削除を作成します（インデル）向けることができます遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）。関心領域に隣接するゲノム2 gRNAs、より大きな欠失を生成するために、18〜19を使用することができます。このアプローチは、従来のエンハンサー9,18,20-22よりも大きい遺伝子座制御領域または超エンハンサーにクラスタ化転写エンハンサーの研究のために特に有用です。
1アレルの欠失は、転写のシス -regulationを研究するための貴重なモデルです。観察チャンエンハンサーの1アレル削除後の転写レベルでの電子は、両方の対立遺伝子の転写は、細胞の適応に影響を与える潜在的影響を受けているときに発生する可能性の交絡効果のない遺伝子調節におけるそのエンハンサーの役割と相関します。発現低下を評価する野生型対立遺伝子から削除を区別する能力なしには困難です。さらに、2つの対立遺伝子を識別する能力なしに各対立遺伝子に欠失を遺伝子型決定することは、特にPCRにより全体の野生型領域を増幅することは困難である1メガビット23> 10キロバイトの大きな欠失のために、困難です。 ハツカネズミのcastaneusと交差ハツカネズミ 129によって生成されたF1 ES細胞の使用は、二つの対立遺伝子は、対立遺伝子特異的PCR 18,24によって区別されることを可能にします。これらの細胞におけるハイブリッドゲノムは、対立遺伝子特異的欠失スクリーニングおよび発現分析を容易にします。平均的にSNPは、これら2つのゲノムの間のすべての125bpがあります発現および遺伝子型決定のためのプライマーの設計に柔軟性を提供する分析します。 1つのSNPの存在は、プライマーの融解温度（T m）に影響し、二つの対立遺伝子25の識別を可能にするリアルタイム定量PCR（定量PCR）増幅に特異性を標的とすることができます。さらに、プライマーの3 '末端内のミスマッチが大きく、望ましくない対立遺伝子ターゲット26の増幅を防止するプライマーから伸長するDNAポリメラーゼの能力に影響を与えます。 CRISPR / Cas9ゲノム編集システム（ 図1）を使用して、1より大きいκBの対立遺伝子特異的エンハンサーの欠失、およびその後の発現解析のためにF1 ES細胞の使用は、以下の手順で説明します。
シス -regを 研究するためにCRISPR / Cas9を使用して、図1エンハンサーの削除遺伝子発現のピュレーション。 ハツカネズミ 129とハツカネズミのcastaneus間の交差によって生成された（A）F1 ES細胞は、対立遺伝子特異的欠失を可能にするために使用されます。 （B）2ガイドRNA（gRNA）は、エンハンサー領域の大Cas9媒介性欠失を誘導するために使用されます。 （C）プライマーセットは、大モノおよび二対立遺伝子の欠失を同定するために使用されます。オレンジ色のプライマーは内側プライマーである、紫色のプライマーは、外部プライマーであり、緑のプライマーはgRNAフランキングプライマーです。遺伝子発現の（D）の変更は、対立遺伝子特異的定量PCRを使用して監視しています。 RFUは相対蛍光単位を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
1.設計とgRNAを構築
- 転写エンハンサー領域は2 gRNAs、関心領域の1の5 '及び1 3'を使用して削除します。 （http://www.genome-engineering.org 15）ユニークなgRNA配列を同定するために張研究室で生成されたマウスのUCSCゲノムブラウザトラックを使用します。次にこれらのgRNAsとサンガー研究所（www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211）27-28が提供するオンラインツールを使用して、SNPおよびインデルのための彼らの隣接PAMを確認してください。同等の効率で両方の対立遺伝子を標的とするために、SNPやインデルを含んgRNA / PAMシーケンスを避けます。
- gRNAを選ぶ間、削除の遺伝子型を決定するための対立遺伝子特異的プライマーを設計の実現可能性を確認してください。対立遺伝子特異的プライマーの設計については、セクション5を参照してください。
- マリら。2013 15に記載されているプロトコルに基づいて2つのgRNAプラスミドを組み立てます。選択されたユニークな20 bp標的配列int型を組み込みます表7に示すように、61merオリゴヌクレオチドO（配列は5 'から3'方向に表示し、太字の塩基は、互いの逆相補体である20塩基対の標的配列されています）。
- チューブに10μMgRNA Primer_Fを10μlと、10μMの相補Primer_R10μlのを混ぜます。
- 5分間、100℃でのプライマー混合物をインキュベートすることによって、プライマーをアニールした後、25℃まで1℃/秒の冷却。このステップでは、PCR装置を使用するか、沸騰水中にチューブを配置し、それが室温まで冷却します。
- 水の18.5μlを、5×HF用緩衝液10μl、10mMのdNTPを1μlのミックス・高の0.5μlの：アニーリングしたプライマーミックスに、各プライマーを延長するために30分間72℃で以下の反応ミックスを追加し、インキュベート忠実度DNAポリメラーゼ。
- 100 bpのガイド断片が生産されている確認するために、2％アガロースゲル上の標的フラグメントの10μLを実行します。
- gRNAベクトル（ジオからの贈り物を線形化RGE教会;セットアップ下記の反応を使用して、AFL IIとAddgeneプラスミド＃41824）15：gRNAベクター骨格（2-4μgの）5μlの、10×バッファーを5μl、AFL II（20単位/μl）を32μlと3μlの水の。 37℃で3時間、反応混合物をインキュベートします。
- 1％アガロースゲル上で消化産物を実行し、3.5 kbの対応するDNAバンドを精製し、製造業者の指示に従ってゲル抽出キットを用いてgRNAベクターを線状化。
- セットアップギブソンアセンブリ反応29-30線形化gRNAベクターを使用して、以下のようにステップ1.2.3からのフラグメントをターゲット：リニアgRNAベクトル（50 ngの/μl）を、ターゲット断片の1μlを、2倍ギブソンアセンブリマスターミックス10μlを1μLをそして、水の8μlの。 60分間50℃で反応をインキュベートします。
- 組み立てgRNAベクトルを持つ大腸菌細胞の形質転換。
- 1.2.7から組み立てgRNAベクトルの1μLをミックスそしてDH5α（ 大腸菌株）チューブで50μlの細胞。 45秒間42°Cに細胞を曝露することによって熱ショック法によりDH5α細胞を形質転換します。
- スナップ5分間氷上でチューブを冷やします。その後、SOC培地400μlを添加し、振盪インキュベーター中で37℃で45分間インキュベートします。
- 形質転換細胞の正の選択のためのLB-カナマイシン（50μg/ ml）プレート上DH5α細胞を100μlを広げ、37℃でO / Nインキュベートします。
- gRNAを挿入するための正の大腸菌コロニーをスクリーニング。
- カナマイシン50μg/ mlを含む3ミリリットルのLB中でカナマイシン耐性コロニーを再懸濁を選択します。 6-8コロニーのために同じことを繰り返して、振盪インキュベーター中で37°のCO / Nですべてのチューブをインキュベートします。
- メーカーの取扱説明書に従うことによって、プラスミドミニプレップキットを用いて、O / Nの増殖培養物からプラスミドを抽出します。
- gRNAシーケンス挿入を確認するためのEcoR I消化反応ミックスを調製しますプラスミドインチ酵素緩衝液を2μl、 のEcoR Iの1μlを、水15μLを次のように各試料について、反応ミックスを準備します。 1.5ミリリットルチューブに反応ミックスを分注し、プラスミドの2μlを添加します。 2時間37℃でチューブをインキュベートします。
- 1.5％アガロースゲル上で消化された製品を実行します。
注：挿入した試料では、挿入のないクローンよりも100 bpの高い475bpのバンドのサイズを表示します。
注：また、陽性クローンインサートgRNAの存在下で642 bpのサイズの断片を得Sp6プロモーター（フォワード）およびT7（リバース）プライマー（ 表7）ベクター配列に結合を用いたコロニーPCRによってスクリーニングすることができます。 gRNA配列内のEcoR I制限部位がある場合に、コロニーPCR法が有利で す。
- T7プライマーを用いてDNAシーケンシングによってgRNAインサートの配列を確認してください。
2.トランスフェクション
注意：エレクトロポレーションは、ES細胞にプラスミドをトランスフェクトする効率的な方法です。ここで説明する方法はmicroporatorトランスフェクション技術を使用しています。
- 37℃/ 5％CO 2でのES細胞培地（ 表1）10 mlを入れた10cmのゼラチンコートディッシュでF1 ES細胞を成長させます。細胞が85％コンフルエントに達したときにメディアを取り出し、トリプシンの2ミリリットルを追加します。 5分間、CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
注：F1 ES細胞は、バーバラ・パン24から取得し、リクエストに応じてご利用いただけますしました。 - スピン培地（ 表2）を10mlを添加することによりトリプシンを中和します。完全に細胞を剥離するために繰り返しピペット。
- 5分間、300×gで15ミリリットルチューブとスピンのすべてのセルを収集します。 3ミリリットルのPBSで再懸濁し、血球計数器または自動化細胞カウンターを用いて細胞数を計測します。
- （R100μlの中で5分間再懸濁し、300×gの遠心分離により1.5mlチューブ中で1×10 6個の ES細胞をペレット化再懸濁）キット製造業者によって供給されるバッファ。
- （キランMusunuruからの贈り物; Addgeneプラスミド＃44719）を5μgpCas9_GFPのそれぞれを追加します。31、5 'および3'標的領域の削除のgRNAプラスミドや気泡の導入を回避するために、ピペットで軽く混ぜます。
- 先端に泡を避けるために注意しながら、エレクトロミックスの100μLを吸引するために、電子ピペットチップを使用してください。
- プログラムボルト、幅とエレクトロポレーションのためのパルス。 F1 ES細胞については、3パルスの1400 V、10ミリ秒を使用します。
- エレクトロポレーションが実行されている間、溶液中のいずれかの火花を監視するために先端を観察します。スパークは、気泡の存在を示し、トランスフェクションを妨害します。
- 10mLのES細胞培地（ 表1）を含有する 10cmのゼラチンコートディッシュにトランスフェクトされたES細胞を取り出し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。
トランスフェクトされた細胞を選別3. FACS
- 48時間後、トリプシンを2mlを加えることにより細胞を剥離し、5分間、CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
- 収集バッファ（ 表3）を10mlを添加することによりプレートを中和します。 5分間、300×gで15ミリリットルチューブとスピンで細胞を収集します。
- 上清を捨て、並べ替えバッファ（ 表4）1mlに細胞を懸濁します。細胞をカウントし、ソートプラットフォームに基づいて希釈します。 15mlのチューブに選別するために、96ウェルプレートに直接個々の細胞を選別するために0.5×10 6細胞/ mlに細胞を希釈2-5×10 6細胞/ mlに細胞を希釈します。
- 32サイトメーターFACSフローを使用してソートCas9-GFP + ES細胞。直接100μl/ウェルのES細胞培地を含むゼラチンコートした96ウェルプレートにコロニーピッキング、またはソート個々の細胞のために3.5で説明したように（2ミリリットルリカバリメディア（ 表5）とプレートとチューブで大量に細胞を回収
- シード1〜1.5×10 10 mLのES細胞培地（ 表1）を含む10cmのゼラチンコートディッシュで4 GFP + ES細胞。この低密度でメッキすることは、個々のES細胞コロニーをピッキング容易になります。
4.遺伝子型決定のための培養クローン、発現解析および細胞株を凍結
- 選別後の日4-5で、ES細胞コロニーの存在を直接ソート96ウェルプレートの各ウェルをスコア。
- 培地を除去し、トリプシン30μlのを追加することにより、ES細胞コロニーを解離します。 5分間37℃でインキュベートします。 ES細胞培地（ 表1）の170μLを加えることによって、トリプシンを中和し、単一細胞へのコロニーの完全な解離のために上下にピペットと。ほとんどのウェルが70％コンフルエントの上（通常2〜3日）になるまで37℃/ 5％CO 2で細胞を増殖させます。
- 代替的に用いて10cmの皿から個々のES細胞コロニーをピック倒立顕微鏡。ゼラチンおよびトリプシンの30μLを含むで前処理した96ウェルプレートの1ウェルに各コロニーを配置するピペットチップのフォローのステップ4.1.1、にコロニーを吸引した後。
注：コロニーの1行全体が選択されますしながらコロニーは室温でトリプシンに座ることができます。 - 一旦、全てのコロニーを採取し、ほとんどのウェルが70％コンフルエント（通常は2日間）を超えているまで、CO 2インキュベーター中37℃で細胞を増殖させる培地に分離されています。
- 96ウェルプレートが分割のための準備ができたら、メディアを取り出し、トリプシンの30μlを添加し、5分間37℃でインキュベートします。単一細胞への完全な解離のために各ウェルにピペット上下にES細胞培地（ 表1）の180μLを加えることによって、トリプシンを中和します。
- 得られた210μlのことから、各ES細胞培地/ウェル（ 表1）の130μLを含む3つのゼラチンコーティングした96ウェルプレートに70μLをシードします。 GEのためにこれらのプレートを使用しますnotyping、発現解析や以下に説明するように、各クローンについて、細胞株を凍結します。
- ジェノタイピングプレートは70から85までパーセントコンフルエンスに達すると「削除を遺伝子型決定」のセクション6で説明したように、プレートを扱います。
- 発現解析用プレートが70-85％コンフルエンスに達したときに、メディアを削除するクローンを遺伝子型同定されるまで-80℃でテープや店舗をシールでプレートをシール。
注：発現分析プレートは、クローンの初期の継代での遺伝子発現の変化を分析するのに有用です。 96ウェルプレートからの遺伝子発現解析が可能であるが、細胞数が低いとしてRNAマイクロ抽出キットをお勧めします。 - 96ウェルプレートの凍結ストックの調製：
- 凍結細胞ストック（株式-1）用のプレートは、百分の70から85までのコンフルエンスに到達すると、メディアを吸引、トリプシンの30μlを添加し、5分間37℃でインキュベートします。
- ES細胞培地100μlを加えることによって、トリプシンを中和した （ 表1）、T各ウェルにピペット上下単一細胞内に完全に解離するため、O。
- 転送各ウェルには、2つのゼラチンコーティングした96ウェルプレートから懸濁された細胞の15μlを、ES細胞培地（ 表1）のそれぞれを含む185μlを、37℃/ 5％CO 2で成長することを可能にします。
注：これは、株式-2のためのものであり、株式-1から細胞を復活させる場合には、追加のバックアップ用クローンである-3プレートが成功しませんでした。
- 一方、96ウェルプレート（株-1）の残りの細胞100μlに、2×100μlの培地（ 表6）の凍結を追加します。シーリングテープでプレートをシールし、迅速に適切な混合のためにプレートを4-5回転倒。クローンが遺伝子型を決定するまで-80℃でプレートを保管してください。
- 株式-2および株式-3プレートは吸引にメディアを凍結する準備ができたら、トリプシンの30μlを添加し、5分間37℃でインキュベートします。 ES細胞培地の70μlの（Tを加えることによってトリプシンを中和単一細胞への完全な解離のためのウェルとピペット上下それぞれに）1できます。
- 、メディアを凍結2倍の100μlを添加するシールテープでプレートをシールし、すぐにプレートを適切な混合のために4-5回転倒。これらのプレートが必要になるまで-80℃でプレートを保管してください。
5.対立遺伝子特異的プライマーの設計
- 以下に説明するように（両方で5 'および3' gRNA標的部位）プライマーに隣接するプライマー、外側プライマー、およびgRNA内側：所望の欠失のためのクローンをスクリーニングするデザインのプライマーの4組（ 図1C）。
- http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.htmlで129に対応するSNPトラックとキャストの遺伝子型を取得します。指定されたトラックはMM9マウスゲノムアセンブリ内の座標に129とキャストとの間に塩基置換を示しています。
注：上記のサイトのリンクは、UCSCゲノムブラウザにリダイレクトと129の間のSNPを含むカスタム・トラックを追加し、GEをキャストしますnomes。 - 削除されるべき領域の座標を入力します。 > 3個のSNPを含む所望の削除の途中で約500bpの領域にズームイン。
- >オプションバーでDNAを表示し、すべて大文字形式で標的配列をダウンロードするために得るDNAをクリックして進みます。
- 2 FASTAシーケンスを作成します。 129用とのSNP位置の塩基置換によるキャストのための1つ。小文字によってSNPをマークします。
- プラス（http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/）プライマー3に移動し、SNPが129列を置換貼り付けます。プライマーを設計するためにデフォルト設定を使用します。
- 内部の対立遺伝子特異的なプライマーを設計するには、タスクのドロップメニューにPrimer_List選択し、プライマーを選択]をクリックします。 3 '末端または3から4塩基以内」のいずれかでSNPを有しており、領域を削除するの内側にあるフォワードまたはリバースプライマーを選択してください。
注：3 '末端表示でSNPを持つプライマーは定量PCRで対立遺伝子特異性を増加させました。 - メインページへの第2のプライマーのリターンを選択するには、タスクのドロップメニューでの検出を選択し、ページの下部にある適切なボックス内の最初のプライマー配列を貼り付けます。一般的な設定]タブで80から200塩基対に製品のサイズ範囲の設定を変更し、プライマーを選択]をクリックします。記載されたプライマー対からのプライマーセットを選びました。これらは、対立遺伝子特異的プライマーの内部129になります。
- 繰り返しは、キャストの対立遺伝子のためのプライマーを設計するために5.1.7に5.1.5を繰り返します。
- UCSCゲノムブラウザに戻り、削除されるべき領域の座標を入力してください。表示するに行く>シーケンス検索地域オプション]でオプションバー、中のDNAは、上流千塩基対を追加し、下流の標的配列をダウンロードするDNAを取得]をクリックします。
- 括弧内gRNA標的配列をマークします。先に進む前に、このシーケンス全体を保存します。
- 外側のプライマーを設計するには2 gRNA標的配列の間の配列を除去します。外対立遺伝子特異的プライマーを設計するための手順を繰り返し5.1.4-5.1.8sのが、製品サイズ400〜800 bpのを変更します。
- 二つの配列、gRNA標的配列の500bpの5 'および3'とのそれぞれにステップ5.1.10で得られた配列を分割します。繰り返しは、隣接領域をgRNAための非対立遺伝子特異的プライマーを設計5.1.7に5.1.5ステップが、製品のサイズが400〜800塩基対を変更します。
非対立遺伝子特異的プライマーは、いずれかの129またはキャストシーケンスを使用することができ、プライマーは、SNPを含まないものを選択する必要があります注意してください。外部の設計とgRNAは、プライマーに隣接するために400〜800 bpの産物のサイズを設定することをお勧めします。これは、小さなインデルが存在する場合でも、増幅を可能にします。
- http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.htmlで129に対応するSNPトラックとキャストの遺伝子型を取得します。指定されたトラックはMM9マウスゲノムアセンブリ内の座標に129とキャストとの間に塩基置換を示しています。
- 2 ngの/μlので純129とキャスト株のゲノムDNAを用いて、qPCRによりアレル特異性のための内部プライマーをテストします。定量PCR反応をセットアップするためのステップ6.2から6.4に従ってください。
注：標的領域129遺伝子型は129 DNAの代わりに使用することができるC57BL / 6J、C57BL / 6JのDNAと同じである場合。対立遺伝子特異的プライマーは、少なくとも5サイクルを表示する必要があります不正確な遺伝子型対正しい上のCt（サイクル閾値）値との差。外部プライマーは、それらがCas9 / gRNAを用いて削除が陽性および陰性対照としてそれぞれES細胞、およびF1ゲノムDNAをトランスフェクトした増幅を確認するために試験することができます。 1アレルのクローンが同定されたら外部プライマーの対立遺伝子特異性を試験することができます。
6.ジェノタイピング削除
- コロニー展開した後に生成されたステップ4.6から板を用いた遺伝子型決定96ウェルプレートからのゲノムDNAを抽出します。
- 水89μlを、10×緩衝液10μlと（製造者により供給された）抽出試薬の1μlの：ゲノムDNA抽出ミックスを調製します。各ウェルにゲノムDNAを抽出ミックスの100μlを添加して、シーリングテープでプレートをシール。
- 5分間95℃、続いて5分間75℃でプレートをインキュベートします。
- プレートは数分AN氷上でインキュベートすることによって冷却させます井戸の底に任意の結露を解決するためのDその後、遠心分離機簡単。これは、削除スクリーニングのためのテンプレートDNA板として機能します。
- 2倍SYBR定量PCRミックスの5μLを前方、およびリバースプライマー（3μM）各1μL及び水の1μlを次のように各クローンの重複でqPCR反応を設定します。 384ウェルプレートの各ウェルに反応ミックス8μlのに続いて、鋳型DNAの2μlを添加するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
- 内容物を混合するために2分間600×gでテープとスピンをシールでプレートをシール。リアルタイムサイクラーで384ウェルプレートアレイを配置します。
- プログラムは、検出して融解曲線分析に続いて、2段階PCRのリアルタイムサーマルサイクラーを以下のように10分間、95°Cで1サイクル、15秒間95℃の40サイクル、62℃でプレート読み取りで30秒間および10秒95℃、65℃、95℃まで5秒+プレート読み取りのために5℃の増分で。
プライマー設計に加えて、定量PCRマイル注：xおよびサイクルパラメータも特異性プライマーに寄与する。資料に記載されている上記のパラメータおよび試薬はより頻繁に対立遺伝子特異的な増幅が得られます。 - 定量PCRの結果の分析
- 内部の対立遺伝子特異的プライマーを用いた増幅のための各対立遺伝子を確認してください。一方の対立遺伝子の増幅または対立遺伝子間に高いCt値の差（> 5サイクル）なしには、これらのクローンが高い/不在のCt値との対立遺伝子のヘテロ接合体欠失を運ぶ示唆していません。両方の対立遺伝子の増幅が、彼らはホモ接合体欠失を運ぶことを示唆していません。
- 外対立遺伝子特異的プライマーを用いた増幅のための各対立遺伝子を確認してください。ターゲットの削除は、外部プライマー1 kbの増幅よりも大きい場合、削除が存在する場合にのみ発生します。 22-28のCt値は、削除を確認します。 1キロバイト未満のターゲットの削除については、電気泳動によりアンプリコンサイズを確認します。
注：外プライマーは唯一の適度なアレル特異性を示す場合（Figuを参照してください）2再、アンプリコンは、外側のプライマーのオフターゲット増幅による1アレルのクローンの両方の対立遺伝子プライマーセットを用いて得ることができます。この場合には、少なくとも5サイクルの二つの対立遺伝子間のCt値の差は、正しい対立遺伝子（低いCt値）を確認すべきである内部プライマーから得られた結果に基づいて、削除されます。オフ標的対立遺伝子のCt差対ターゲット上未満の場合5サイクルは、新たな対立遺伝子に特定の外側プライマーを設計します。 - 1アレル欠失クローンでは、プライマーに隣接する二次スクリーニング、gRNAを使用して、非削除された対立遺伝子の整合性をチェックします。
注：gRNA標的部位の周り> 25 bpのサイズのインデルは400〜800塩基対のアンプリコンのためのqPCRにおける融解曲線のシフトを観察することによって同定することができます。あるいは、gRNA隣接するプライマーからのアンプリコンは、<25塩基対の小さなインデルを検出するために配列決定することができます。- 2フランキングプライマーgRNAのセット、すなわち 、5 'および3'グラムで定量PCRを行いますCRISPR欠失を生成する際に使用されるRNA。プライマーのこれらのセットとの増幅は、定量PCRアンプリコンよりも大きなインデルは1アレル欠失クローンの非削除対立遺伝子上のgRNA標的部位に存在であることを示していません。結果としてさらなる分析から、これらの大きなインデルを含む廃棄クローンは、削除の程度を知ることなく解釈することは困難です。
- PCRは、製造元の指示に従って、キットをクリーンアップ使用して外部のプライマーのqPCR反応から得られたアンプリコンを精製します。
- 前のステップから精製したPCR産物を配列決定するDNAによって削除対立遺伝子の配列を確認します。前進のための定量PCR増幅のプライマーを使用し、配列決定を逆転。
注：このステージのSNPでアンプリコン行為以内に削除対立遺伝子の遺伝子型の二次確認として。
対立遺伝子特異的プライマーを用いて7の分析式
- 96ウェル細胞株PLを解凍温かいビーズ浴上に置くことによって、-80℃（株-1ステップ4.9）で保存された食べました。プレート中のウェルの半分以上を5分間300×gで、スピンを解凍している場合。
- 慎重に、シールテープを除去し、すぐにES細胞培地（ 表1）1mlを含有するゼラチン被覆12ウェルプレートに削除陽性ウェルからの細胞を移し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。
- プレートは、70-85％のコンフルエンス、継代細胞に到達し、ゼラチンコーティング、6ウェルプレートの3つのウェル、ES細胞培地（ 表1）のそれぞれを含む2 mlのにそれらを分割します。長期（ステップ8に記載されている）、液体窒素中で貯蔵し、RNA抽出のための第3のウェルのために凍結細胞株の2バイアルを準備するために2つのウェルを使用してください。
- RNA抽出キットを用いてRNAを抽出します。
- RNAの100〜500 ngの製造業者のプロトコールに従ってcDNA合成キットを用いてRNAを逆転写（RT）によりcDNAに変換します。 RT nを含めますRNA試料中のDNAの混入量を監視するために、各RNAサンプルについてegative反応。
- 2と1：1の間の比率でのqPCR前のcDNAを希釈4。 ES細胞における標的遺伝子の発現レベルに応じ。
- 転写レベルの絶対定量のための標準曲線（0.08 ngの/μlの250から5倍希釈）としてF1のゲノムDNAを含む、上記のように定量PCRを設定します。例えばGAPDH（ 表7に列挙されたプライマー）のために、適切な制御遺伝子をそれぞれ確認し、削除クローン中の目的の遺伝子の各対立遺伝子の発現を比較。
注：コントロール遺伝子プライマーは、対立遺伝子特異的である必要はありません。増幅のための標的領域を除いて遺伝子型決定プライマーについて記載したように、対立遺伝子特異的プライマーの設計には、RT-qPCRのプライマーについても同様です。遺伝子配列を使用すべきです。単一エクソンまたはエクソン - イントロン境界のためのプライマーを用いた場合、F1ゲノムDNAのために使用することができる（一次転写産物を監視します）標準曲線。 RT-qPCRのの詳細についてはForlenza らを参照してください。 2012年33。
ES細胞の長期保存のための8フリーズ証券の準備
- （ステップ7.3から）各6ウェルにトリプシンの300μlを添加して、37℃で5分間インキュベートします。単一細胞に解離するには、上下に数回トリプシンおよびピペットを中和するためにスピンメディア（ 表2）の2ミリリットルを追加します。
- 5分間、300×gで15ミリリットルチューブとスピンに細胞を移します。
- 上清を吸引除去し、ES細胞培地（ 表1）の500μlを添加します。細胞を再懸濁するために上下にピペット。
- 1.5ミリリットルクライオバイアルチューブにコンテンツを転送し、2倍のES細胞凍結培地（ 表3）の500μlを添加します。チューブを反転させることによって十分に混合し、アルコールを含まない細胞凍結容器にチューブを配置します。トランスフェリン前に、この細胞は、少なくとも12時間、-80℃で容器を凍結配置液体窒素貯蔵タンクにG。
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Representative Results
ここで説明するプロトコルは、CRISPR / Cas9ゲノム編集（ 図1）を使用して生成された1アレルエンハンサー削除細胞における遺伝子発現のシス -regulationを研究するためにF1 ES細胞を使用しています。遺伝子型決定および遺伝子発現のためのgRNAおよび対立遺伝子特異的プライマーの設計は、このアプローチにおける重要な要因です。各対立遺伝子特異的プライマーセットは、対立遺伝子特異性を確認するために、定量PCRによって検証されなければなりません。唯一のそれぞれのゲノムDNA標的を増幅対立遺伝子特異的プライマーは、（ 図2）理想的です。理想的には、これらのプライマーは、その3 '末端にSNPを持っています。それらは誤った遺伝子型25対正確なそれらの増幅を5 Ct値の差の最小値を表示する場合、以下の対立遺伝子特異性プライマーを使用することができます。 3 '端から4 番目の塩基よりも5'より多くのSNPを運ぶプライマーは、通常、対立遺伝子特異性を示すと同等の効率で両方の遺伝子型を増幅するために失敗し、プライマー34におけるSNP位置の重要性を明らかにする。加えて、プリン/プリンまたはピリミジン/ピリミジン置換プリン/ピリミジン置換25と比較して2つのプライマーのT mの 差に大きな影響を有することが示されています。
ES細胞クローンから単離されたDNAを、96ウェルプレートの一次スクリーニングは、1つまたは両方の対立遺伝子に欠失を担持するクローンを同定するための対立遺伝子特異的内部プライマーを用いて行われます。これらの削除されたクローンは、さらに、各削除を確認するために外部の対立遺伝子特異的プライマーを用いてスクリーニングされます。ここで与えられた例は129、キャスト、または両方の対立遺伝子（ 図3）に欠失を有するクローンの46％をもたらした効率的なgRNAペアからです。二次スクリーニングは、インデル回の出現頻度などの非削除対立遺伝子上gRNA標的部位の周りのインデルを識別するために確認された1アレル欠失クローンのために行われていますgRNAの標的部位でのレンスは高い23です。これらのクローンは内部プライマーとの削除を示さず、外側のプライマー（ 図4）で増幅しないようgRNA周りのインデルは、一次スクリーニングでは識別できません。左右のgRNA隣接するプライマーの両方のセットで増幅を与える1アレル欠失クローンは、彼らは5 'または3' gRNA隣接アンプリコンよりも大きな欠失を含んでいないとして、主に無傷の彼らの他の対立遺伝子を持っています。 gRNA隣接するプライマーからのアンプリコンを配列決定すると、定量PCRで顕著ではないかもしれないgRNA隣接するアンプリコンよりも小さいインデルを識別します。二次スクリーニングでの両方の領域での増幅を与えていない1アレル欠失クローンは、さらに、遺伝子発現解析のために含まれていません。 gRNA対象領域がエンハンサー機能を有することが疑われる領域の外側に選択されるように、gRNA隣接リコンより小さいインデルはエンハンサー機能とクローン詐欺に影響を与える可能性はありませんこれらのtainingをさらに分析に含めることができます。
一方の対立遺伝子に大きな欠失を制限するgRNAは、シード領域またはPAMでSNPと重なる選択することができます。ここで説明するが原因キャスト対立遺伝子上の3 'gRNAためのPAM（ 図5）におけるSNPの129対立遺伝子上に高効率の削除（53％）の例です。この欠失は、SCR、ES細胞18,22における最近記載Sox2の特異的エンハンサーを削除しました。大きな欠失の導入を大幅にキャスト対立遺伝子に減少したものの、3つのクローン（1、11、75）が出演対立遺伝子に大きな欠失（ 図5）を用いて同定しました。これらの3つのクローンのうち2つ（1、11）がgRNA標的領域3 'の50bpの内のブレークポイントの3を含有していました。第三のクローンのために我々は、3 'ブレークポイントを識別することができませんでしたし、削除を超える11キロバイト18であると結論しました。一方または両方との欠失IRブレークポイントは、一般的に、遺伝子型に困難であり、すべてのクローンの15から30パーセントを占め、および削除が外部と増幅されないように、一次スクリーニングにおいて特徴付けられていないまま、5 'から3'のgRNA対象領域のいずれかから> 100塩基対の位置しますプライマー。
1アレル欠失を有するクローンが同定されたら、それらを逆転写定量PCRによって、絶対的定量を使用して、対立遺伝子特異的遺伝子発現について分析します。重要なSox2のエンハンサー領域、SCRの1アレル欠失を有するクローンからの遺伝子発現は、野生型F1 ES細胞中での発現（ 図6）と比較して、ここで示されています。キャスト対立遺伝子に欠失を有するクローンをキャスト転写レベルの減少を示したのに対し、具体的には、129対立遺伝子のエンハンサー領域の欠失を有するクローンは、129の転写物レベルの減少を示しました。対立遺伝子特異的な遺伝子発現解析は、目を明らかにしましたこの遠位エンハンサー領域、SCRで、ES細胞18内のSox2の重要なシス -regulatorです。
図2のテスト129及びキャスト対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異。129遺伝子型のためのプライマーの（A）の増幅。 （B）キャスト遺伝子型のためのプライマーから増幅。 AとBの両方のラインは、これらの特定のSNPにおける129 DNAと同じ遺伝子型を有するC57BL / 6ゲノムDNAに対する増幅プロフィールを示します。白丸とのラインが出演ゲノムDNAに対する増幅プロファイルを表示します。ほとんどの対立遺伝子特異性プライマーセットから得られた増幅は緑色で示されている（対立遺伝子特異的プライマー1）、5のCtの差を表示するプライマーセットは、紫色（対立遺伝子特異的プライマー2）及びプライマーセットを表示する際に表示されCt値において最小の違いをr赤でepresented（対立遺伝子特異的プライマー-3、表7のプライマーの詳細）。赤のプライマーセットは、対立遺伝子特異的なスクリーニングのために適切ではありません。 RFUは相対蛍光単位を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.結果は、対立遺伝子特異的な内側と外側のプライマーを用いて96ウェルプレートをスクリーニングした後に得られる。（A）外部と画面から内部プライマー（Enh_del_IS_F1_129、Enh_del _IS_F1C、Enh_del _IS_R1）B）のqPCR結果を画面からのqPCR結果プライマー（Enh_del_OS_F1、ENH del_OS_R1_129、Enh_del_OS_F2C、Enh_del_OS_R3、表7のプライマーの詳細）。両方の灰色のバーでキャスト特異的プライマーから増幅を表し、黒いバーは、129固有のプリムから増幅を表します ERS。一方または両方の対立遺伝子上の欠失を有するクローンのみを外部プライマーを用いてスクリーニングされることに注意してください。各対立遺伝子の相対的な増幅は初期濃度を近似する2 -CTを用いて計算し、続いて二つの対立遺伝子の合計の割合として各対立遺伝子を発現していた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
1アレル欠失を有する図4クローンgRNA標的部位での大きなインデルを識別するためにスクリーニングされる。gRNA対象領域に隣接するプライマーが非削除対立遺伝子が無傷であることを確認するために使用されます。非削除された対立遺伝子の標的部位に大きなインデルずにのみ1アレルのクローンは、その後の発現解析に使用されています。 tp_upload / 53552 / 53552fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Sox2の SCRの削除。示さから得られた図5クローンを内部プライマーを用いて画面からのqPCR結果である（pr111R、pr111F_129、pr111F_Cast、表7の詳細）。灰色のバーは、キャスト特異的プライマーから増幅を表し、黒いバーが129特異的プライマーからの増幅を表します。削除が原因でキャスト対立遺伝子上の3 'gRNA対象領域のPAMにおけるSNPの存在のために129対立遺伝子に向かって重く偏っていることに注意してください。各対立遺伝子の相対的な増幅は初期濃度を近似する2 -CTを用いて計算し、続いて二つの対立遺伝子の合計の割合として各対立遺伝子を発現していました。ファイル/ ftp_upload / 53552 / 53552fig5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6. SCRの削除が劇的に Sox2の 発現を減少させる 。129またはキャストSCRから代表的な結果は、クローンを削除しました。赤いバーは、Sox2のキャスト対立遺伝子の発現を表し、青色のバーは、Sox2の 129対立遺伝子の増幅を表します。 Sox2の （出演者）のキャスト対立遺伝子発現低下にSCRの削除、一方のSox2の129対立遺伝子発現の減少（129）上のSCRの削除。表示されるデータは、3つの技術の反復の平均であり、エラーバーは、示されていません。 Sox2の発現解析[Sox2_F、Sox2の（129）_R、Sox2の（出演者）_R]に使用したプライマーを表7に記載されています。PLOAD / 53552 / 53552fig6large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 試薬 | ストック濃度 | ボリューム | 最終濃度 | ||||
| グルタ | 200 mMの | 6ミリリットル | 2 mMの | ||||
| 2-メルカプトエタノール | 10 mMの | 6ミリリットル | 0.1 mMの | ||||
| MEM非必須アミノ酸（NEAA） | 10 mMの | 6ミリリットル | 0.1 mMの | ||||
| ピルビン酸ナトリウム | 100 mMの | 6ミリリットル | 1 mMの | ||||
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 10,000台 | 3ミリリットル | 50 U / mlの | ||||
| FBS | 90ミリリットル | 15％ | CHIR99021 * | 10 mMの | 3μM | ||
| PD0325901 * | 10 mMの | 1μM | |||||
| LIF * | 10 7単位/ ml | 1000年U / mlの | |||||
| ＃は、ES細胞のメディアを準備高グルコースDMEMの500ミリリットルに上記のコンポーネントを追加します。 ES細胞培地は、4週間以上と阻害剤*ない2週間以上で保存しないでください。 | |||||||
表1 ES細胞培地。
| 試薬 | ストック濃度 | ボリューム | 最終濃度 |
| グルタ | 200 mMの | 5ミリリットル | 2 mMの |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | 10,000台 | 5ミリリットル | 100 U / mlの |
| FBS | 50ミリリットル | 10％ | |
| ＃は、スピンメディアを準備高グルコースDMEMの500ミリリットルに上記のコンポーネントを追加します。 | |||
表2スピン媒体。
| 試薬 | 最終濃度 | 体積（50ml）で |
| Ca 2+ / Mgを含まないPBSを1倍 | 42.0ミリリットル | |
| BSAフラクションV（7.5％） | 15％（v / v）の | 7.5ミリリットル |
| 0.5 M EDTA > | 5 mMの | 0.5ミリリットル |
表3コレクションバッファ。
| 試薬 | 最終濃度 | 体積（50ml）で |
| 1×HBSS | 47.25ミリリットル | |
| 1M HEPES | 25 mMの | 1.25ミリリットル |
| 0.5 M EDTA | 5 mMの | 0.5ミリリットル |
| BSAフラクションV（7.5％） | 1％（v / v）の | 0.5ミリリットル |
| FBS | 1％（v / v）の | 0.5ミリリットル |
表4.バッファの並べ替え。
方法 ">表5.リカバリメディア。
| ES細胞培地 | 60％ |
| FBS | 20％ |
| DMSO | 20％ |
表6. 2回凍結メディア。
プライマーの表7.一覧。
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Discussion
CRISPR / Cas9媒介ゲノム編集技術は、ゲノム改変のための、簡単で迅速かつ安価な方法を提供します。機能的エンハンサー特徴付けのために1アレルエンハンサーの削除を生成し、分析するために、ここで具体的な方法は、F1マウス細胞におけるSNPを利用しています。このタイプのアプローチの利点は次のとおりです。1）1アレルエンハンサー欠失は重要なエンハンサーは、 すなわち 、両方の対立遺伝子から致死性を細胞につながる調節遺伝子のタンパク質レベルの大幅な削減を削除または変更されたときに発生する交絡効果を生成しません表現型; 2）1アレル欠失の頻度が低いホモ接合性欠失を取得している場合には可能性が低いです。しかし、遺伝子発現解析における対立遺伝子特異的プライマーを用いて、一方が1アレル欠失を有するクローンを分析することができます。 3）1アレルの欠失をスクリーニングするためのプライマーの4セットを使用すると、混乱の一部または大きな欠失を含むクローンの排除を可能にします下流分析。
対立遺伝子特異的なプライマーの設計は、ジェノタイピングモノ/二対立遺伝子CRISPR欠失およびアレル特異的に遺伝子発現に及ぼす影響を分析するために重要です。使用F1細胞は、2つの対立遺伝子の識別を可能にする、より頻繁なSNPを含むときに、より容易に達成されます。ここでは129のx ハツカネズミのcastaneusクロスが使用されているハツカネズミから生成されたES細胞;しかしながら、他の細胞は、2つの対立遺伝子間のSNPは、対立遺伝子特異的欠失スクリーニングおよび発現分析を可能にする場合に使用することができ、十分なデータがアクティブなエンハンサー領域を予測するために存在する場合、選択された細胞型において標的とされます。したがって、この方法は、対立遺伝子のSNPについての情報が利用可能な任意の細胞系に適合させることができます。プロトコルの制限の1つは、特定の位置でのSNPに依存しています。いくつかの標的領域は<800 bpのFを増幅対立遺伝子特異的外側プライマーを設計になり、より少ないSNPを運びます挑戦ragment。このような場合にはPCR法は、より大きなアンプリコンを可能にするのqPCRスクリーニングの代替として使用することができます。またF1 ES細胞の表現型のSNP関連する違いがあるかもしれません。追加の遺伝子型に特異的エンハンサーの機能を確認するためにホモ接合性欠失は、標準的なES株に実施することができます。 SpCas9ヌクレアーゼの特異性は、特に臨床的アプローチの潜在的な用途を考える上で重要な問題です。 SpCas9特異性の調査はgRNA認識配列の6-12ヌクレオチドのシード領域と隣接するPAMの両方がヌクレアーゼ活性13-14,17ために重要であることを明らかにしました。オフターゲット変異はシード領域と隣接するPAMは14,16修正されるゲノム中でユニークであることを確実にすることによって最小化することができます。
対立遺伝子特異的RNA-seqのと相まって、ここで説明した1アレル欠失アプローチは決定的に特定の電子によって調節される遺伝子または遺伝子群を明らかにすることができます18 nhancer。これらの実験は、常に遺伝子発現18に影響を与えなくてもレポーターアッセイ検証エンハンサーの削除などの理解ゲノム機能のために重要です。さらに、エンハンサーは、ゲノム内の最も近い遺伝子を調節していないか、または複数の遺伝子1,20,35を調節することができます。その結果、機能喪失型分析は、エンハンサー領域の機能を決定するための最も有益なアプローチです。これは、急速にCRISPR / Cas9媒介1アレル欠失を用いて達成することができます。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突にJoveのの方針を読み、開示する競合を持っていませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Neon Transfection System 100 µL Kit | Life Technologies | MPK10096 | Microporator transfection technology |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | genomic DNA extraction reagent |
| Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| High-Speed Plasmid Mini Kit | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix for CFX | Life Technologies | 4472942 | qPCR reagent |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-rad | 170-8891 | Reverse transcription reagent |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS without Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0.5 M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1 M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fraction V (7.5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Max Efficiency DH5α competent cells | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES cell qualified | FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Non-essential aminoacid | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 83.3924 | |
| Sealing tape | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | alcohol-free cell freezing container |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inhibitor for F1 ES cell culture |
References
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