Summary
نماذج الجسم الحي السابقين الحالية من أرومة دبقية (غم) ليست الأمثل للدراسة ذات الصلة فسيولوجيا من غزو الورم البشري. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد وصيانة الثقافات شريحة عضوي النمط من الأنسجة غم الإنسان العذبة. وتقدم وصفا للمجهر الفاصل الزمني والهجرة الكمي تقنيات تحليل الهجرة.
Abstract
ورم أرومي غليوبلاستوما (غم) لا يزال يحمل التشخيص السريري للغاية سيئة على الرغم من العلاج الجراحي، العلاج الكيميائي، والعلاج الإشعاعي. غزو الورم التقدمي في حمة الدماغ المحيطة يمثل تحديا علاجيا دائم. لتطوير العلاجات المضادة للهجرة ل غم، نظم نموذج التي توفر خلفية ذات صلة فسيولوجيا للتجربة المراقبة ضرورية. هنا، نقدم بروتوكول لتوليد الثقافات شريحة من الأنسجة غم الإنسان التي تم الحصول عليها خلال استئصال الجراحي. هذه الثقافات تسمح للتجريب خارج الجسم الحي دون المرور من خلال زينوغرافتس الحيوان أو خلية واحدة الثقافات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف استخدام الوقت الفاصل بين الليزر المسح الضوئي متحد البؤر المجهري بالتزامن مع تتبع الخلية لدراسة كمية السلوك المهاجرة للخلايا السرطانية والاستجابة المرتبطة بها للعلاجات. يتم إنتاجها بشكل متكرر شرائح في غضون 90 دقيقة من اكتساب الأنسجة الجراحية. الخلايا الوريدية الفلورسنت بوساطة ريتروفيراليبيلينغ، والتصوير مبائر، والتحليل الهجرة الورم الخلية في وقت لاحق في غضون أسبوعين من الثقافة. لقد استخدمنا بنجاح هذه الثقافات شريحة للكشف عن العوامل الوراثية المرتبطة بزيادة السلوك المهاجرة في غم البشري. علاوة على ذلك، لقد تحققنا من قدرة النموذج على الكشف عن الاختلاف الخاص بالمريض في الاستجابة للعلاجات المضادة للهجرة. المضي قدما، والثقافات شريحة غم الإنسان هي منصة جذابة لتقييم السريع السابقين الجسم الحي من حساسية الورم إلى العوامل العلاجية، من أجل دفع شخصية العلاج العصبية الأورام.
Introduction
دراسة المختبر من أرومة دبقية (غم)، يعوقها عدم وجود النماذج التي تلخص بأمانة الخصائص المرضية المطلوبة من المرض البشري، وهي هجرة الخلايا السرطانية والغزو. وقد كشفت الدراسات المقارنة من 2D و 3D في المقايسات الغزو في المختبر ، فضلا عن نماذج 3D شريحة القوارض ثقافة ميكانيكيا متباينة برامج الهجرة الخلوية في هذين السياقين، مما يحتمل أن تحد من ترانزلاتاباتيليتي النتائج من النظم 2D لمرض الإنسان 1 ، 2 ، 3 . الثقافة الورم النمط العضوي شريحة ونموذج التصوير الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية السرطانية داخل شرائح من الجسم الحي السابقين الأنسجة الورم البشري التي تم الحصول عليها من استئصال الجراحي. وهكذا، شريحة الثقافات من الأنسجة الورم مقطوع جراحيا بالتزامن مع المجهر متحد البؤر الوقت توفر منصة لدراسة الهجرة الخلايا السرطانية في الأمالمكروية دون انحلال الأنسجة أو ثقافة الممرات.
هناك الأدب واسعة تستخدم القوارض الدماغ نماذج شريحة شريحة من غم ولدت من زينوغرافتس الورم البشري، والأورام التي يسببها فيروسات، وتراكب الخلوية لدراسة غزو الورم 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . في الآونة الأخيرة، وقد وصفت عدة مجموعات الجيل من الثقافات شريحة عضوي النمط مباشرة من الأنسجة غم الإنسان 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 . ومع ذلك، هناك تباين ملحوظ بين البروتوكولات المنشورة فيما يتعلق تقنية التقطيع والثقافة وسائل الإعلام. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الثقافات شريحة عضوي النمط ركزت على نقاط النهاية التجريبية الثابتة التي شملت تغييرات في سيغنالي الخليةنانوغرام، انتشار، والموت. بروتوكول الموصوفة هنا توسع على نماذج الثقافة شريحة السابقة من خلال دمج الوقت حلها من السلوكيات الخلية السرطانية الديناميكية من خلال مرور الوقت الفاصل بين الليزر المسح الضوئي متحد البؤر المجهري. الاكتشاف الأخير من 11 و إنتراتومورال 12 ، 13 الاختلاف الجيني في غم الإنسان يؤكد على أهمية ربط هذا التغاير مع سلوك الخلايا السرطانية وآثارها على الاستجابة الورم للعلاج. هنا، ونحن تقرير بروتوكول مبسط وقابلة للتكرار لاستخدام الثقافات شريحة مباشرة من أنسجة سرطان الإنسان لتصور هجرة الخلايا السرطانية في القريب في الوقت الحقيقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
قبل البدء في جمع عينات أنسجة المرضى، يجب الحصول على الموافقة المستنيرة من كل مريض بموجب بروتوكول معتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (إيرب). تلقى مؤلفو هذا البروتوكول موافقة على العمل الموصوف بموجب بروتوكولات إيرب المعتمدة في مستشفى جامعة كولورادو ومستشفى إينوفا فيرفاكس. لم يتم استخدام البيانات التي تم جمعها من هذه الثقافات شريحة لتوجيه قرارات رعاية المرضى.
1. قبل تشريح التحضير
- إعداد وسائل الإعلام "تجهيز الأنسجة" وسائل الإعلام "شريحة الثقافة صيانة" وسائل الإعلام في اليوم قبل استئصال الورم المخطط وجمع الأنسجة (أو استخدام وسائل الإعلام ولدت سابقا في غضون 2 أسابيع). إضافة 5 مل من محلول البنسلين ستربتوميسين (10000 U / مل) و 5 مل من 1 M هيبيس إلى 500 مل من دمم الجلوكوز عالية لتوليد المتوسطة تجهيز الأنسجة.
- إعداد 250 مل من شريحة وسائط صيانة الثقافة باستخدام قاعدة من الخلايا العصبية المتوسطة (على سبيل المثال ، نيوروباسال) الطرافةهوت الفينول الأحمر. تكمل هذه الوسيلة مع 10 ملي هيبيس، 1X B-27 الملحق، 400 ميكرومتر L- الجلوتامين، 600 ميكرومتر L- ألانيل- L- الجلوتامين الببتيد، 60 U / مل البنسلين، 60 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 6 U / مل النيستاتين.
- تخزين جميع وسائل الإعلام في 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع.
2. يوم الجراحة: الأنسجة اكتساب
- في يوم اكتساب الأنسجة، وإعداد 50-100 مل من 1٪ و 2٪ (بالوزن / المجلد٪) حلول منخفضة الاذاروس درجة حرارة انصهار في وسائل معالجة الأنسجة باستخدام الأواني الزجاجية تعقيمها وتقنية معقمة في غطاء تدفق الصفحي. هناك حاجة إلى تركيزات أغاروس لاستيعاب الاختلاف لا يمكن التنبؤ بها في انسجام الأنسجة الورم.
- تسخين تعليق الاغاروز، وذلك باستخدام الميكروويف، حتى يلاحظ الغليان لطيف. وضع محلول الاغاروز في حمام مائي 37 درجة مئوية للحفاظ على الحالة السائلة حتى الاستخدام.
- وضع 1 مل من شريحة وسائط صيانة الثقافة في كل بئر من لوحة 6 جيدا.
- استخدام العقيمةملقط لوضع إدراج ثقافة بتف فارغة في كل بئر. وضع لوحة في ترطيب، غارقة المياه، حاضنة زراعة الأنسجة مع 5٪ كو 2 الغلاف الجوي تحتفظ عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام ماصة باستير العقيمة في غطاء تدفق رقائقي، فقاعة خليط من 95٪ O 2 /5٪ كو 2 الغاز في قارورة تحتوي على الجليد الباردة الأنسجة معالجة الأنسجة لمدة 15 إلى 30 دقيقة تقريبا، قبل اكتساب الأنسجة الورم. يقلل استخدام وسائل الإعلام فوق الأوكسجين من نقص الأكسجة في الأنسجة السائبة أثناء المعالجة.
- إعداد وصفت 50 مل أنابيب مخروطية (ما يكفي للعدد المطلوب من المناطق الورم الفردية لتكون معزولة) التي تحتوي على 20 مل أليكوتس من فوق الأوكسجين الجليد المعالجة الباردة وسائل الإعلام لنقل الأنسجة بين غرفة العمليات ومرافق تشريح.
- بالتزامن مع جراحة الأعصاب، قبل الجراحة تخطيط منطقة الورم للحصول على عينة. حدد منطقة الورم مع تعزيز التباين كما هو مبين في تصور المريض السريريز (T1 بعد الجادولينيوم التصوير بالرنين المغناطيسي (مري) متواليات). وتقترح التجربة السابقة أن هذا المجال يعطي نسيج ورم قابل للحياة بدلا من الأنسجة الميتة.
ملاحظة: تم محاولة توليد شرائح من المحيطة (بيريتومورال) المادة البيضاء. ومع ذلك، أوتوفلورزنس الخلفية وانخفاض كثافة الخلايا السرطانية تقتصر فائدة تجريبية من هذه الشرائح. - الحصول على أنسجة الورم نحو بداية استئصال الورم. تجنب جمع الأنسجة الورم يتعرض لكثافة القطبين واسعة، والتي قد تضر بقاء الأنسجة الثانوية للإصابة الحرارية. عينات الأنسجة المكتسبة خلال استئصال الورم المجزأة تثبت بقاء معززة بالمقارنة مع الأنسجة المكتسبة من استئصال طويلة إن الكتلة . هذه الملاحظة قد تتعلق الحرمان الأنسجة الورم التفاضلية من تدفق الدم نتيجة الاستئصال الجراحي ووقت طويل للحصول على الاستحواذ.
- إذا رغبت في ذلك، تسمية وتخزين الأنسجة الورم في أنابيب مخروطية منفصلة لعزل العيناتمن مناطق الورم متميزة. ( أي سطحية مقابل الأنسجة الورم العميق). يمكن تسجيل مواقع الأنسجة الدقيقة إذا / عندما تتوفر العملية الجراحية الملاحة الجراحية.
3. شريحة إعداد الثقافة
ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب استخدام الأنسجة البشرية غير المثبتة جديدة. ويفترض أن تكون جميع العينات معدية، وينبغي التعامل معها وفقا للبروتوكولات الممرضة العالمية التي تنتقل عن طريق الدم. وينبغي تقديم معدات الوقاية الشخصية المناسبة في جميع الأوقات. الملقط والمشارط يجب أن يتعرض إلى 15 دقيقة من ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل الاستخدام. أثناء الاستخدام، رذاذ بشكل متقطع الأدوات مع الايثانول 70٪ (إتوه)، مما يسمح الوقت لتتبخر السائل قبل الاستخدام. يتم تنفيذ عملية تشريح بطريقة شبه معقمة باستخدام غطاء تدفق الصفحي الأفقي مع الهواء تصفيتها.
- مكان قطع الأنسجة الورم في طبق بتري مع الجليد تجهيز الباردة وسائل الإعلام. لغسل الأنسجة الورم وتقليل ملتصقة خلايا الدم الحمراء، لناإي ماصة لتبادل بلطف وتجاهل وسائل الإعلام في طبق بتري ثلاث مرات.
- باستخدام مشرط، وقطع قطع الورم إلى أشكال مربع مستطيلة. تقليم قطعة الأنسجة لتقريب 3 مم × 3 مم × 10 مم. إزالة بعناية أي السفن المرفقة من خلال استئصال أو الجر لطيف مع ملقط غرامة.
- ماصة 5 - 7 مل من 37 درجة مئوية الاغاروز في شكل مكعب صغير (~ 2 سم 3 ) البلاستيك تضمين العفن. تأكيد درجة الحرارة من الحل الاغاروز لا يزيد عن 37 درجة مئوية مع ميزان الحرارة العقيمة قبل الاستخدام.
- السماح الاغاروز للجلوس لمدة 1 دقيقة تقريبا على سرير من الجليد.
- مكان 2-4 الأنسجة الورم "شرائط" في الاغاروز مع محور طويل موجهة عموديا.
ملاحظة: شرائط الأنسجة تميل إلى "بالوعة" في الاغاروز قبل التصلب. لتجنب هذه المضاعفات، وعقد مؤقتا شريط الأنسجة في التوجه الرأسي حتى يتم زيادة الاغاروز. - الحفاظ على الأنسجة التي تحتوي على العفن الاغاروز على سرير من الجليد لمدة 2 - 5 ميلن لتسهيل التصلب.
- إزالة العفن من الجليد وإزالة بلطف كتلة الاغاروز عن طريق قطع جانبي النموذج مع مشرط. تجنب وضع القوة المفرطة على كتلة، والتي قد كسر الاغاروز.
- استخدام قطرة سخية من الغراء سيانوكريلات لاقامة كتلة الاغاروز إلى لوحة عينة فيبراتوم. السماح الغراء تعيين لمدة 1-2 دقائق تقريبا.
- ملء فيبراتوم الخزان مع الجليد-- تجهيز الباردة وسائل الإعلام لغمر كتلة الاغاروز الملصقة على لوحة العينة.
- خلال تشريح، فقاعة 95٪ O 2 /5٪ كو 2 خليط الغاز في خزان فيبراتوم من خلال قلص ماصة بلاستيكية معقمة.
- تعيين سمك شريحة فيبراتوم إلى 300 - 350 ميكرون.
- ضبط سرعة النصل مسبقا وسعة شفرة وفقا لاتساق الأنسجة. "أكثر صلابة" الأنسجة غم يتطلب أبطأ سرعات مسبقا بليد وارتفاع السعة. وسوف تختلف إعدادات سرعة وسرعة النصل بالضبط وفقا لمواصفات فيبراتوم.
- نقل شرائح الأنسجة إلى طبق بتري مع وسائل الإعلام الجليد المعالجة الباردة باستخدام ميكروسباتولا الفولاذ المقاوم للصدأ.
- الحصول على 6 لوحات جيدا تحتوي على إدراج بتف و موازنة معايرة ثقافة شريحة من حاضنة (كما أعدت في القسم 2، الخطوة 4).
- شرائح الأنسجة لوحة باستخدام ميكروسباتولا الفولاذ المقاوم للصدأ. تقليل الاتصال المباشر والتلاعب في الأنسجة باستخدام فرشاة خدش غرامة صغيرة لتوليد "موجة السوائل" لدفع بلطف شريحة قبالة ملعقةند على إدراج الثقافة.
ملاحظة: تقليل كمية وسائل المعالجة التي أدخلت على رأس إدراج ثقافة الأنسجة. إذا تم نقل كميات مفرطة من وسائل الإعلام مما تسبب في شرائح لتطفو، واستخدام ماصة باستير العقيمة لإزالة وسائل الإعلام. - عودة لوحات 6 جيدا تحتوي على شرائح الورم إلى حاضنة الحفاظ على 37 درجة مئوية مع 5٪ كو 2 الغلاف الجوي.
ملاحظة: يجب أن تكتمل التضمين الكامل وبروتوكول تشريح في غضون 90 دقيقة من اكتساب الأنسجة الورم من غرفة العمليات.
4. شريحة الثقافة الصيانة
- بعد 12 - 24 ساعة، ونقل الثقافات شريحة عن طريق استيعاب كل حافة إدراج مع ملقط معقم، ونقل إلى لوحات تحتوي على شريحة جديدة وسائل الإعلام ثقافة صيانة. ضمان شريحة ثقافة صيانة وسائل الإعلام أليكوتد في كل إكيليبراتس جيدا في الحاضنة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل نقل إدراج.
- نقل إدراج لوحات جديدة 6-جيدا مع شريحة معادلة جديدة كولوسائل الإعلام تور كل 48 ساعة.
- إذا رغبت في ذلك، قسامة وسائل الإعلام شريحة شريحة القديمة مع ماصة للاستخدام الفوري في المقايسات البيوكيميائية ( أي إليسا) أو تجميد في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
5. الخلايا الورم وصفها عن طريق الأخضر مضان بروتين يعبر عن فيروس ريتروفيروس
ملاحظة: الوقت الفاصل بين المجهري لتحليل الهجرة الخلية السرطانية يتطلب وضع العلامات على المدى الطويل مستقرة الفلورسنت من الخلايا داخل شريحة الثقافة. ويقترح استخدام الفيروس العكسي لأنه يصيب بشكل انتقائي تقسيم الخلايا، وبالتالي إثراء وضع العلامات الفلورسنت داخل السكان الخلايا السرطانية بدلا من الخلايا الدبقية الصغيرة أو أنواع الخلايا الأخرى الموجودة داخل شريحة. توحيد العدوى تشير إلى أن عيار الفيروسية من 10 4 كفس / ميكرولتر النتائج في الأخضر كافية التعبير البروتين الفلورسنت لتتبع وتحليل الهجرة الخلية. زيادة عيار الفيروسي، واستخدام فيروس غير انتقائي ( أي اتش، فيروس العدسة)، أو أوتفإن وسائلها لوضع العلامات على جميع الخلايا قد تحول دون تحديد حدود الخلية الواضحة أثناء الهجرة، مما يعقد التحليل. استخدام علامات الفلورسنت البديلة يمكن استخدامها والأمثل حسب الحاجة.
- الحصول على الفيروس العكسي لعدوى شرائح الورم إما عن طريق البروتوكولات القياسية 5 ، 14 أو من مصدر متاح تجاريا. تمييع طاف الفيروسية عن طريق إضافة حجم مناسب في المتوسطة العصبية غير ملائما لتحقيق عيار الفيروسية من 10 4 كفس / ميكرولتر.
- بين 7-10 أيام من الثقافة تصيب الثقافات شريحة الورم الفائدة مع 5-10 ميكرولتر من الفيروس (10 4 كفو / ميكرولتر). وضع الفيروس قطرة قطرة بلطف على سطح كل شريحة الأنسجة. تقليل حجم طاف المضافة إذا شريحة يطفو على سطح إدراج. لوحات العودة تحتوي على شريحة الثقافات إلى الحاضنة.
- تقييم شرائح للخلايا السرطانية المسمى تبدأ في 24 ساعة بعد (انظر القسم 6). وهذا التأخير الوقت تختلف اعتمادا على التأسيس الفيروسي والحركية التعبير مضان الجين. للبنيات الفيروسية المستخدمة هنا، كان مطلوبا 72 ساعة لمراقبة إشارة الفلورسنت قوية مع المجهر إبيفلورزنس القياسية.
ملاحظة: نادرا، شرائح عرض التوزيع الطرفية في الغالب من الخلايا المسمى الفيروسي، والتي يمكن أن تعقد التصوير متحد البؤر. لتجنب هذه المضاعفات، محاولة للحد من سمك شريحة وسمك الاختلاف عبر شريحة. إذا كان للثقافة شريحة منطقة سمكا بالقرب من المركز، وهذا قد يمنع اختراق المغذيات كافية، مما يحد من السكان من تقسيم الخلايا السرطانية بنشاط. وهناك فحص نوعي لفحص لهذه المضاعفات هو إضافة كاشف تيترازوليوم صبغ ( أي مت) إلى وسائل الإعلام شريحة الثقافة. المناطق من الشريحة التي لا تتحول الزرقاء بعد إضافة كاشف تشير إلى نقص النشاط الأيضي وصحة شريحة للخطر.
ملاحظة: بعد نجاح التنبيب وصحة الثقافة وأكد، يمكن تصوير الخلايا تحت ظروف السيطرة، تليها فترة متساوية من التصوير تحت ظروف العلاج. باستخدام هذا البروتوكول، تم تصوير الخلايا بنجاح وتعقب لمدة 12 ساعة في كل حالة. ومع ذلك، فإن فترات أقصر أو أطول من التصوير والتلاعب البيئي قد تكون أيضا مفيدة.
- تحميل المجهر
- قبل التصوير، ضع 1 مل من وسائل الإعلام شريحة جديدة في طبق أسفل الزجاج.
- السماح لوسائل الإعلام في طبق أسفل الزجاج لتوازن في حاضنة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: في هذه النقطة وكلاء وسم الذوبان، مثل ليكتينز مترافق فلورزنتلي ( أي إيسولكتين يب 4 لوضع العلامات الدبقية الصغيرة) أو يجند النقاط الكمومية مترافق، يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام شريحة شريحة لتحديد الخليةوالقطاعات السكانية الفرعية خلال التصوير. - نقل إدراج ليتم تصويرها إلى طبق أسفل الزجاج باستخدام ملقط معقم في غطاء تدفق الصفحي. نقل الطبق إلى مرحلة المجهر.
- الحفاظ على شريحة الثقافات في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 الغلاف الجوي في مجهر مختومة المرحلة العليا حاضنة. استخدام العقيمة H 2 O الترطيب من غرفة الحضانة إذا كانت متاحة لمنع التبخر وسائل الإعلام المفرط (أهمية خاصة للتجارب التصوير أطول).
- الاستفادة من المجهر متحد البؤر مع مسافة العمل الطويلة 10X الهدف الهواء والإثارة ليزر لفوتون واحد و / أو متعددة الفوتون.
ملاحظة: تأكد من أن عدسة الهدف المجهر يوفر مسافة العمل الكافية. ونتيجة لارتفاع المضافة من حاضنة المرحلة العليا، طبق أسفل الزجاج، وإدراج ثقافة الأنسجة، أهداف مسافة العمل الطويلة حاسمة. - تأمين لوحة أسفل الزجاج، وإزالة البلاستيك غطاء طبق بتري، وتغطي مع الغاز-غشاء نفاذية.
- الحصول على الصور
- استخدام المجهر لفحص بصريا شريحة، وتحديد موقع حقل مناسب مع كثافة كافية من الخلايا الورم فلورزنتلي المسمى بين حافة شريحة والمركز. تجنب حقول التصوير على حافة شريحة، بسبب زيادة قابلية التحولات الأنسجة أثناء التصوير. ويمكن استخدام هربس شريحة الأنسجة للحد من هذا التحول.
- استخدام برامج التصوير في وضع تحليل متعدد الأبعاد لتعيين الأول (السفلي) والأخير (أعلى) Z- كومة الحدود، بحيث أن جميع المواقف التي سيتم تصويرها تحتوي على إشارة الخلوية الفلورسنت مرئية. التصوير من خلال 150 - 200 ميكرون من شريحة، مع ثابت Z خطوة من 10 ميكرون قدمت قرارا كافيا لتتبع مسارات الخلية (وهذا يمكن تعديلها لاحتياجات التصوير الفردية).
- إذا كان المجهر لديه مرحلة الآلية، وضمان الوقت الكافي يسمح لكل اكتساب Z- كومة. تعيين الفاصل الزمني بين عمليات الاستحواذ على قدم المساواةمسح الوقت في الموقف × عدد من المواقف إلى صورة ( أي تصوير المناطق الورم).
ملاحظة: لالاثارة في وقت واحد من فلوروفوريس الأخضر والأحمر، الاستفادة من خط ثنائي خط ليزر برنامج المسح الضوئي، مع 488 نانومتر في وقت واحد و 633 نانومتر الإثارة. سوف الطول الموجي من الإثارة الليزر المختارة تختلف وفقا لبروتينات الفلورسنت الفردية أعرب. - الحفاظ على قوة الليزر موحدة وإعدادات الثقب متحد البؤر بين المناطق الورم تصويرها. الاستفادة من أدنى إعداد الطاقة الليزر اللازمة لترسيم واضح الهيئات والورم الخلايا السرطانية للحد من السمية الضوئية. وحدات المعلمة التصوير محددة ( أي السلطة وثقب البؤر إعدادات الثقب) سوف تختلف وفقا للمجهر ومواصفات مصدر الليزر.
- التعويض عن التبخر وسائل الإعلام المحتملة عن طريق إضافة 2 - 3 "العازلة" Z- كومة الخطوات في الطائرات البؤرية التقدم نحو الهدف. هذا يمنع بشكل فعال الأنسجة من ترك مجموعة من Z- كومة اكتسابأيونات في الطائرة العمودية.
7. صورة بعد المعالجة وتتبع الخلايا السرطانية
ملاحظة: تم تجهيز العديد من أنظمة التصوير متحد البؤر مع الملكية البرمجيات معالجة الصور. خطوات المعالجة التي نوقشت أدناه تشمل بروتوكول عام، والتي يمكن تنفيذها عبر منصات البرمجيات. وسوف تعطى تعليمات محددة لمنصات مفتوحة المصدر، نيه إيماجيج و متراكج 15 .
- افتح ملف Z-ستاك. في إيماجيج، انقر فوق "إيماج ← ستاكس ← Z بروجيكت". اختار أول وآخر Z- كومة لتشمل، واختار "أقصى كثافة" كنوع الإسقاط. والنتيجة هي تقديم يسمى إسقاط أقصى كثافة (ميب). إنشاء ميب من كل مجموعة من Z- كومة الصور التي تم التقاطها في كل منطقة تصويرها.
- تسلسل ميبس من كل منطقة لإنشاء سلسلة زمنية. انقر على "إيماج ← ستاكس ← إيماجيس تو ستاك."
- تحديد الموقع يدويامن الجسم الخلية "سينترويد" عن طريق اختيار نقطة مركز تقريب بصريا من الجسم خلية الورم. ويتم ذلك عن طريق النقر على الجسم الخلية باستخدام وظيفة "إضافة" المسار من متراجي (المصدر المفتوح المساعد في ل نيه إيماجيج).
- انقر لترسيم موقع جسم الخلية في كل إطار من سلسلة الصور. هذا يخلق فريدة من نوعها "المسار" لكل خلية. بالتتابع، ضع علامة على مواقع جسم الخلية للخلية التالية. كرر هذه العملية حتى يتم تتبع جميع مسارات ترحيل الخلايا.
- مرة واحدة يتم تعقب عدد من الخلايا في منطقة صغيرة ورم معين، تصدير كل إحداثيات مسار الخلية باستخدام وظيفة "قياس" متراكج. حفظ الملف بتنسيق زلس بحيث يمكن تحليل البيانات الخام باستخدام جداول البيانات أو البرامج التي ينشئها المستخدمون.
- استخدم الإحداثيات المسجلة لكل نقطة على طول مسار ترحيل الخلية، لإجراء تحليلات كمية بما في ذلك اشتقاق سرعة الترحيل والاتجاهية وغير ذلك من عمليات الترحيلالمقاييس، كما هو موضح في باركر وآخرون 16 .
ملاحظة: جميع المسافات المحسوبة والسرعات هي أقل من تقديرات القيم الفعلية. هذا هو المتأصل في تحويل الصور ثلاثية الأبعاد (ومسارات الهجرة) إلى البيانات ثنائية الأبعاد من خلال توليد التوقعات أقصى كثافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجموعتنا قد ولدت بنجاح الثقافات شريحة من أكثر من 50 مريضا تمر استئصال غم الأولي. وقد تم تبسيط هذا الجيل شريحة، والثقافة، وروتوفيرال وضع العلامات، والتصوير، وبروتوكول تحليل الهجرة في سير العمل استنساخه ( الشكل 1 ). الأهم من ذلك، هذه شرائح غم عضوي النمط تثبت التوافق مع الأنسجة الورم الناشئة في جميع أنحاء الثقافة، بما في ذلك الحفاظ على السمات المرضية والدبقية الصغيرة تصل إلى 15 يوما في الثقافة ( الشكل 2 ). وبالإضافة إلى ذلك، لقد استخدمنا هذا النظام لأداء فحوصات وظيفية من استجابة الورم إلى التغيرات ميكروفيروننتال. كمقياس من النزاهة الفسيولوجية، درسنا كيف استجابت الثقافات شريحة غم لنقص الأكسجة (1٪ O 2 ) عن طريق قياس إنتاج عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (فيغف)، وهي العملية التي تحدث بوفرة داخل المكروية غم في الجسم الحي 17 ،"> 18. أثبتنا أنه من خلال وضع الثقافات شريحة في ظروف نقص الأكسجين، وشرائح شنت استجابة فسيولوجية سريعة، مما أدى الافراج فيغف في وسائل الإعلام ( الشكل 3 ).
لتقييم الجوانب النوعية والكمية للهجرة الخلايا السرطانية استخدمنا الصور الفاصل الزمني لتوليد خرائط الهجرة مفصلة. هذه الخرائط ترسم حدود جميع الخلايا غم تعقب داخل حدود ميكروسوريجيونس الورم (1 ملم 2 )، وتوفير التصور ثابت للسلوك الهجرة المهاجرة من السكان الورم. تم حساب المقاييس الكمية لسرعة الهجرة والاتجاهية (تشريد الخلية / المسافة الإجمالية المقطوعة) لكل خلية، مما يسمح بالتحقيق في التغيرات في بارامترات الهجرة عبر مناطق الورم، وعينات الورم، واستجابة للعلاج ( الشكل 4 ).
وضع العلامات الخلية وبروتوكول التصوير ديسكريبد هنا يوفر أيضا قرار المكاني والزماني كافية لتقييم التغيرات في مورفولوجيا الخلية أثناء الهجرة من خلال المكروية الورم الأصلي. لاحظنا وجود خلايا ورم متحرك متميزة شكليا و ميكروغليال اختلطت داخل ثقافة شريحة ( الشكل 5A ). وقد تميزت حركة الخلايا السرطانية بعملية "البحث والانفجار"، والتي تنطوي على نتوء المتكررة والتراجع من فيلوبوديا من خلية ثابتة، تليها فترة قصيرة من حركة فعالة. قدمت مناطق شريحة التصوير تقريبا كل 10 دقيقة أيضا القرار الزمني المناسب لتسجيل الصور الفاصلة بين الخلايا السرطانية التي تمر انقسام الخلايا. توقفت هذه الخلايا الفاصلة من الهجرة، والانقسام الانتهاء، وخلايا ابنة إعادة بدء الهجرة دون تأخير، كل ذلك في إطار زمني 3-ساعة ( الشكل 5D ). في المقابل، تهاجر الخلايا الدبقية الصغيرة بسرعة أعلى وأكثر اتساقا، مع اتجاه أقل من الخلايا السرطانية المجاورة،مما يدل على هجرة غير فعالة نسبيا ( الشكل 5C، 5E-G ). قد تكون هذه الملاحظات مهمة للحصول على نظرة ثاقبة في البيولوجيا الكامنة وراء استجابات المريض أو خلية محددة للعلاج.
وأخيرا، استخدمنا هذا البروتوكول لإظهار تقلب المريض إلى المريض في المعلمات الهجرة الخلية على مستوى السكان، بما في ذلك وجود ارتباط من مستقبلات عامل نمو البشرة ( إغفر ) التضخيم الجيني مع زيادة إمكانات الهجرة من الخلايا السرطانية 16 . وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الفاصل الزمني الفاصل بين شرائح الورم قبل وبعد العلاج مع المخدرات المضادة للغزو، جيفيتينيب انخفاض كبير في الهجرة، والتي كانت محددة ل إغفر تضخيم الورم شرائح 16 .
شكل 1: رونغ> غم الإنسان أورغانوتيبيك شريحة الثقافة العدوى، والتصوير، وتحليل خلية الهجرة سير العمل. يتم ترجمة الأنسجة الورمية إلى منطقة معينة عن طريق معدات الملاحة أثناء العملية. بعد أسبوع واحد التقطيع، و زغرين معربا عن الفيروس العكسي يضاف إلى الثقافات شريحة لتسمية الخلايا السرطانية النشطة ميتوتيكالي. 3 أيام بعد العدوى، يتم إعداد شرائح للتصوير مبائر. يتم تصوير بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد في صور ثنائية الأبعاد لتتبع مسار ترحيل الخلايا، وتوليد خرائط هجرة الخلايا السرطانية، وحساب معلمات هجرة الخلايا السرطانية. وقد نشرت أجزاء من هذا الرقم في الأصل في باركر وآخرون ، 2013 16 واستنسخت بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
"1"> 
الشكل 2. الإنسان غم عضوي النمط شرائح الحفاظ على الخصائص النسيجية طوال السابقين فيفو الثقافة. ( A ) T1 النقيض تم تعزيز تسلسل التصوير بالرنين المغناطيسي لتوطين وتوثيق المنطقة (المناطق) من اكتساب الأنسجة (السهم). ( B ) H & E تلطيخ من الأنسجة المانحة الأولية (أور) والشرائح في يوم 8 من الثقافة من ثقافة شريحة ولدت من الأنسجة التي تم الحصول عليها من المنطقة سلط الضوء عليها في A. ( C ) يتم الحفاظ على الخصائص الميكروية والبيئية الخلوية غم، في الجسم الحي ، في جميع أنحاء شريحة الثقافة. (I، إي) المناعية ل CD68، دبقية صغيرة / علامة بلعم، في انخفاض (أعلى) وارتفاع (أسفل) التكبير، يدل على استمرار الدبقية في شرائح بعد 15 يوما من الثقافة. H & E تلطيخ في يوم 4 من ثقافة شريحة يؤكد الحفاظ على نخر بسيودوباليسادينغ، باثوالسمة المميزة المنطقية من غم، على حد سواء منخفضة (الثالث) وارتفاع (4) التكبير. مقياس الحانات = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الثقافات شريحة غم الإنسان تفرز فيغف في الاستجابة لنقص الأكسجين. ( A ) استخدمت التجربة إدراج الثقافة الفردية التي تحتوي على 3 شرائح حجم الورم مماثلة ولدت من نفس منطقة الورم. تم الحفاظ على شرائح في نورموكسيا لمدة 12 ساعة، تليها اثنين من 12 ساعة فترات من نقص الأكسجة، مع إضافة وسائل الإعلام الجديدة قبل كل فاصل زمني. ( B ) إفراز فيغف في وسائل الإعلام التي تقاس إليسا (يعني ± الانحراف المعياري) من الثقافات شريحة ولدت من اثنين من الأورام التمثيلية، وزيادة كبيرة في الأمم المتحدةدير نقص الأكسجين من نورموكسيا (p <0.05). ( C ) تحليل تجميعي للثقافات شريحة من 4 أورام مختلفة أظهرت زيادة إفراز فيغف بعد فترات متتابعة 12 ساعة من نقص الأكسجة مقارنة نورموكسيا (ع <0.05). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مسار الخلايا السرطانية المسار المسار يسمح تحديد الكمي لسرعة الخلية والاتجاهية. ( A ) الخلايا السرطانية مع اتجاه 1 تمثل كفاءة مثالية على طول متجه مستقيم، في حين أن تلك ذات الاتجاه أقل تشارك في مسارات التعرج غير فعالة، كما هو موضح في هذا التخطيطي 16 . أعيد طبعها بإذن من جامعة أكسفوردصحافة. ( B ) تحليل بيانات مسار مسار تمثيلية ("منخفضة" القرار ~ 55 دقيقة فترات تتبع الخلية) يدل على التباين الخلوي في السرعة والاتجاه. ( C ) يتم رسم اتجاهية مقابل سرعة الهجرة لكل مسار الخلية لتصور سلوك الهجرة عبر السكان الخلية (كل نقطة تمثل خلية فردية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الخلايا الدبقية الصغيرة داخل الثقافات شريحة غم تتميز سرعة الهجرة العالية والاتجاه المنخفض نسبة إلى الخلايا السرطانية. ( A ) تكرار الخلايا السرطانية تعبير انتقائي عن الفيروس الفيروسي زغرين والدبقية الصغيرة الموسومة مع إيسولكتين-I B 4 -647 مترافق موجودة في منطقة الورم الصغرى ممثل من ثقافة شريحة تمثيلية. ( بك ) مسارات غم تعقب بشكل فردي ( B ) والخلايا الدبقية الصغيرة ( C ) في نفس المنطقة الصغرى الورم تظهر سلوكيات الهجرة المتناقضة. مقياس الحانات = 200 ميكرون. ( D ) توقف الخلية السرطانية المهاجرة بشكل فعال، وتراجع عملياتها (رأس السهم)، وتخضع انقسام الخلايا، واثنين من خلايا ابنة تهاجر بعيدا في اتجاهات معارضة (الأسهم). مقياس الحانات = 50 ميكرون. ( E و F ) تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة زيادة سرعة الهجرة (P <0.0001) وانخفاض الاتجاه (p <0.0001) بالمقارنة مع الخلايا السرطانية في نفس المنطقة. (G) توزيع الورم والخلايا الدبقية الصغيرة على أساس السرعة والاتجاهية يدل على المظاهر المهاجرة فريدة من السكان الخلية اثنين.إت = "_ بلانك"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر الثقافات شريحة عضوي النمط من الأنسجة سرطان الإنسان منصة جذابة وغير مستغلة للتجريب ما قبل السريرية متعدية. فهم السلوكيات على مستوى السكان من الخلايا السرطانية فيما يتعلق بالهجرة، والانتشار، والموت الخلية في المكروية الورم الأصلي غير موجودة. من الأهمية بمكان، دراسة استجابة الورم للعلاج في ديناميكية، والأزياء حل الوقت على مستوى سلوك الخلية قد تسلط الضوء على آليات جديدة لمقاومة العلاج. الإنسان الورم شريحة الثقافات توفر صلة بين عملية المرض البشري والجسم الحي الحالي وفي الجسم الحي تقنيات النمذجة 19 . قمنا مؤخرا التحقق من صحة تقنية وصفها هنا كوسيلة لدراسة الهجرة غم، والإبلاغ للمرة الأولى الاختلافات بين ورم قابلة للقياس في سلوك الهجرة الخلية المتعلقة تضخيم إغفر والتشوير 16 . واستخدمت هذه الدراسة أيضا نموذج الثقافة شريحة لاختبار باتيفعالية محددة من مثبط إغفر، جيفيتينيب، كعلاج مضاد للغزو المحتملة ل غم 16 .
وقد نوقشت أعلاه العديد من المزالق المشتركة أثناء تشريح الأنسجة، والعدوى الفيروسية، والتصوير، ونموذج تحليل الصورة أعلاه. ومع ذلك، فإن بروتوكول عدوى الفيروس العكسي يولي مزيدا من الاهتمام. ونظرا للاختلاف المريض إلى المريض، قد يكون من الصعب على معايرة كثافة الخلايا السرطانية المسمى الفيروسي داخل كل شريحة. إذا وصفت أعداد كافية من الخلايا عن طريق بناء الفيروسية، إضافة قسائم 5-10 ميكرولتر إضافية من طاف فيروسات الرجعية إلى سطح كل شريحة يوميا حتى يتم تحقيق تركيز المطلوب من الخلايا السرطانية المسمى. في الثقافات شريحة الأولية، ونسبة الخلايا المتماثلة عموما أقل مما كانت عليه في خطوط الخلايا المحولة، مما يحد من مجموعة فرعية من الخلايا تساهل لدمج فيروسات ريتروفيرال في أي وقت. بدلا من ذلك، إذا تم تسمية الكثير من الخلايا، ومنع أسكيورات ترسيم مسارات الهجرة الخلية، وتمييع طاف الفيروسية مع وسائل الإعلام العصبية لتحقيق عيار فعال أقل. الأورام الدبقية الصغيرة المرتبطة الورم أدرجت البروتين الفلورسنت معربا عن الفيروسات القهقرية على تردد ما يقرب من 1٪ من جميع الخلايا المسمى. كنا قادرين على عزل بصريا هذه الخلايا لتحليل منفصل عن طريق استخدام ليكتين الدبقية الدبقية ملزم لتحليل البيانات بعد التصوير ( الشكل 5 ).
المكروية الورم بما في ذلك جوانب تسليم المغذيات، والتفاعلات خلية الخلية، ومصفوفة خارج الخلية تلعب كل دور في التسبب في غم 20 . تقلل الثقافات شريحة الإنسان مباشرة غم الحاجة إلى المرور داخل نماذج حيوانية صغيرة أو ثقافة الخلايا نشرها، مع توفير تلخيص وثيق للمكروية الورم البشري. وعلاوة على ذلك، توفر الثقافات شريحة وصول موحد إلى العناصر الغذائية عبر العينات، مع الحفاظ على الخلايا الخلوية والتفاعلات خلية-إسم. عن طريق الحد فارفي مجال الوصول الخلوي إلى المغذيات التي من المعروف أن تحدث داخل الأورام، نقترح الاختلافات الملحوظة في الثقافات تسلط الضوء على الاختلافات الجوهرية بين سلوك الخلايا السرطانية ( أي الهجرة) على مستوى السكان. ومع ذلك، فإن تفسير البيانات التي تم جمعها عبر الثقافات شريحة المتولدة من الأورام البشرية هو تعقيد من عدم التجانس المتأصل بين وداخل الورم. من الأهمية بمكان، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لتوصيف التحولات الجينية والتخلق الجينية المحتملة التي قد تحدث أثناء صيانة الجسم الحي خارج الثقافات شريحة الورم البشري.
استخدام الثقافات شريحة الورم البشري بالتوازي مع المرحلة الأولى / إي التجارب السريرية هي استراتيجية واعدة لربط المعلمات شريحة مع النتائج السريرية للمريض. التحقق من هذه المعلمات التنبؤية / النذير المحتملة ضروري قبل شريحة الثقافات يمكن استخدامها لتخصيص العلاج الأورام. عملنا، وكذلك عمل الآخرين، يدل على جدوى التحقق من صحة العلامات البيولوجية <سوب كلاس = "كريف"> 21، وكذلك السريع السابقين اختبار الجسم الحي من العوامل العلاجية في الثقافات شريحة من غم 9 ، 16 . تقنيات مماثلة شريحة الإنسان ثقافة باستخدام الرئة 22 والقولون 22 والرأس والرقبة 23 ، والثدي 24 ، وسرطان البروستاتا 25 الأنسجة تشير إلى هذا النهج يمكن تعميمه عبر سرطان الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور لي نيسواندر والدكتور رادا مساروا على خبرتهم الفنية والمساهمات في بروتوكول شريحة بروتوكول التصوير مبائر وصفها هنا. مزيد من الشكر للدكتور كالين ديون الذي قدم الخبرة فيما يتعلق بتحسين معلمات تشريح الأنسجة الورم في الدماغ وثقافتها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
- Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
- Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
- Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
- Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
- Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
- Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
- Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
- Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
- Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
- Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
- Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
- Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
- Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
